Role of membrane H+ transport and plasmalemma excitability in pattern formation, long-distance transport and photosynthesis of Characean algae

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В 2024 г. исполняется 40 лет журналу «Биологические мембраны». В тематике журнала заметное место занимают мембраны растительной клетки и хлоропластов. В его выпусках нашли освещение такие темы, как влияние электрического потенциала тилакоидов на флуоресценцию хлорофилла [1], повреждение хлоропластов электрическим полем [2], светозависимый мембранный транспорт редокс-активных катионов [3], фототоки тилакоидных мембран [4], триггерное проникновение в клетки катионного прооксиданта [5], влияние возбудимости и течения цитоплазмы на транспорт Н⁺ и фотосинтез [6, 7]. Водоросли Chara, близкие родственники высших растений, представляют удобный и интересный объект для изучения путей внутриклеточной регуляции.

Клетки междоузлий харовых водорослей достигают длины ≥10 см и сочетают такие неординарные свойства, как возбудимость, возникновение пространственных структур, быстрое ротационное течение цитоплазмы, а также изменения проводимости клеточной мембраны при гиперполяризации. Возбудимость проявляется в короткой (2–5 с) деполяризации плазмалеммы в ответ на механические, химические и другие стимулы. На практике потенциал действия (ПД) вызывают пропусканием деполяризующего импульса тока (200 мс, 10 мкА/см²). Скорость распространения ПД составляет ~1 см/с, что обеспечивает наиболее быструю передачу сигналов в гигантских клетках Characeae.

В большинстве растительных клеток с размерами до 100 мкм смешивание реагентов и сигнальные взаимодействия происходят за счет диффузии. Однако диффузионный транспорт крайне неэффективен на больших расстояниях. В случае одномерной диффузии среднеквадратичное смещение молекул (х) от начальной координаты связано со временем переноса t соотношением x² = 2Dt, где D – коэффициент диффузии. Это означает, что диффузия низкомолекулярных веществ (D ≈ 10^–5 см²/с) на расстояние 5 см в пределах клетки потребует около двух недель. Электрическое возбуждение преодолеет такое же расстояние всего за 5 с, вызывая экстренную реакцию на стрессовое воздействие.

У харовых водорослей в покое основную роль в интеграции метаболизма и дальней сигнализации играет круговое течение цитоплазмы (циклоз) со скоростью до 100 мкм/с при 25^оC [8, 9]. Поток цитоплазмы проходит внутриклеточное расстояние длиной в 5 см за время ~10 мин, что вероятно достаточно для своевременной реакции клетки на медленно меняющееся окружение. Течение омывает слой плотно упакованных хлоропластов (Хп) с его внутренней стороны, где к хлоропластам крепятся актиновые филаменты [10, 11]. По этим тяжам за счет гидролиза ATP движутся молекулы миозина, нагруженные везикулами. Движение органелл вместе с примыкающими слоями воды создает поток, который облегчает обмен метаболитов между Хп и цитозолем. Скорость течения максимальна в месте приложения движущей силы, т. е. на границе с неподвижными хлоропластами, и снижается в направлении к оси клетки.

Активное течение цитоплазмы является необходимым условием возникновения пространственных структур. Находясь на свету, клетки междоузлий формируют на поверхности чередующиеся зоны с низкими и высокими значениями рН (~6.5 и 10) [12, 13]. Эти лабильные структуры связаны с протеканием круговых электрических токов. Роль генератора тока выполняет ATP-зависимый Н⁺-насос плазмалеммы, локализованный в кислых зонах, а нагрузкой служат участки мембраны в щелочных зонах, обладающие высокой пассивной проводимостью для Н⁺ или их эквивалентов – анионов ОН^– [14]. Плотность круговых токов в области щелочных зон достигает 60 мкА/см²; в кислых зонах она заметно меньше, что связано с большей площадью этих зон [12]. Отток протонов из среды вызывает щелочной сдвиг рН на поверхности клетки (рН_о); при этом поступление Н⁺ в клетку смещает рН цитоплазмы (рН_ц) в кислую сторону [15, 16]. Аналогично этому, выведение Н⁺ из цитоплазмы создает кислые зоны в прилегающих слоях наружной среды (в апопласте), но сдвигает рН_ц в сторону щелочных значений. Чередующиеся сдвиги рН на поверхности клетки и в цитоплазме лежат в основе неоднородного распределения активности фотосинтеза по длине клетки.

Неравномерное распределение рН и фотосинтеза, а также возбудимость и течение цитоплазмы тесно связаны между собой и оказывают существенное влияние на другие клеточные процессы, включая дальний транспорт, защиту от избыточного освещения и ответные реакции на механические повреждения. В данном обзоре на примере клеток харовых водорослей рассмотрено сопряженное влияние электрических, ионных и метаболических сигналов на неравномерное распределение рН и фотосинтеза в клетках зеленых растений и предложена рабочая гипотеза для объяснения этих связей.

ЗОНАЛЬНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ рН_о И ЕГО ОБРАТИМОЕ СГЛАЖИВАНИЕ ПОСЛЕ ВОЗБУЖДЕНИЯ КЛЕТКИ

Профили рН, измеряемые сканирующим рН-микроэлектродом на освещенном междоузлии длиной 50 мм (рис. 1а, кривые 1, 4), содержат до шести щелочных полос со значениями рН_о около 10.0, которые чередуются с кислыми зонами (рН_о 6.2–6.5). В молодых междоузлиях зоны с низкими и высокими рН_о не имеют видимых отличий. Однако зрелые и стареющие клетки часто выглядят полосатыми. В этих клетках зеленые некальцинированные области чередуются с зонами осаждения кристаллов, главным образом СаСО₃, которые придают щелочным зонам белесую окраску. Неоднородный профиль рН_о формируется только на свету, исчезает за время ~20 мин после переноса клеток в темноту, а также спрямляется на свету при подавлении фотосинтеза диуроном. Брефелдин А (БФА) – ингибитор внутриклеточного везикулярного транспорта – оказывает сильное подавляющее действие на щелочные зоны освещенных клеток [17]: величина рН_о снижается от 9.5–10.0 на 2–2.5 ед. в течение 10 мин после добавления этого агента (рис. 1б). На нынешний день БФА является наиболее сильным известным ингибитором, действие которого не связано с подавлением фотосинтетического потока электронов. По-видимому, процессы эндо- и экзоцитоза, подавляемые брефелдином А, необходимы для поддержания транспортных систем, участвующих в трансмембранном переносе протонов. Кроме того, неоднородный профиль рН временно исчезает после генерации одиночного электрического импульса на плазмалемме [18] (рис. 1а, кривые 1–3).

 

Рис. 1. Светозависимый профиль рН в примембранных слоях среды (рН_о) по длине интернодальной клетки Chara и чувствительность наружных щелочных зон к возбуждению плазмалеммы и ингибитору внутриклеточного везикулярного транспорта брефелдину А. а – Профили рН_о в покое (сплошная кривая 1), а также через 2, 9 и 45 мин после генерации ПД (кривые 2–4 соответственно). б – Снижение рН_о в щелочной зоне освещенной клетки после замены искусственной прудовой воды на аналогичный раствор с добавлением 70 мкМ брефелдина А (BFA); интенсивность света – 25 мкмоль/(м² с).

 

Потенциал действия (ПД) в клетках харовых водорослей и других зеленых растений был предметом многочисленных работ и обзоров [11, 19–22]. Более 40 лет назад методом фиксации напряжения на клетках междоузлий Nitellopsis было показано, что деполяризация мембраны на фронте ПД обусловлена поступлением Са²⁺ по потенциал-зависимым неселективным катионным каналам из среды в цитоплазму, которое может дополняться потоком Са²⁺ из вакуоли в цитоплазму [23]. Установлено также, что повышение уровня Са²⁺ в цитоплазме ([Са²⁺]_ц) активирует выход Cl^– из цитоплазмы в среду, что отвечает за пиковую деполяризацию плазмалеммы. Возвращение мембранного потенциала к исходному или более низкому значению связано с выходящим потоком К⁺ по каналам, активируемым при деполяризации.

В литературе нередко выдвигали предположения, что изменения уровня [Са²⁺]_ц вызваны не поступлением Са²⁺ из среды, а высвобождением Са²⁺ из внутриклеточных депо под влиянием инозитол-3-фосфат-чувствительной системы [24, 25]. Однако многие авторы отстаивали точку зрения, что повышение [Са²⁺]_ц обусловлено входящим потоком Са²⁺ по каналам плазмалеммы [26, 27]. К тому же анализ нуклеотидных последовательностей в геномах растений не выявил присутствия рецепторов инозитол-3-фосфата (цит. по [11]). Вместе с тем недавно показана возможность высвобождения Са²⁺ из эндоплазматического ретикулума в устьицах Arabidopsis под влиянием потока Н⁺ из среды в цитоплазму по экспрессированным фоточувствительным Н⁺-селективным каналам [28]. Помимо Са²⁺, Cl^– и K⁺, небольшой вклад в ионные токи, измеряемые в режиме фиксации напряжения, могут вносить токи, создаваемые транспортом Н⁺ в освещенных клетках Chara в покое. Токи Н⁺ (30–60 мкА/см²) имеют значительно меньшую величину, чем пиковые значения Cl^– тока (до 1 мА/см²) [27].

Возбуждение клетки вызывает временную остановку трансмембранных встречных потоков Н⁺, что проявляется в противоположно направленных сдвигах рН у поверхности клетки в щелочных и кислых зонах [18, 29]. Хотя сдвиги рН_о в разных зонах имеют разную направленность, они синхронно достигают экстремальных значений и согласованно восстанавливаются по завершении переходного периода. После генерации ПД величина рН в щелочных зонах снижается почти на 3 ед., а в кислых зонах возрастает на 0.2–0.4 ед. Неравномерный профиль рН_о сглаживается в течение 5–10 мин после генерации ПД (рис. 1).

Щелочные пики восстанавливаются в течение 35–40 мин от момента ПД, причем их исходное положение сохраняется. Устойчивое положение щелочных полос объясняют тем, что выравнивание профиля рН происходит на фоне неравномерного распределения других параметров, таких как отложения кристаллов кальция на поверхности клетки в участках с высоким рН [30] или преимущественная локализация в кислых зонах органелл харасом, которые представляют собой инвагинации плазмалеммы, обогащенные Н⁺-ATP-азой [31]. Растворение кристаллов СаСО₃ после сглаживания щелочных зон сопровождается локальным повышением рН, т. е. способствует формированию новой щелочной зоны на прежнем месте. Распределение Н⁺-насосов, определяемое стабильной локализацией харасом, также не претерпевает изменений после генерации ПД. Активность этих насосов, вероятно, восстанавливается по мере снижения уровня [Са²⁺]_ц в период перехода к покою после генерации ПД.

Особенно неожиданным оказался тот факт, что распределение характеристик фотосинтеза – квантового выхода переноса электронов YII и нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла NPQ – в отличие от профиля рН, не сглаживается, а становится более неоднородным после генерации ПД [29]. Эта особенность выглядит на первый взгляд удивительной, потому что в покое профили YII и NPQ строго согласованы с профилем рН. Причины согласования профилей рН и фотосинтеза в покое и нарушения такой координации после генерации ПД рассмотрены ниже, после обсуждения влияния ПД на Н⁺-транспортирующие системы плазмалеммы.

Подавляющее влияние [Са²⁺]_ц на Н⁺-насос плазмалеммы известно уже давно. Оно предположительно опосредовано Са²⁺-зависимым фосфорилированием Н⁺-ATP-азы [32, 33]. Ионы Са²⁺ связываются с 14–3–3-белками, нарушая их физиологическое взаимодействие с Н⁺-ATP-азой, необходимое для активации Н⁺-насоса [34]. Однако влияние ПД на рН у поверхности клетки Chara не сводится только к Са²⁺-зависимому подавлению Н⁺-насоса плазмалеммы, о чем говорят результаты параллельных измерений сопротивления плазмалеммы (R_m), мембранного потенциала клетки и рН в апопласте. В участках с наружными кислыми зонами следовые изменения R_m после возбуждения были незначительными, а в щелочных участках изменения R_m оказались неожиданно большими. В состоянии покоя проводимость плазмалеммы G_m (G_m = R_m^-1) в области щелочных зон была высокой и составляла около 10 См/м², что соответствует ранее опубликованным данным [35]. На пике ПД проводимость мембраны дополнительно возрастала в несколько раз в связи с активацией хлорных и калиевых каналов.

Однако после пика ПД проводимость плазмалеммы в щелочных зонах резко снижалась: в течение 30–60 с величина G_m уменьшалась почти на порядок по сравнению с исходными значениями в покое [36]. Параллельно с падением G_m происходило снижение рН_о, отражающее остановку входящего потока Н⁺-эквивалентов, и развивалась переходная гиперполяризация мембраны на 50–60 мВ [37]. Это свидетельствует об инактивации Н⁺-проводимости плазмалеммы в щелочных зонах после развития ПД. Мембрана этих участков временно теряет высокую Н⁺-проводимость, но сохраняет K⁺-проводимость, что сдвигает мембранный потенциал от значений, близких к равновесному Н⁺-потенциалу (E_H), в сторону E_K. Исходные значения проводимости восстанавливаются за время ≥15 мин после однократной генерации ПД. Этот период, по-видимому, необходим для восстановления низкого уровня [Са²⁺]_ц после его возрастания на пике ПД. Примерно такой же период после возбуждения (~10 мин при 21^оC) необходим для полного восстановления течения цитоплазмы [38], которое, как известно, крайне чувствительно к [Са²⁺]_ц. Повышение светового потока в интервале 10–150 мкмоль квантов/(м² с) способствовало более быстрому восстановлению щелочных зон, что, предположительно, обусловлено ускоренным снижением [Са²⁺]_ц на ярком свету в связи с поглощением Са²⁺ освещенными хлоропластами [39].

ПРОФИЛИ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ В ПОКОЕ И ПРИ ВОЗБУЖДЕНИИ

О скорости линейного фотосинтетического потока электронов на микроучастках интернодальной клетки можно судить по величине эффективного квантового выхода реакции фотосистемы II (YII). Флуориметры с импульсно-модулированным освещением позволяют рассчитать величину YII по формуле $YII=(F_m\text{'}-F\text{'})/F_m\text{'}$, где F ′– выход флуоресценции хлорофилла на действующем свету без дополнительной подсветки, а F_m′ – максимальный выход флуоресценции в тех же условиях при действии насыщающего светового импульса. В стационарном состоянии фотосистемы I и II (ФСI и ФСII) работают согласованно. Поэтому величина YII отражает эффективность линейного потока электронов по всей ЭТЦ, в которой последовательно участвуют ФСII и ФСI. Метод насыщающих вспышек дает также сведения о нефотохимическом тушении ($NPQ=(F_m-F_m\text{'})/F_m\text{'}$), показателем которого является максимальный выход флуоресценции F_m′ на действующем свету в сравнении с максимальным выходом F_m в отсутствие тушения. Чем ниже F_m′ по сравнению с F_m, тем выше значения NPQ.

У освещенных клеток в состоянии покоя профили рН_о, квантовой эффективности ФСII (YII) и NPQ по длине клетки четко скоординированы. В основе координации лежит разная проницаемость плазмалеммы для заряженных и незаряженных форм неорганического углерода (С_i), количество которых варьирует по длине клетки в соответствии с профилем рН_о [29, 40]. Относительное содержание анионов (НСО₃^–, СО₃^2–) и нейтральной формы (СО₂) зависит от локальных значений рН_о и констант диссоциации (pK) углекислоты и бикарбоната (pK₁ = 6.3 и pK₂ =10.3). Проницаемость бислойных липидных мембран для нейтральных молекул СО₂ в 10⁷–10⁸ раз выше, чем для аниона НСО₃^– [41]. В кислых зонах значительная часть С_i присутствует в виде СО₂ – нейтральной свободно проникающей через мембраны формы, что обеспечивает хлоропласты достаточным количеством этого субстрата фотосинтеза. Наружные щелочные зоны лишены СО₂ и содержат лишь непроникающие ионные формы С_i (НСО₃^–, СО₃^2–). Поэтому СО₂-зависимый путь переноса электронов облегчен в Хп, лежащих под наружными кислыми зонами, и затруднен в Хп щелочных зон. Лимитированное поступление С_i из наружной среды в области щелочных зон частично компенсируется доставкой этого субстрата с потоком цитоплазмы из участков, где содержание C_i повышено вследствие достаточного притока СО₂.

Не меньшую роль в координации профилей рН и фотосинтетического транспорта электронов играют различия рН цитоплазмы в зонах притока Н⁺ в клетку и в зонах активного выведения Н⁺. Поток Н⁺-эквивалентов внутрь клетки в области щелочных зон понижает рН цитоплазмы, а выведение Н⁺ в области кислых зон повышает рН_ц [15, 42]. Из-за нехватки СО₂ в щелочных зонах и вследствие пониженного рН_ц перенос электронов в этих участках частично переключается с СО₂-зависимого пути на восстановление О₂. Оптимум рН для фотовосстановления О₂ интактными изолированными хлоропластами лежит в кислой области (рН 5.0) [43]. Кислые значения рН облегчают протонирование супероксид-анион-радикала и способствуют восстановлению О₂^–• до Н₂О₂. В свою очередь, Н₂О₂ выступает как акцептор в реакции Хилла [44]. Так как поток электронов на Н₂О₂ не связан с потреблением ATP, он повышает энергизацию тилакоидных мембран (градиент Δμ_Н⁺) и усиливает нефотохимическое тушение (NPQ) флуоресценции хлорофилла. Возрастание тепловых потерь снижает эффективность фотохимической реакции (параметр YII), что соответствует замедлению линейного потока электронов. При той же освещенности уровень энергизации мембран в Хп, где преобладает ассимиляция СО₂, остается сравнительно низким, а величина NPQ – незначительной. Таким образом, в пределах одной и той же интернодальной клетки Хп проявляют не только разные значения YII, но и качественные различия в путях переноса электронов. Это находит подтверждение в зеркально симметричных продольных профилях рН и концентрации О₂ у поверхности клетки [40]. Концентрация О₂ в щелочных зонах заметно понижена, что вероятно обусловлено фотовосстановлением О₂ в этих зонах.

В отличие от профиля pH, который сглаживается после проведения ПД (рис. 1а), продольный профиль фотосинтеза становится более контрастным (рис. 2). Это проявляется в возрастании перепадов эффективного квантового выхода ФСII (YII) и уровней NPQ между различными участками по длине клетки [29]. На рис. 2 показан профиль NPQ, который при низкой интенсивности освещения был практически спрямлен у клетки в состоянии покоя. После генерации ПД в момент времени t = 0 величина NPQ в области щелочных зон возросла до значений 0.9–1.5 ед., тогда как в области кислых зон значения NPQ остались низкими (~0.05). Соответствующие изменения претерпевал и продольный профиль YII. После генерации ПД эффективный квантовый выход фотореакции ФСII снижался в зонах возрастания NPQ, но менялся незначительно в зонах с низкими значениями NPQ. Усиление пространственной неоднородности фотосинтетического потока электронов после возбуждения клетки обусловлено двумя факторами: влиянием повышения [Ca²⁺]_ц на пути фотосинтетического переноса электронов и влиянием [Ca²⁺]_ц на скорость течения цитоплазмы.

 

Рис. 2. Формирование неоднородного продольного профиля нефотохимического тушения (NPQ) в хлоропластах интернодальной клетки Chara после однократного возбуждения плазматической мембраны. В покое (при t ≤ 0) профиль NPQ был однородным, но после генерации ПД он сменился профилем с множественными пиками NPQ. Момент генерации ПД при t = 0 отмечен на диаграмме штриховой линией.

 

Повышение [Ca²⁺]_ц, происходящее во время ПД, тормозит ассимиляцию CO₂ в реакциях цикла Кальвина [45–47] и в то же время оказывает стимулирующее влияние на фотовосстановление O₂ [48]. Наибольшая Ca²⁺-зависимая стимуляция восстановления O₂ и продукции H₂O₂ ожидается в участках цитоплазмы под щелочными зонами, где кислые значения рН_ц приближены к оптимуму рН для фотовосстановления О₂. Так как перенос электронов на О₂ и Н₂О₂ не связан с потреблением ATP, он повышает ΔpH в тилакоидах, что усиливает NPQ в области наружных щелочных полос. В цитоплазме под кислыми зонами, где величина рН_ц оптимальна для фиксации СО₂ и потребления ATP, величина NPQ меняется сравнительно слабо.

Кроме того, остановка потока цитоплазмы в момент возбуждения и длительное (до 10 мин) восстановление скорости течения усиливают сами по себе неоднородность профилей YII и NPQ [49]. Это можно пояснить, используя аналогию между прерыванием течения цитоплазмы и остановкой работающего ленточного конвейера. Перемежающиеся участки клетки с разной фотосинтетической активностью отличаются по скорости экспорта метаболитов (Н₂О₂, NADPH) из хлоропластов в поток цитоплазмы. Движущаяся цитоплазма выступает как транспортное средство, аналогичное движущейся ленте производственного конвейера [50]. Под наружными кислыми зонами, где в хлоропластах преобладает поток электронов по ассимилирующему пути, побочная продукция Н₂О₂ незначительна, а восстановительные эквиваленты (NADPH) используются в реакциях фиксации СО₂. В хлоропластах под щелочными зонами, где часть электронов уходит на фотовосстановление О₂, потребление восстановителей понижено, а продукция Н₂О₂ – повышена. Хлоропласты этих участков служат источником поступления указанных метаболитов в цитоплазму.

Принято считать, что перенос веществ в потоке цитоплазмы сглаживает латеральные градиенты концентрации между областями с разным уровнем метаболитов [51, 52]. В таком случае внезапное прекращение потока цитоплазмы в момент генерации ПД, аналогичное остановке ленточного конвейера, должно переполнять цитоплазму экспортируемыми метаболитами в зонах их интенсивного производства. При этом в участках, где экспорт отсутствует или минимален, состав цитоплазмы изменится незначительно. Можно ожидать, что перепады концентраций Н₂О₂ в цитоплазме между зонами с его интенсивной и слабой продукцией возрастают после остановки циклоза. Это возрастание, вероятно, и отвечает за усиление перепадов между максимальными и минимальными показателями в профилях F_m′, NPQ и YII после генерации ПД.

КОЛЕБАНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ И ФОТОСИНТЕЗА ХЛОРОПЛАСТОВ ПОСЛЕ ВОЗБУЖДЕНИЯ КЛЕТКИ

Возрастание пространственной неравномерности состава цитоплазмы вслед за генерацией ПД и временной остановкой течения цитоплазмы приводит к еще одному интересному последействию – длительным колебаниям флуоресценции F_m′ и квантового выхода YII при измерениях на микроучастке клетки [49, 53]. Однократное возбуждение плазмалеммы вызывает колебания F_m′ с амплитудой до 40–50% от величины F_m′ в покое, которые продолжаются в течение 20–30 мин (рис. 3а). Об участии Н₂О₂ в возникновении колебаний говорят опыты с возбуждением клетки в присутствии метилвиологена.

 

Рис. 3. Генерация ПД в стандартных условиях (интенсивность света 39 мкмоль/(м² с)) индуцирует (а) длительные периодические колебания флуоресценции F_m′, но вызывает (б) устойчивое тушение F_m′ при наличии в среде 0.5 мМ метилвиологена (МВ). Момент генерации ПД отмечен вертикальными штриховыми линиями при t = 50 с.

 

Метилвиологен (МВ) известен как эффективный акцептор электронов от ФСI. Он катализирует восстановление О₂ до супероксид-анион-радикала, который в дальнейшем образует Н₂О₂ в реакции дисмутации. Освещение изолированных хлоропластов в присутствии МВ приводит к быстрому образованию активных форм кислорода (АФК), включая Н₂О₂, причем оптимальные значения рН для фотовосстановления О₂ в норме и в присутствии МВ существенно различаются: рН 5 и рН 8, соответственно [43].

Плазматическая мембрана харовой водоросли в покое не пропускает двухвалентный катион МВ (MV²⁺) [5, 54]. Так, инкубация клеток в течение 30 мин в присутствии 0.1–0.5 мМ МВ без электрической стимуляции не нарушала индукционные кривые фотоокисления хлорофилла реакционного центра ФСI Р700 и квантовую эффективность (YII) в интактной клетке. Вместе с тем однократная генерация ПД вызывала быстрое проникновение МВ к участкам его связывания в Хп, что проявлялось в резком падении квантового выхода (YII) в области кислых зон, а также в замене характерной многофазной кинетики фотоокисления Р700 на простой ступенеобразный переход [5]. По-видимому, катион MV²⁺ попадает в клетку по неселективным катионным каналам, открываемым при деполяризации во время развития ПД. Известно, что эти каналы проводят ионы Са²⁺, гидратный радиус которых составляет 0.41 нм. Мгновенное появление каталитической активности МВ в хлоропластах после однократной генерации ПД говорит о том, что ионы MV²⁺ с радиусом 0.33 нм также проникают в клетку через эти каналы. Поскольку МВ действует как катализатор в циклах восстановления–окисления, поступление в клетку даже небольших количеств МВ за время ПД оказывается достаточным для переключения СО₂-зависимого потока электронов на фотовосстановление О₂ с образованием АФК. В итоге генерация ПД служит триггером для быстрого переключения СО₂-зависимого пути переноса электронов на фотовосстановление МВ и О₂ [55].

Внесение в среду метилвиологена устраняло колебания F_m′ в ответ на возбуждение (рис. 3б). Генерация ПД в присутствии МВ вызывала необратимое смещение F_m′ к низкому уровню [49]. По-видимому, устойчивое нефотохимическое тушение F_m′ при генерации ПД в присутствии редокс-медиатора МВ отражает накопление АФК (Н₂О₂), тогда как колебания F_m′ после ПД в отсутствие МВ обусловлены пространственно-неравномерным образованием АФК.

При возбуждении в отсутствие МВ, перепады в содержании Н₂О₂ (акцептор электронов в реакции Хилла [44]) возрастают между зонами ассимиляции СО₂ и областями, где происходит фотовосстановление О₂. В условиях стационарного потока жидкости состав цитоплазмы на любом участке клетки поддерживается постоянным независимо от времени наблюдения, хотя он может варьировать по длине клетки. Кардинальные изменения наступают после вызванной потенциалом действия остановки течения цитоплазмы и возрастания перепадов в продольных профилях содержания АФК. Известно, что мембраны оболочки хлоропласта проницаемы для Н₂О₂: в зоне яркого освещения пероксид выходит из хлоропластов и переносится вдоль клетки с потоком цитоплазмы [56]. Мембранный транспорт Н₂О₂, по-видимому, опосредован аквапоринами внутренней мембраны оболочки хлоропластов [57–59]. По мере перемещения порций цитоплазмы с высоким и низким содержанием Н₂О₂, неподвижные хлоропласты получают из потока то большие, то меньшие количества этой АФК, что вызывает колебания уровней F_m′ и NPQ. Согласно предлагаемой гипотезе, осцилляции флуоресценции F_m′ и YII отражают вызванное остановкой циклоза усиление неравномерного продольного распределения Н₂О₂ и других метаболитов, которое сохраняется длительное время после генерации ПД. Колебания флуоресценции продолжаются примерно 20 мин, что почти вдвое превышает период восстановления циклоза. Следовательно, установление стационарного продольного распределения метаболитов (Н₂О₂, NADPH) требует большего времени, чем возобновление циклоза.

Роль неравномерного состава движущейся цитоплазмы как причины осцилляций флуоресценции F_m′ и квантового выхода YII после генерации ПД проверяли двумя путями. Оба основаны на ограничении притока метаболитов в анализируемый участок клетки из соседних областей междоузлия. В первом варианте сравнивали влияние ПД на флуоресценцию хлорофилла в условиях общего освещения объекта и при локальном освещении малого участка клетки по центру области измерения [49, 60]. Общее освещение обеспечивает фотоиндуцированный обмен метаболитов между неподвижными хлоропластами и цитоплазмой по всей клетке, а циклоз способствует распространению этих метаболитов на дальние расстояния. Режим локального освещения отсекает дальние взаимодействия, так как затемнение большинства Хп прекращает образование в них фотометаболитов и инактивирует светозависимые транспортеры оболочки (малатный клапан и транслокатор триозофосфатов). Поэтому переход от общего к локальному освещению препятствует микрофлуидной доставке метаболитов в область измерения из других частей клетки, а взаимодействия плазмалеммы и Хп ограничиваются узкой зоной освещения.

Сужение освещаемого участка клетки до диаметра 1 мм приводило к исчезновению длительных осцилляций F_m′ и YII после генерации ПД, причем флуоресценция F_m′ оставалась на высоком уровне (ср. рис. 3 и 4). Очевидно, что протекание фотосинтеза в пределах локально освещенной области исключает возникновение колебаний F_m′ и YII в ответ на возбуждение клетки. Следовательно, для появления осцилляций необходимы обмен метаболитов за пределами области измерения, а также микрофлуидная доставка этих метаболитов из дальних частей клетки в исследуемую область.

 

Рис. 4. Возбуждение плазматической мембраны (при t = 50 с) в интернодальной клетке Chara приводит к длительным колебаниям F_m′ при общем освещении всей клетки, но не вызывает существенных осцилляций F_m′ при локальном освещении участка диаметром 1 мм с центром в области измерения флуоресценции. а – Изменения флуоресценции хлорофилла F_m′ в ответ на генерацию ПД при t =50 c (момент возбуждения отмечен вертикальной штриховой линий) при общем и локальном освещении; б – изменения трансмембранного потенциала плазмалеммы, вызванные генерацией ПД при общем и локальном освещении.

 

Во втором варианте опытов влияние потока цитоплазмы на передачу сигналов от плазмалеммы к хлоропластам проверяли с помощью ингибитора циклоза и полимеризации актина – цитохалазина D (CD). Связывание CD с актиновыми микрофиламентами препятствует взаимодействиям актина и миозина, и, скорее всего, нарушение этих взаимодействий, а не деполимеризация актина объясняет остановку течения цитоплазмы у Chara [61]. При умеренном освещении CD не оказывает ингибирующего действия на квантовый выход ФСII (YII) и линейный поток электронов [62]. Подавление течения цитоплазмы цитохалазином D сопровождалось полным устранением длительных колебаний F_m′ и YII. Изменения F_m′ и YII зачастую ослаблялись слишком сильно и не могли служить надежным показателем возбуждения клетки. Поэтому о генерации ПД судили по измерениям мембранного потенциала плазмалеммы с помощью внутриклеточных микроэлектродов. Оказалось, что возбудимость клетки сохраняется в присутствии CD, а колебания F_m′ и YII полностью исчезают [49]. Более того, отмывание клетки от цитохалазина D приводило к восстановлению циклоза и возобновлению длительных осцилляций F_m′ и YII.

Тот факт, что генерация ПД вызывает периодические изменения F_m′ (NPQ) и YII при активном течении цитоплазмы, но не оказывает такого эффекта после остановки потока, говорит о важной роли дальних микрофлуидных коммуникаций в возникновении колебаний. Следовательно, цитоплазма, протекающая через область измерения в течение 100–800 с после возбуждения плазмалеммы, характеризуется неоднородным содержанием ряда компонентов (предположительно, Н₂О₂ при повышенной освещенности и восстановительных эквивалентов на слабом свету). На рис. 5 приведена предполагаемая схема сопряжения потоков Н⁺ через плазмалемму с фотосинтетической активностью хлоропластов в покое и при возбуждении. Отмечено усиление неоднородности фотосинтетической активности и состава цитоплазмы при возбуждении как следствие остановки циклоза и стимуляции фотовосстановления О₂ при возрастании [Са²⁺]_ц.

 

Рис. 5. Функциональные отличия «кислых» и «щелочных» зон интернодальных клеток Chara в покое и после генерации ПД на плазматической мембране. В кислых зонах на свету работает ATP-зависимый Н⁺-насос, что смещает рН_о в слабокислую область и способствует преобразованию непроникающего аниона НСО₃^– в нейтральную проникающую форму СО₂. Выведение протонов Н⁺-насосом поддерживает слабощелочной рН цитоплазмы (рН_ц), способствующий фиксации СО₂. Дуговая стрелка в периплазматическом пространстве изображает протекание электрического тока на внеклеточном сегменте круговой цепи. Для щелочных зон клетки характерны высокая Н⁺-проводимость плазмалеммы, необходимая для поддержания суммарного баланса Н⁺ в цитоплазме, отсутствие проникающей формы углерода СО₂, осаждение кристаллов СаСО₃ и сравнительно низкие значения рН_ц. Из-за нехватки СО₂ и пониженного рН_ц фотосинтетический поток электронов частично переключен с ассимилирующего пути на восстановление О₂ с образованием Н₂О₂, который действует как акцептор реакции Хилла, вызывая нефотохимическое тушение (NPQ) флуоресценции хлорофилла. Накопление Н₂О₂ в хлоропластах сопровождается его выведением в текущую цитоплазму и распространением Н₂О₂ с потоком по длине клетки. Резкое возрастание [Ca²⁺]_ц при возбуждении вызывает подавление Н⁺-насоса и Н⁺-проводимости, что проявляется в сглаживании щелочных пиков, возрастании сопротивления мембраны в области щелочных зон и в переходной гиперполяризации клетки. Повышение [Ca²⁺]_ц во время ПД стимулирует фотовосстановление О₂ и образование Н₂О₂ в участках с пониженным рН_ц, а также вызывает остановку течения цитоплазмы. Оба фактора усиливают неравномерное распределение АФК (Н₂О₂) по длине клетки и отвечают за появление длительных осцилляций эффективного квантового выхода YII и максимальной флуоресценции F_m′ как показателя нефотохимического тушения (NPQ) при наблюдении на микроучастках клетки.

 

ПРОПУСКНАЯ СПОСОБНОСТЬ ПЛАЗМОДЕСМ В ПОКОЕ И ПОСЛЕ ВОЗБУЖДЕНИЯ

Измерения флуоресценции на микроучастках клетки в сочетании с локальным освещением участка в стороне от области измерения позволяют следить за передачей метаболического сигнала из ярко освещенных хлоропластов в пластиды, экспонированные на слабом или умеренном свету. Для этой цели подводят локальный фотостимул (диаметр луча 400 мкм, интенсивность ~500 мкмоль квантов/(м² с), длительность 30 с) к участку, который располагается в потоке цитоплазмы выше, чем область измерения флуоресценции (ОИФ). В зоне локального освещения в текущую цитоплазму экспортируются фотометаболиты, которые с потоком достигают области измерения и вызывают переходные изменения фактической флуоресценции F′ и максимальной флуоресценции F_m′ [63, 64].

В опосредованных циклозом изменениях F′ и F_m′ участвуют метаболиты двух типов: вызванные ими изменения флуоресценции имеют разную направленность и отличаются по кинетическим характеристикам [65]. Возрастание F′ после освещения соседнего участка обусловлено экспортом и флуидным транспортом восстановленных соединений (предположительно, NADPH); оно выражено наиболее сильно при слабой фоновой подсветке (~10 мкмоль/(м² с)). Влияние локального освещения на F′ проявляется независимо от того, направлен ли луч на участок с кислой или щелочной зоной. Однако изменения F′ при локализации ОИФ в щелочной зоне были намного слабее, чем при расположении ОИФ в кислой зоне [64]. Ограниченное поступление восстановителя в хлоропласты под щелочными зонами, вероятно, обусловлено отсутствием соответствующего градиента концентрации на мембранах оболочки.

Тушение F_m′ в ответ на удаленное локальное освещение проявляется при фоновом освещении повышенной интенсивности (~40 мкмоль/(м² с)), которая сама по себе недостаточна для снижения F_m′. Возможно, что дополнительное поступление АФК из области локального освещения на фоновом свету такой интенсивности повышает ΔрН до порогового уровня, при котором происходит сильное нефотохимическое тушение.

Метод приложения локальных световых импульсов в стороне от ОИФ полезен также для изучения межклеточного транспорта метаболитов [66]. Для этой цели важно обеспечить фиксированное расстояние между оптоволокном, по которому подводят локальный световой импульс, и областью измерения флуоресценции. При этом цепочку из двух интернодальных клеток поочередно смещают так, чтобы в одном случае оптоволокно и ОИФ располагались напротив одной клетки, а в другом были обращены к соседним междоузлиям. Измерения на сдвоенных междоузлиях при слабой фоновой подсветке показали, что узловой комплекс пропускает до 30–45% восстановленных метаболитов, экспортированных из хлоропластов клетки-донора, причем для их проникновения через узловой комплекс необходимо время около 12 c. В отличие от этого, фотометаболиты, вызывающие сильное тушение F_m′ при их микрофлуидном транспорте в пределах одного междоузлия, не обнаруживали даже слабого проникновения через узловой комплекс [67].

Кратчайший путь связи между соседними междоузлиями образован двумя плоскими клетками, расположенными в центральной части узлового комплекса (цит. по [68]). Результаты опытов говорят о селективности межклеточных коммуникаций, опосредованных участием плазмодесм, которые представляют собой наноразмерные тяжи цитоплазмы, пронизывающие толстые клеточные стенки. Становится очевидным, что плазмодесмы пропускают восстановленные соединения, вызывающие возрастание F′, но непроницаемы для агентов, вызывающих тушение флуоресценции F_m′ [67]. К таким агентам, предположительно, относятся АФК (Н₂О₂).

Используя пары интернодальных клеток в сочетании с методом локальных световых импульсов, можно изучать влияние ПД на перенос восстановительных эквивалентов через плазмодесмы. Остановка течения цитоплазмы, вызванная генерацией ПД, задерживает доставку метаболитов в ОИФ, что искажает типичную ответную реакцию F′ на локальное освещение отдаленного участка клетки [69]. Пик переходного возрастания F′ снижается и достигается со значительным запозданием. Вместе с тем ответная реакция F′, измеряемая после прохождения сигнала через узловой комплекс, подвергалась еще более сильному непропорциональному подав- лению после генерации ПД. Результаты говорят о том, что влияние ПД на пропускную способность плазмодесм нельзя объяснить только изменениями скорости течения цитоплазмы.

По-видимому, узловой комплекс ведет себя как пропускная система, в которой время прохождения метаболита определяется свойствами плазмодесм, а не скоростью течения жидкости в интернодальных клетках. Интересным качеством этой пропускной системы является то, что количество проникающих метаболитов значительно уменьшается после генерации ПД, тогда как время пересечения этого барьера подвергается небольшим изменениям. Закрытие плазмодесм для межклеточного прохождения природных метаболитов при генерации ПД в соседних междоузлиях может быть физиологически значимой реакцией, направленной на перераспределение восстановительных эквивалентов между соседними интернодальными клетками. В условиях покоя эти метаболиты транспортируются из мест их избыточной генерации в зонах яркого освещения к слабо освещенным соседним клеткам, нуждающимся в NADPH для ассимиляции СО₂. Генерация ПД может сигнализировать о повреждении клеточной стенки и необходимости восстановителей для устранения дефекта при участии плазмалеммной NADPH-оксидазы [70]. Переключение путей переноса восстановительных эквивалентов на внутренние нужды за счет ограниченного экспорта в соседние клетки может способствовать заживлению местных повреждений клеточной стенки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Источники финансирования. Работа выполнена в рамках научного проекта государственного задания МГУ № 121032500058-7.

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследования.

About the authors

А. A. Bulychev

Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: bulychev@biophys.msu.ru

Faculty of Biology

Russian Federation, Moscow, 119991

N. A. Krupenina

Lomonosov Moscow State University

Email: bulychev@biophys.msu.ru

Faculty of Biology

Russian Federation, Moscow, 119991

References

Supplementary files