Membrane-dependent reactions of blood coagulation: classical view and state-of-the-art concepts

Full Text

1. ВВЕДЕНИЕ

Для остановки кровопотери при повреждении кровеносного сосуда в многоклеточных организмах существует сложный механизм, называемый гемостазом. В этом процессе у позвоночных условно выделяют два тесно взаимосвязанных звена – сосудисто-тромбоцитарный и плазменный гемостаз [1, 2]. В первом участвуют стенки кровеносного сосуда и специализированные клетки крови тромбоциты [3, 4]. Главные участники второго – белки плазмы крови, называемые факторами свертывания, а также их разнообразные ингибиторы [5, 6].

Факторы свертывания представляют собой сериновые протеазы или их аллостерические активаторы – кофакторы. Они циркулируют в кровотоке в форме неактивных предшественников-зимогенов и переходят в активные формы в результате ограниченного протеолиза другими факторами свертывания. Исключением является фактор VII, 1% которого циркулирует в активной форме фактора VIIa (суффикс «а» используется для обозначения активной формы фактора) [7]. Последовательность актов активации одного фактора другим носит название процесса свертывания крови.

Свертывание крови инициируется, когда плазма крови входит в контакт с внесосудистыми тканями организма, клетки которых экспрессируют интегральный мембранный белок тканевый фактор (TF), который присутствует на внешней мембране этих клеток [8, 9]. При этом TF связывает фактор VII (FVII) и фактор VIIa (FVIIa) из плазмы крови. В результате на поверхности клеточной мембраны формируется комплекс VIIa/TF, называемый внешней теназой, в котором FVIIa является активной протеазой, а TF – его кофактором [8, 10]. Этот комплекс активирует факторы X и IX с образованием активных факторов Ха и IXa [11, 12]. Сами по себе Ха и IXa являются протеазами и способны медленно активировать протромбин с образованием тромбина и фактор Х с образованием фактора Ха соответственно. Однако эти реакции многократно ускоряются в присутствии кофакторов Va и VIIIa, с которыми Ха и IXa образуют ферментативные комплексы протромбиназу (Xa/Va) и внутреннюю теназу (IXa/VIIIa) [13–16]. Образованный под действием протромбиназы тромбин активирует белок фибриноген с образованием фибрина, а полимеризация фибрина приводит к переходу плазмы крови из жидкого состояния в состояние геля, что препятствует ее вытеканию из сосуда [17] (рис. 1).

 

Рис. 1. Упрощенная схема реакций свертывания крови. Римскими цифрами обозначены факторы свертывания (V, VII, VIII, IX, X, XI, XII), суффикс «а» используется для обозначения активной формы. II – протромбин, Fb – фибриноген, Fg – фибрин, TFPI – ингибитор пути тканевого фактора, TF – тканевый фактор, S, Z – белки S и Z, PCa – активированный белок С. Двойная черная линия – схематическое изображение мембраны. Черные стрелки – каталитическая активация, черные пунктирные стрелки – формирование комплексов, серые градиентные стрелки – действие ферментативного комплекса или фермента на субстрат, ▬| – ингибирование. Во избежание перегруженности на схеме не указано ингибирование факторов свертывания антитромбином и медленные реакции активации факторов энзимами без кофакторов.

 

Альтернативный путь активации свертывания крови происходит по так называемому контактному механизму, который начинается с активации фактора XII при контакте с отрицательно заряженными поверхностями, активации фактора XI фактором XIIa и фактора IX фактором XIa [18–20] (рис. 1).

Система свертывания крови включает в себя многочисленные обратные связи. Так, тромбин, белок, который формируется на поздних стадиях системы свертывания, способен активировать факторы V и VIII, а фактор Ха активирует комплекс VII/TF в VIIa/TF [21–23] (рис. 1).

Помимо системы активации свертывания крови в плазме существует набор белков, служащий для ее ингибирования. Одним из основных ингибиторов является антитромбин (AT), ингибитор практически всех протеаз системы свертывания включая тромбин, FXa и FIXa [24]. Кроме того, существует путь белка С, который способен расщеплять кофакторы Va и VIIIa, ингибируя протромбиназу и внутреннюю теназу. Кофактором для белка С является белок S, который усиливает его активность. Белок С активируется тромбином в комплексе с белком эндотелия тромбомодулином [25]. Ингибитор пути тканевого фактора (TFPI) действует как на фактор Ха, так и на внешнюю теназу, связываясь с тройным комплексом VIIa/TF/Xa. При этом для ингибирования фактора Ха TFPI требуется белок S, который усиливает аффинность TFPI к фактору Ха [26]. Ингибирование фактора Ха также происходит по пути белка Z. Белок Z является кофактором для Z-зависимого протеазного ингибитора (ZPI), комплекс из этих белков быстро ингибирует фактор Ха [27] (рис. 1).

Ключевой особенностью реакций свертывания крови как активации, так и ингибирования, является то, что эти реакции преимущественно происходят на поверхности фосфолипидных мембран, источником которых могут быть как клетки (например, активированные тромбоциты), так и фосфолипидные микрочастицы – везикулы. В силу сложности процессов на мембранах и нестабильности промежуточных комплексов вплоть до настоящего времени мембранные реакции являются наиболее плохо понятной частью свертывания крови. В последние годы активно появляются работы, указывающие на необходимость радикального пересмотра этих важных процессов. В настоящем обзоре приведены современные представления о структуре, составе и основных источниках таких мембран, о механизмах связывания и, соответственно, локализации на мембранах факторов свертывания и ключевых принципах формирования и функционирования белковых ферментативных комплексов на фосфолипидных мембранах.

2. СТРУКТУРА И СОСТАВ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН

Различные мембраны в составе клеток (плазматическая мембрана, мембраны органелл) отличаются по липидному составу. Для всех этих мембран основными структурными липидами являются фосфатидилхолин (PC) и фосфатидилэтаноламин (PE) [28, 29]. Однако мембрана митохондрий, в отличие от других мембран, содержит кардиолипин (CL) [30], а в плазматической мембране содержится самый высокий процент сфингомиелина (SM) и холестерола [29, 31].

Ключевой особенностью плазматической мембраны живых клеток является асимметричность состава и свойств двух липидных слоев в бислое [32, 33]. У эритроцита крови внешний слой мембраны состоит преимущественно из PC и SM [34, 35], хотя в нем также было обнаружено до 4% фосфатидилсерина (PS) [35]. Внутренний цитоплазматический слой состоит преимущественно из PC, PS, содержание которого доходит до 30% [35] и РЕ. Кроме того, фосфатидная кислота (РА), фосфатидилинозитол (PI) и фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат (PIP2) также находятся преимущественно во внутреннем слое [34, 35]. Аналогичный состав слоев мембраны был описан для неактивированного тромбоцита [34]. Внешний и внутренний слои мембраны эритроцита отличаются входящими в их состав жирными кислотами [35]. Около 35% внешнего слоя составляют липиды с ненасыщенными жирными кислотами в их составе, а большинство (> 80%) липидов имеют ноль, одну или две двойные связи на молекулу липида. С другой стороны, во внутреннем слое большая часть липидов имеет 2 и более двойных связей на молекулу липида с 35% липидов, имеющими 4 двойные связи на молекулу [35]. Отличия в составе слоев ведут к отличиям их физических свойств. Внешний слой является менее текучим, липиды в нем имеют меньший коэффициент диффузии и более плотно упакованы по сравнению с внутренним слоем [35].

Асимметрия плазматической мембраны имеет большое значение для правильного функционирования клетки. Высокое процентное содержание PS на внутреннем слое, а также присутствие PIP2, позволяет ключевым внутриклеточным сигнальным молекулам связываться с мембраной с помощью разнообразных мембраносвязывающих доменов в их составе [36, 37]. Так, различные белки из группы протеин киназ С (PKC) связываются с мембранами, содержащими PS, РА и PIP2, и такое связывание необходимо для их активации [38, 39]. Кроме того, асимметрия распределения PS в мембране облегчает включение трансмембранных белков в мембрану [40].

Асимметрия липидного бислоя активно поддерживается в живой клетке ATP-зависимыми флиппазами, которые переносят PS и РЕ с внешнего слоя на внутренний [41]. В тромбоците это, предположительно, флиппазы ATP11A и ATP11C [41, 42]. Флиппазы ингибируются, если в цитозоле повышается концентрация ионов Са²⁺ в результате активации тромбоцитов различными агонистами. В этих условиях активируются скрамблазы (в тромбоците TMEM16F), которые перемешивают липиды в мембране, что приводит к появлению PS и РЕ на внешней стороне мембраны тромбоцита [42]. Такое нарушение асимметрии наблюдалось при активации тромбоцитов тромбином, когда PS/PI детектировались на внешнем слое мембраны, а также на поверхности липидных микровезикул тромбоцитарного происхождения [34].

Поверхность PS-содержащей мембраны служит платформой для формирования каталитически активных комплексов системы свертывания крови. Такие поверхности являются эффективным «ускорителем» ферментативных реакций и критически необходимы для быстрого их срабатывания [43].

3. СТРУКТУРА ФАКТОРОВ СВЕРТЫВАНИЯ И МЕХАНИЗМЫ ИХ СВЯЗЫВАНИЯ С МЕМБРАНОЙ

3.1. Витамин К-зависимые белки

Семь факторов свертывания и факторов, участвующих в ингибировании, являются витамин К-зависимыми белками, названными так по причине необходимости витамина К для их правильного биосинтеза и функционирования [44]. В число таких факторов входят VII, IX, X, протромбин (PT), а также белки С, S и Z (рис. 2а).

 

Рис. 2. Структура белков системы свертывания крови.

а – Схема доменного состава отдельных белков. Gla – Gla-домен; EGF1-4 – EGF1-4-домен; Serine Protease – протеазный домен; TSR – тромбин-чувствительная область; LG – ламинин G-подобные домены; KR – крингл-домены; А1-3 – А1-3-домен; С1,2 – С1,2-домен; В – В-домен; I – внутриклеточный домен; Tr – трансмембранный домен; N, C – N- и C-концевые внеклеточные домены.

б – Структура фактора VIIa. Визуализирована в VMD, PDB 1dan [59]. Цвета в соответствии с вторичной структурой белка. Голубой – поворот; желтый – β-лист; фиолетовый – α-спираль; синий – 3₁₀-спираль; белый – нерегулярная структура; рыжий – ионы Са²⁺.

в – Gla-домены фактора VIIa человека (цвета в соответствии с вторичной структурой как на панели б, PDB 1dan) и протромбина быка (желтый, PDB 1nl2 [58]). Структуры выровнены в VMD, RMSD (среднеквадратичное отклонение между соответствующими атомами основных цепей) = 3.31 Å. У фактора VIIa визуализированы остатки γ-карбоксиглутамата, связанные с ионами Са²⁺.

 

Факторы VII, IX, X и белок С имеют одинаковое доменное строение (рис. 2а) [8, 45]. За N-концевым Gla-доменом в их составе следуют два EGF-подобных домена и С-концевой протеазный домен. Белок Z отличается тем, что вместо протеазного домена в его состав входит псевдо-каталитический домен, в котором отсутствует каталитическая триада (гистидин и серин заменены на аланин и треонин соответственно) [27]. В состав белка S входят Gla-домен, тромбин-чувствительная область (TSR), четыре EGF-подобных домена и два ламинин G-подобных домена [46]. Протромбин состоит из Gla-домена, двух крингл-доменов и протеазного домена (рис. 2а) [47]. Активные формы перечисленных факторов имеют схожее с неактивными доменное строение, за исключением тромбина [8, 48, 49]. При активации от протромбина отрезается фрагмент-1,2, который содержит Gla-домен и два крингл-домена [49]. Таким образом, тромбин теряет способность связываться с мембраной.

В растворе витамин К-зависимые белки имеют достаточно вытянутую конформацию (рис. 2б). Так, расстояние от Gla-домена до каталитической триады фактора Х составляет 95А, а фактора Ха – 83А [50].

Молекулярно-динамические исследования показали, что отдельные домены факторов VIIa, Х и Хa являются жесткими структурами [50, 51]. Однако Gla-, EGF1- и EGF2-домены демонстрируют высокую подвижность друг относительно друга [50, 51], что делает структуру факторов VIIa, Х и Хa гибкой в растворе.

Протромбин в растворе существует в двух конформациях, находящихся в состоянии равновесия. Первая конформация – «закрытая» (70% молекул), в которой протеазный домен взаимодействует с крингл-1-доменом с помощью аминокислотных остатков Tyr93 и Trp547, не подвержена автоактивации. Вторая конформация – «открытая», в которой протеазный и крингл-1-домены не взаимодействуют и которая подвержена автоактивации [47].

Витамин К-зависимые белки обладают способностью обратимо и зависимо от ионов Са²⁺ связываться с фосфолипидными мембранами при помощи Gla-доменов, входящих в их состав. Gla-домены разных белков схожи как по аминокислотной последовательности, так и по третичной структуре [52–54], причем высокая степень гомологичности наблюдается не только для различных витамин К-зависимых белков человека, но и между белками различных видов. Так, аминокислотные последовательности Gla-доменов фактора IX человека, мыши, быка и крысы идентичны более чем на 90% [54]. Такая высокая консервативность Gla-доменов свидетельствует о критической значимости этой структуры для функционирования белков. Структуры Gla-доменов фактора VII человека и протромбина быка приведены на рис. 2в. Несмотря на то что белки принадлежат организмам разных видов, структуры очень близки (RMSD = 3.31 Å).

В состав Gla-доменов витамин К-зависимых белков входит от 9 до 13 нестандартных аминокислотных остатков, γ-карбоксиглутаматов, которые обладают способностью связывать ионы Са²⁺ (рис. 2в) [52]. Связывание Са²⁺ критически важно для поддержания структуры белка и его функционирования, так как в отсутствие ионов Са²⁺ Gla-домен становится разупорядоченным, теряя сложную третичную структуру и способность к связыванию с мембраной [55–57]. Согласно данным рентгеноструктурного анализа, с Gla-доменом ассоциированы 7–8 ионов Са²⁺ (рис. 2в) [58–60]. У фактора IX и белка С в присутствии ионов магния три (для фактора IX) или два (для белка С) сайта связывания Са²⁺ на поверхности Gla-домена заняты Mg²⁺. Пять сайтов при этом заняты Са²⁺ [61, 62]. Аналогично в Gla-домене фактора VIIa 3 сайта заняты Mg²⁺ и 4 сайта – Са²⁺, причем при высоких концентрациях Са²⁺ один из сайтов магния оказывается занят кальцием [62].

Согласно молекулярно-динамическим исследованиям, Gla-домены достаточно глубоко встраиваются в фосфолипидный бислой. Гидрофобные аминокислотные остатки, расположенные в нижней части Gla-домена (для фактора VII это Phe4, Leu5, Leu8), проникают ниже уровня фосфатов в полярных головах фосфолипидов [53]. При этом между белком и липидами формируются несколько типов взаимодействий. С ионами Са²⁺ белка взаимодействуют группы СОО^– и фосфаты липидов; положительно-заряженные аминокислотные остатки Gla-домена взаимодействуют с группами СОО^– и фосфатами липидов [53, 63, 64].

3.2. Факторы V и VIII

Факторы V и VIII после активации тромбином и перехода в формы факторов Va и VIIIa являются аллостерическими активаторами (кофакторами) для сериновых протеаз, факторов Ха и IXа соответственно. Эти факторы имеют схожую доменную структуру (рис. 2а): состоят из доменов A1, A2, B, A3, C1 и C2 [65–67].

В плазме крови фактор VIII присутствует в виде гетеродимера из тяжелой (А1-А2-В) и легкой (А3-С1-С2) цепей [67, 68]. Гетеродимер циркулирует в связанном с фактором фон Виллебранда (vWF) состоянии, что удлиняет время его жизни в плазме и предохраняет от протеолитической деградации, причем каждый мономер vWF способен связывать 1 молекулу фактора VIII [66, 69]. В связывании с vWF участвуют С1, С2 и А3 домены фактора VIII [69]. При активации тромбином протеолиз осуществляется в сайтах Arg372, Arg740 и Arg1689, что приводит к вырезанию В домена фактора VIII и диссоциации от vWF [67]. Активная форма фактора VIII, фактор VIIIa, является гетеротримером из цепей А1, А2 и А3-С1-С2.

Фактор VIIIa является нестабильной молекулой из-за слабых взаимодействий домена А2 с другими доменами и подвержен спонтанной диссоциации с потерей кофакторной активности [70].

Факторы VIII/VIIIa связываются с мембраной независимым от Са²⁺ образом [71] с помощью С1- и С2-доменов [72]. С2-домен является достаточно подвижным относительно остальной структуры фактора VIII. Так, при помощи рентгеноструктурного анализа были обнаружены две конфигурации С2-домена, одна из которых была повернута на 35–45^о вокруг центральной оси относительно другой [73]. Предполагается, что переход С2-домена из одной конформации в другую играет роль при связывании с мембраной [73]. В молекулярно-динамическом исследовании было, напротив, показано, что С2-домен встраивается в мембрану, сохраняя примерно один и тот же угол наклона к ней, в то время как С1-домен демонстрирует большой разброс углов наклона к мембране и менее упорядоченную структуру [71]. Такие структурные перестройки доменов С1 и С2 могут быть причиной тех двухступенчатых связывания и диссоциации фактора VIII с наличием быстрой и медленной стадий, которые наблюдаются в эксперименте [74].

Фактор V является одноцепочечным гликопротеином, из которого при активации тромбином в сайтах Arg709, Arg1018 и Arg1545 вырезается В-домен. Образующийся при этом фактор Va является двухцепочечным белком [75]. В плазме фактор V циркулирует в концентрации 20 нМ, а также примерно 20% фактора V содержится в α-гранулах тромбоцита частично в комплексе с белком мультимерином [76].

В связывании с мембраной, как и в случае фактора VIII, участвуют домены С1 и С2 фактора V/Va [77, 78]. При этом в мембраносвязанных доменах происходят структурные перестройки [79].

3.3. Трансмембранный белок – тканевый фактор

Тканевый фактор (TF) является интегральным мембранным белком, состоящим из четырех доменов: внутриклеточного (остатки 243–263), трансмембранного (220–242) и двух N-концевых внеклеточных иммуноглобулин-подобных доменов (1–219) [80]. Согласно классическим представлениям, TF экспрессируется клетками организма вне кровеносного сосуда, например, фибробластами адвентициальной оболочки артерий, при этом формируя так называемую «гемостатическую оболочку» вокруг сосудов [81]. При повреждении эндотелия кровь входит в контакт с этой оболочкой, что запускает процесс свертывания.

Однако согласно более новым данным, молекулы TF всегда присутствуют в кровотоке. Так, в плазме TF существует в виде его растворимой формы, продукта альтернативного сплайсинга asTF, состоящей из 206 аминокислот, из которых 166 те же, что и у полноразмерного белка, но за которыми следует уникальная С-концевая последовательность (остатки 167–206) [82]. AsTF имеет ненулевую прокоагулянтную активность в присутствии фосфолипидов, детектируется в растущих тромбах [82, 83], хотя, по всей видимости, не играет существенной роли в нормальном гемостазе [84, 85]. Повышенные концентрации asTF экспрессируются в клетках опухолей при онкологических заболеваниях, и в этих клетках asTF участвует в путях внутриклеточной сигнализации, связанных с пролиферацией и выживанием (для подробной информации см. [85]).

Полноразмерный трансмембранный TF присутствует на поверхности различных клеток крови. TF экспрессируется активированными нейтрофилами [86–88], активированными моноцитами [89], тромбоцитами, активированными ADP, тромбоксаном А2, коллагеном и тромбином [90–92]. В неактивированных тромбоцитах TF присутствует в альфа-гранулах и в открытой каникулярной системе [92], небольшие концентрации TF, вероятно, присутствуют на их поверхности [91]. TF также присутствует на поверхности фосфолипидных микровезикул в плазме крови, хотя TF-зависимая прокоагулянтная активность таких микровезикул у здоровых доноров была поставлена под сомнение [93].

Поскольку TF постоянно присутствует в крови, интересным кажется вопрос, каким образом кровь сохраняет жидкое состояние, находясь в постоянном контакте с активатором свертывания. Среди возможных причин можно отметить то, что TF на поверхности клеток присутствует в неактивном («encrypted») состоянии, и активация («decryption») необходима для появления прокоагулянтной активности. В активации TF участвуют как мембранные процессы (например, присутствие SM на внешнем слое мембраны приводит к неактивному состоянию TF, а гидролиз SM вызывает его активацию [94]), так и структурные изменения TF [95].

3.4. Кинетика и механизмы связывания факторов свертывания с мембраной

Согласно классическим представлениям, факторы свертывания обладают способностью обратимо связываться с PS-содержащими фосфолипидными мембранами, причем аффинность связывания возрастает с процентным содержанием PS. Подобные данные были получены как с использованием фосфолипидных везикул [96–99], так и липидных нанодисков [100] – бислойных мембранных дисков контролируемого диаметра порядка 10 нм [101, 102]. Несмотря на то что Gla-домены различных витамин К-зависимых белков очень консервативны, их аффинность к мембранам одного состава отличается на порядки [52].

Исследования мембран, содержащих PE, фосфатидилглицерол (PG), PI, РА и CL, показали, что эти липиды также играют роль в связывании витамин К-зависимых белков с мембраной. Так, при увеличении процентного содержания PS в мембране от 20 до 70% (остальные липиды – РС) равновесная константа диссоциации (K_d) фактора Х с мембраной монотонно падает. Однако при добавлении в состав мембраны PG, K_d для мембраны состава 20% PS/40% PG/40% РС достигала тех же значений, что и для мембраны состава 50% PS/50% РС [103], то есть PG способствовал лучшему связыванию фактора Х с мембраной. Аналогично для всех витамин К-зависимых факторов наблюдалось усиление их связывания при добавлении РЕ в состав нанодиска, причем усиление было тем заметнее, чем ниже процентное содержание PS [100]. Наличие РЕ значительно улучшало связывание фактора VIII с мембраной, содержащей 4% PS, и уменьшало до 1% количество PS в мембране, необходимое для детектируемого связывания с ней фактора VIII (в отсутствие РЕ для связывания с мембраной было необходимо не меньше 8% PS) [104]. Исходя из таких данных, была сформулирована гипотеза АВС (с английского «Anything But Choline», или «что угодно, кроме холина»), согласно которой при связывании факторов с мембраной Gla-домены взаимодействуют не только специфично с полярными группами PS, но и с фосфатами, предоставляемыми всеми типами фосфолипидов. Такой тип связывания наблюдался в молекулярно-динамических исследованиях (см. предыдущие секции). РС, в отличие от РЕ и других липидов, имеет очень объемную головную группу, которая затрудняет доступ к фосфатам, поэтому связывание с мембранами из 100% РС не наблюдается [103].

Фактор VIIa и белок С имеют достаточно низкую аффинность к PS-содержащим мембранам, однако значительно лучше связываются с мембранами, содержащими РА [105]. Причиной этого может быть более глубокое погружение Gla-домена фактора VII в мембрану РА/РС по сравнению с PS/PC и большее количество контактов белка с фосфатами в РА/РС [53]. Кроме того, в специфичности к РА, по всей видимости, играет роль положительно-заряженный Lys32, на месте которого у факторов Х, IX и протромбина находится γ-карбоксиглутамат [53].

Аффинность некоторых из факторов свертывания к фосфолипидным микровезикулам зависит от размера везикулы. Так, легкая цепь фактора V связывается с везикулами меньшего радиуса с более чем на порядок меньшей K_d по сравнению с везикулами большего радиуса [106]. Одной из причин является более быстрая кинетика связывания с маленькими везикулами из-за диффузионных эффектов [107]. Для протромбина было показано, что K_d связывания растет в 8 раз при росте диаметра везикулы от 27.5 до 330 нм [108]. При этом кинетическая константа связывания уменьшается, но для всех радиусов везикул остается в пределах 25% от значения константы скорости столкновений между частицами, рассчитанной по формуле Смолуховского [108], то есть в этом случае изменение аффинности к мембранам происходит не по причине диффузионных эффектов, а из-за отличий в структуре мембран. Аналогичная зависимость параметров связывания от радиуса кривизны мембраны была предсказана теоретически для факторов Х/Ха [109]. В последних исследованиях по связыванию факторов свертывания с мембраной факторы Va и Ха селективно связывались с выпуклыми мембранами радиуса кривизны порядка 10 нм и формировали на них протромбиназу [110].

Интересно, что селективное связывание с мембранами различной топологии демонстрируют не только факторы свертывания. Так, лактадгерин и аннексин А5, белки, часто используемые как маркеры для детекции PS на поверхности клеток [111], обладают такой селективностью. Лактадгерин, присутствующий в молоке и выполняющий ряд функций, среди которых участие в фагоцитозе апоптотических PS-экспрессирующих клеток [112], преимущественно связывается с выпуклыми мембранами большей кривизны [110, 112]. С другой стороны, аннексин А5, который участвует в процессах восстановления мембраны при ее повреждении, лучше связывается с плоскими липидными слоями [110, 113]. Зависимость аффинности к мембране от радиуса кривизны демонстрирует комплекс C5b-7 системы комплемента [114].

Для факторов свертывания характерно неравномерное связывание с поверхностью клеток. На поверхности активированных эндотелиальных клеток протромбиназа из факторов Va и Ха в основном локализуется на филоподиях, вероятно, из-за большей кривизны их поверхности [110]. На поверхности сильно активированных прокоагулянтных тромбоцитов факторы IXa, X, Va, VIII и протромбин, а также фактор XIII, фибрин/фибриноген и плазминоген концентрируются в так называемых «шапках» – сложных выпуклых структурах, состоящих из мембранных везикул, органелл и складок, диаметром в 2 мкм на поверхности тромбоцита (рис. 3) [115–118]. Такое концентрирование факторов на небольшой площади способно привести к значительному ускорению реакций свертывания – до двух порядков [115].

 

Рис. 3. Концентрирование факторов свертывания в «шапке» тромбоцита. ДИК – изображение, полученное методом дифференциально-интерференционного контраста; в центре (Фактор Х) – эпифлуоресцентное изображение в канале фактора Х, справа (Наложение) – наложение первых двух изображений. Желтая стрелка отмечает «шапку» [115].

 

Кинетика связывания факторов свертывания с поверхностью мембраны может быть гораздо сложнее, чем простой одноступенчатый процесс. Так, фактор VIII и фактор IX могут формировать димеры на поверхности мембраны [99, 119]. Димеры фактора Ха формируются как в присутствии растворимой формы PS, С6PS [120], так и на поверхности мембраны [121], причем димеризация фактора Ха происходит одинаково на больших и маленьких везикулах и конкурирует с формированием протромбиназы [122]. Димеризация (или даже мультимеризация) фактора Ха приводит к «гистерезис-подобному» связыванию с мембраной с формированием более плотно связанной фракции белка, которая диссоциирует гораздо медленнее [123]. Предполагается, что такой механизм предохраняет факторы от вымывания потоком из тромба [123]. При связывании с поверхностью нанодисков, изотермы связывания факторов S и Z имели форму сигмоиды, что также может свидетельствовать о более сложном механизме связывания [105].

Таким образом, связывание факторов свертывания с мембраной является строго регулируемым процессом. В его результате факторы локализуются на мембранах подходящего состава и концентрируются в некоторых их областях, что приводит к значительному ускорению ферментативных реакций системы свертывания крови.

4. ФОРМИРОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ КОМПЛЕКСОВ НА МЕМБРАНЕ И ВОПРОСЫ ИХ РЕГУЛЯЦИИ

Три основных ферментативных комплекса, принимающих участие в свертывании крови – внешняя теназа, внутренняя теназа и протромбиназа, очень похожи по основным принципам своего формирования и функционирования. Все эти комплексы состоят из двух субъединиц – фермента и его аллостерического активатора кофактора. При этом изолированный фермент, фактор VIIa, IXa или Xa, демонстрирует пренебрежимо малую активность в растворе и в отсутствие кофактора [124, 125]. Комплексы локализуются на поверхности фосфолипидных мембран, которые существенно ускоряют процесс каталитической активации их субстратов.

4.1. Внешняя теназа: комплекс из фактора VIIa и TF

В комплексе внешней теназы фактор VIIa является активным ферментом, а TF – его кофактором (рис. 4а). Кристаллическая структура комплекса из внеклеточного домена тканевого фактора и фактора VIIa была получена методом рентгеноструктурного анализа [59], а тройного комплекса с фактором Х – методом молекулярного докинга [126].

 

Рис. 4. Структуры ферментативных комплексов. а – Внешняя теназа. Зеленый – фактор VIIa; синий – TF. Визуализирована в VMD, PDB 1dan [59]. б – Протромбиназа. Серый – фактор Va; красный – фактор Ха. Визуализирована в VMD, PDB 7tpq [13].

 

Внешняя теназа образуется при связывании фактора VIIa с TF. TF, являющийся достаточно жесткой молекулой, существенно ограничивает подвижность фактора VIIa, локализуя его активный сайт над мембраной [51]. Оценки K_d для связывания VIIa с мембраносвязанным TF варьируются в пределах 7–56 пМ [101, 127–129], и связывание практически не зависит от состава мембраны [127]. Однако K_d для связывания VIIa с изолированным внеклеточным доменом TF (аминокислоты 1–219) в отсутствие мембраны достигает приблизительно 10 нМ [127, 128, 130], что на 2 порядка превышает K_d для мембраносвязанного TF. Это подчеркивает критическую важность белок-липидных взаимодействий для эффективного формирования ферментативных комплексов свертывания крови.

Механизм формирования внешней теназы может быть сложнее, чем простой одноступенчатый процесс. Так, было предложено, что внешняя теназа формируется по сложному пути, когда фактор VIIa сначала связывается с мембраной, а потом мембраносвязанный VIIa связывается с TF [131]. Более поздние исследования с использованием математического моделирования показали, что данные [127] по независимости формирования комплекса от состава мембраны можно описать только если исходить из предположения, что TF связывает VIIa напрямую из раствора [109].

На эффективность функционирования внешней теназы большое влияние оказывает состав фосфолипидной мембраны. Скорость активации фактора Ха растет с процентным содержанием PS в двухкомпонентных мембранах (PS/PC) [101, 132]. РЕ, PI, PA и PG в составе мембраны повышают эффективность активации фактора Х и понижают процентное содержание PS, необходимое для максимальной эффективности внешней теназы. Так, добавление в состав мембраны 40% РЕ понижает до 6% содержание PS, необходимое для максимальной эффективности активации (без РЕ максимальная эффективность достигалась при 15% PS) [132]. Такой же эффект наблюдался при добавлении PI, PG и CL [132]. С другой стороны, присутствие сфингомиелина (SM) оказывает ингибирующее действие на внешнюю теназу, при этом не влияя на связывание фактора VIIa с TF [94, 132, 133]. В ингибирующем действии SM ключевую роль играют его ОН-группы и более плотная упаковка такой мембраны по сравнению с PS/PC мембранами [133].

Активность внешней теназы зависит от концентрации фосфолипидов в системе. Наблюдаемая каталитическая константа (k_кат) росла, а константа Михаэлиса (K_m) падала при росте концентрации фосфолипидов, приходящихся на 1 молекулу TF [134, 135]. Предполагается, что причиной такого изменения эффективности является то, что внешняя теназа преимущественно связывает и активирует фактор Х, который предварительно связался с мембраной [134]. Похожие данные с таким же выводом относительно предпочтительного пути доставки субстрата были получены ранее [136]. Однако, согласно другим данным, основным путем формирования тройного комплекса является связывание фактора Х напрямую из раствора [137], и этот путь доставки способен поддерживать значительные скорости активации фактора Х [101]. В нашем исследовании при помощи математического моделирования было показано, что путь доставки фактора Х к внешней теназе может зависеть от условий протекания реакции. Так, при поверхностных плотностях TF < 2.8×10^–3 нмол/см² фактор Х связывается с внешней теназой преимущественно с поверхности мембраны, однако при больших поверхностных плотностях TF начинает преобладать доставка из раствора, причем, в соответствии с экспериментальными данными [101], этот путь способен поддерживать сравнимые с мембранным путем скорости активации [138]. Наличие в системе белков, которые способны конкурировать с фактором Х за сайты связывания на мембране, «переключает» внешнюю теназу на активацию фактора Х из раствора, причем эффект тем сильнее, чем ниже концентрация фактора Х и выше аффинность молекулы-конкурента к мембране [138].

4.2. Внутренняя теназа: комплекс из факторов IXa и VIIIa

В комплексе внутренней теназы фактор IXa является активным ферментом, а VIIIa – его кофактором. В отсутствие фактора VIIIa фактор IXa демонстрирует очень низкую каталитическую активность даже относительно простых синтетических субстратов. Вероятная причина этого – наличие в его структуре автоингибируюшей части, 99-петли, которая стерически блокирует доступ к его активному сайту [139, 140]. Связывание с фактором VIIIa и Х приводит к реорганизации 99-петли и значительному увеличению протеолитической активности [141].

Структура внутренней теназы на поверхности мембраны была получена методом малоуглового рентгеновского рассеяния в сочетании с компьютерным моделированием [16], а также методом молекулярного докинга [142]. Все домены факторов IXa и VIIIa участвуют в формировании этого комплекса, кроме, вероятно, одного из С-доменов.

Скорость активации фактора Х внутренней теназой имеет колоколообразную зависимость от концентрации фосфолипидов – реакция ингибируется большой площадью мембраны [15]. Аналогичная форма зависимости была предсказана в модели внешней теназы по причине значительного сокращения поверхностных плотностей фермента и субстрата при больших концентрациях фосфолипидов [138].

Для внутренней теназы, как и для внешней, предпочтительные пути формирования комплекса и доставки к нему субстрата зависят от условий протекания реакции. При малых концентрациях фосфолипидов играет роль связывание факторов IXa и Х напрямую из раствора, а при избытке фосфолипидов комплексы формируются из мембраносвязанных факторов [143]. При этом большую роль играет формирование комплекса кофактор–субстрат (VIIIa–Х) [15, 143].

В случае внутренней теназы поверхность мембраны является эффективным «предохранителем» для фактора VIIIa от спонтанной диссоциации. Так, при малых концентрациях липидов (0.5 мкМ) больше 80% фактора VIIIa инактивировалось за первые несколько минут реакции, когда меньше 5% фактора Х было активировано. С другой стороны, при больших концентрациях липидов (32 мкМ) быстрая инактивация фактора VIIIa начинается тогда, когда практически весь доступный фактор Х уже активирован [143].

4.3. Протромбиназа: комплекс из факторов Ха и Va

В комплексе протромбиназы фактор Xa является активным ферментом, а Va – его кофактором (рис. 4б). Структура этого комплекса была получена при помощи гомологичного моделирования на основе кристаллической структуры протромбиназы из змеиного яда [144] и при помощи криоэлектронной микроскопии в связанном с нанодиском состоянии [13]. Помимо этого, была получена структура тройного комплекса с субстратом протромбиназы протромбином [13].

При активации протромбина основная цепь белка должна расщепляться в двух местах: в Arg271 и Arg320, после чего образуется двухцепочечный тромбин. При расщеплении только Arg271 образуется неактивный предшественник претромбин-2, а при расщеплении только Arg320 – активный предшественник мейзотромбин [145]. Открытая форма протромбина активируется преимущественно по пути Arg271 через претромбин-2, а закрытая – через Arg320 и мейзотромбин [146]. Интересно, что в различных условиях протекания реакции протромбин активируется разными способами. Так, в растворе и в отсутствие фактора Va [14, 145], а также на поверхности тромбоцитов [147] активация идет по пути претромбина-2 через разрезание Arg271. С другой стороны, на поверхности синтетических микровезикул [147] и эритроцитов [148] активация идет по пути мейзотромбина и разрезание Arg320. Такие данные позволяют предположить, что топология поверхности и ее липидный состав могут влиять на предпочтительные конформации белков и превалирующий путь активации.

Зависимость скорости активации протромбина от концентрации липидов имеет колоколообразную форму [149]. Для эффективной активации необходимо формирование липидного бислоя, так как мембрана в форме везикул поддерживает реакцию гораздо эффективнее, чем растворимые формы липидов [150, 151]. Увеличение скорости реакции с площадью фосфолипидной поверхности коррелирует с предположениями, что протромбиназа собирается из факторов Va и Ха, которые предварительно связались с мембраной [152], а также активирует мембраносвязанный протромбин [149, 153]. Однако данные результаты по молекулярным механизмам формирования комплексов были получены в условиях избытка фосфолипидной поверхности, поэтому вполне вероятно, что в других условиях протекания реакции пути сборки могут переключиться на факторы Ха и протромбин в растворе, как это было у внешней и внутренней теназы.

Интересно, что зависимость скорости активации протромбина от концентрации протромбиназы также имеет колоколообразную форму, то есть реакция ингибируется высокими концентрациями фермента [149].

Функционирование протромбиназы зависит от состава фосфолипидной поверхности. Так, скорость активации протромбина растет с ростом процентного содержания PS в везикулах из PS/ PC [151, 154]. При этом добавление РЕ сокращает количество PS, нужное для достижения максимальной активности [151, 154, 155], а SM, наоборот, имеет ингибирующее действие [154, 156], причем эффект тем сильнее, чем больше процентное содержание этих липидов.

4.4. Общие вопросы регуляции ферментативных комплексов

Таким образом, у ферментативных комплексов внешней/внутренней теназы и протромбиназы схожие механизмы функционирования. Они имеют качественно идентичную зависимость скорости активации субстратов от концентрации и состава фосфолипидов, предпочтительно активируют мембраносвязанный субстрат в случаях, если нет большого дефицита мембранной поверхности. Однако в случае дефицита фосфолипидов, могут переключиться на субстрат из раствора.

Лактадгерин обладает способностью ингибировать внутреннюю теназу и протромбиназу более чем на 98% их активности [157]. Причиной такого сильного ингибирования может быть не столько нарушение мембранного пути доставки субстрата, сколько сопутствующее нарушение формирования ферментативного комплекса и вытеснение его с мембраны. Интересно, что эффект лактадгериина на внешнюю теназу (которую, по всей видимости, нельзя полностью вытеснить с мембраны, так как TF является интегральным мембранным белком) несколько слабее [157].

Важной особенностью факторов свертывания является зависимость их связывания с мембранами от радиуса кривизны мембран – связывание более сильное и более быстрое с везикулами меньшего радиуса (см. предыдущие секции). Такая зависимость связывания коррелирует с большей эффективностью меньших везикул в реакциях активации фактора Х и протромбина внутренней теназой и протромбиназой соответственно [157], и в 50–100 раз большей прокоагулянтной активностью тромбоцитарных микровезикул по сравнению с тромбоцитами [158]. Однако в исследовании при помощи компьютерного моделирования было показано, что зависимость связывания факторов от радиуса фосфолипидных везикул приводит лишь к 25% изменению скорости активации фактора Х внешней теназой [109], то есть эффект несколько слабее, чем наблюдается в эксперименте [157]. Таким образом, причины наблюдаемых различий больших и маленьких везикул могут состоять не только в разном связывании факторов свертывания, но и во влиянии на структуру и каталитическую активность комплексов.

Еще одной важной особенностью ферментативных комплексов системы свертывания крови является их функционирование в присутствии потока. В закрытой системе (пробирке) с фиксированными концентрациями всех реагентов функционирование комплексов, по-видимому, не достигает стационарных состояний: скорость активации субстратов непрерывно меняется с течением времени, в том числе из-за истощения субстрата [138, 143]. Однако в присутствии потока реакция достигает стационарного состояния и постоянной скорости активации субстрата, что было показано как теоретически, так и экспериментально [138, 159, 160]. В условиях потока активированные факторы свертывания аккумулируются на поверхности мембраны [138], и этот процесс может быть усилен за счет двухступенчатого связывания и димеризации.

5. ПРИРОДА, ИСТОЧНИКИ МЕМБРАН, ИХ ОТЛИЧИЯ В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

Фосфолипидные мембраны, на которых могут идти ферментативные реакции свертывания крови, предоставляются клетками организма и фосфолипидными микровезикулами, причем источники таких мембран отличаются в норме и разнообразных патологических состояниях.

В норме реакции системы свертывания идут на поверхности активированных тромбоцитов [3], причем не все тромбоциты ускоряют ферментативные реакции в равной степени. При активации тромбоцитов формируется две их субпопуляции [161–163]: (1) PS-отрицательные тромбоциты, способные агрегировать из-за наличия на их поверхности активных интегринов αIIbβ3 и способные к контракции; (2) PS-положительные или прокоагулянтные тромбоциты, на поверхности которых собираются комплексы системы свертывания. PS-положительные тромбоциты не могут агрегировать самостоятельно, но могут встраиваться в агрегат с PS-отрицательными тромбоцитами [164]. При этом в формирующемся тромбе прокоагулянтные тромбоциты вытесняются наружу, локализуя фибрин на поверхности тромба [165].

Реакции свертывания также идут на поверхности липидных микровезикул, которые испускаются различными типами клеток в ответ на активацию или апоптоз. В крови здоровых доноров такие везикулы имеют тромбоцитарную, эритроцитарную, гранулоцитарную или эндотелиальную природу и способны поддерживать формирование тромбина по TF-независимому пути, хотя часть этих микровезикул содержат TF на поверхности [166]. Однако везикулы из плазмы здоровых доноров плохо встраивались в растущий тромб и не влияли на его формирование при артериальных скоростях потока [167].

Мембрана для реакций свертывания может также предоставляться эритроцитами: в крови здоровых доноров циркулирует 0.4–0.5% эритроцитов, содержащих PS на внешней стороне мембраны [168]. Интересно, что эритроциты оказываются встроены в структуру растущего тромба [169]. Скорее всего, эритроциты могут вносить вклад в свертывание в патологических ситуациях (когда они повреждены, и доля прокоагулянтных эритроцитов большая); их вклад в норме является недоказанным.

При различных патологических состояниях, связанных с повышенным риском тромбоза, источники и количество любых прокоагулянтных поверхностей на самом деле существенно изменяются. Так, количество циркулирующих прокоагулянтных тромбоцитов значительно выше у пациентов с онкологическими заболеваниями, чем у здоровых доноров и растет с тяжестью заболевания [170, 171]. При этом опухолевые клетки, по-видимому, способны активировать тромбоциты [172]. Количество PS-положительных тромбоцитов также растет у пациентов с сепсисом по сравнению со здоровыми донорами [173], повышенное количество PS-положительных тромбоцитов коррелирует с риском ишемического инсульта [3].

Количество микровезикул, как TF-положительных, так и PS-положительных, растет при большом наборе патологических состояний, среди которых инфекционные заболевания [174], онкология [80], сепсис [173], сердечно-сосудистые заболевания [175]. При онкологических заболеваниях клетки различных опухолей экспрессируют TF, который способен запускать свертывание на их поверхности [176, 177].

6. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ И ЗНАЧЕНИЕ МЕМБРАННЫХ РЕАКЦИЙ

В живом организме мембранные реакции системы свертывания крови являются не единственными реакциями на мембране. Так, как уже было сказано ранее, аннексин А5 и лактадгерин присоединяются к мембранам клеток для выполнения своих функций. Интересно, что мембраносвязывающий домен лактадгерина (С2-домен) является С-доменом того же типа, что и в факторах свертывания V и VIII [178], что дополнительно подчеркивает универсальность таких мембраносвязывающих структур. Помимо этого, реакции внутриклеточной сигнализации [179] и системы комплемента [180] происходят на поверхности мембран.

Как было показано выше, мембраносвязывающие Gla-домены факторов свертывания разных видов организмов обладают высокой степенью идентичности как их аминокислотной последовательности, так и вторичной/третичной структур (см. раздел 3). Эволюционные исследования показали, что, по-видимому, консервативность этих структур еще выше. Так, Gla-домены были обнаружены в геноме асцидий, у которых, по всей видимости, еще не сформировалась белковая система свертывания крови [181, 182]. При этом в геноме иглобрюхих рыб были обнаружены факторы свертывания, в состав которых уже входили Gla-домены и которые были более чем на 40% идентичны факторам свертывания млекопитающих [181]. Таким образом, мембраносвязывающие домены факторов свертывания эволюционно сформировались одновременно с этой системой, хотя способность связываться с мембраной этих структур остается под вопросом.

Значение мембранозависимых реакций для нормального формирования тромбов используется в клинической практике. Так, некоторые из используемых антикоагулянтов нацелены именно на ингибирование связывания факторов свертывания с мембраной. Например, варфарин является антагонистом витамина К, необходимого для посттрансляционной модификации витамин К-зависимых белков и образования γ-карбоксиглутаматов в их Gla-доменах [183]. Цитрат натрия, известный и часто используемый антикоагулянт, выполняет свои функции за счет связывания ионов Са²⁺, что приводит, в том числе, к нарушению укладки Gla-доменов и ингибированию мембранозависимых реакций [184].

7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, мембраны активированных клеток, липидных везикул выполняют ряд важных функций в системе свертывания крови. Они локализуют и концентрируют факторы свертывания в определенных участках мембран, а также, возможно, влияют на их подвижность и конформацию, что приводит к значительному ускорению ферментативных реакций. Скорость реакций строго регулируется составом мембраны, так как в ней есть как активирующие, так и ингибирующие компоненты. Нарушение такой строгой регуляции, повышенные количества PS или других прокоагулянтных липидов в кровотоки появляются при заболеваниях, связанных с повышенным риском тромбоза.

Исходно мембранные реакции рассматривались как способ увеличить скорости реакций свертывания. Эта роль может быть по-прежнему важна, и концентрирование белков в «шапках» тромбоцитов указывает на это. Однако две другие роли: управление протеканием процесса свертывания в различных регионах тромба и предотвращение размывания потоком, сейчас представляются не менее важными. Дальнейшее прояснение этих механизмов может привести к существенному пересмотру наших представлений о работе системы свертывания и родственных систем (например, комплемента), а также стимулировать разработку новых подходов диагностики и терапии ее нарушений.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 23-74-00057.

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

About the authors

T. A. Kovalenko

Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences; Dmitry Rogachev National Medical Research Centеr of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Author for correspondence.
Email: after-ten@yandex.ru
Russian Federation, Moscow, 109029; Moscow, 119991

M. A. Panteleev

Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences; Dmitry Rogachev National Medical Research Centеr of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology; Lomonosov Moscow State University

Email: after-ten@yandex.ru

Faculty of Physics, Lomonosov Moscow State University

Russian Federation, Moscow, 109029; Moscow, 119991; Moscow, 119991

References

Supplementary files