Особенности биологического действия интенсивных лазерных импульсов на молекулярном уровне

Аннотация

Предложена биофизическая модель формирования основных типов радиационных повреждений ДНК в клетках млекопитающих и человека при взаимодействии с интенсивными фемтосекундными импульсами видимого и ближнего ИК диапазонов.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Исследование молекулярных механизмов действия излучений на живые клетки важно не только в общебиологическом плане, но и крайне актуально при решении прикладных задач, связанных с радиационной безопасностью, разработкой новых типов радиопротекторов, а также развитием методов лучевой терапии рака. Радиационное повреждение ДНК в ядре клетки может привести к ошибкам в транскрипции и репликации, и при неправильном восстановлении может привести к мутации, геномной нестабильности и даже гибели клетки.

Развитие технологий микроманипуляции и диссекции клеточных структур с помощью интенсивного лазерного излучения в последние десятилетия открыло новые подходы для исследования радиационных эффектов в ядрах клеток [1, 2]. Интенсивные сверхкороткие лазерные импульсы позволяют создавать чрезвычайно локализованные химические, термические и механические эффекты в биологических средах и других прозрачных материалах, связанные нелинейным поглощением фотонов и генерацией свободных электронов в процессе фотоионизации [3].

Как показывают эксперименты с лазерными филаментами [1—6], спектр молекулярных повреждений в ДНК включает в себя как фотодимеры и сшивки пиримидиновых оснований, типичные и для других световых источников, так и повреждения нуклеиновых оснований, однонитевые и двунитевые разрывы, формирующиеся в трековых структурах при действии ионизирующих излучений.

Несмотря на большое число экспериментальных работ, теоретическое описание формирования повреждений ДНК представляет собой весьма сложную задачу. И если в случае ионизирующих излучений за несколько десятков лет достигнут значительный прогресс с использованием методов Монте-Карло моделирования [7], то в случае лазерной плазмы теория еще только развивается [3, 6].

Настоящая работа призвана восполнить существующий пробел и предложить биофизическую модель для количественного расчета ключевых типов повреждений ДНК в клетках млекопитающих и человека на основе физико-химических процессов, протекающих при взаимодействии с интенсивными фемтосекундными лазерными импульсами.

ДИНАМИКА ЛАЗЕРНОГО ИМПУЛЬСА

Уравнение для описания динамики комплексной огибающей ψ лазерного импульса в биологическом материале (основной компонент — вода с объемным содержанием ρ_w) можно записать в следующем виде [3, 8]:

$\begin{array}{c}\frac{\partial \psi }{\partial z}-\frac{i}{2k}{\Delta }_{\perp }\psi +\frac{i{\beta }_2}{2}\frac{{\partial }^2\psi }{\partial {\tau }^2}-\frac{{\beta }_3}{6}\frac{{\partial }^3\psi }{\partial {\tau }^3}-i\gamma |\psi {|}^2\psi +\\ +\frac{\gamma }{\omega }\frac{\partial }{\partial \tau }\left(|\psi {|}^2\psi \right)+i\gamma T_R\frac{\partial |\psi {|}^2}{\partial \tau }+\frac{\sigma }{2}\left(1+i\omega {\tau }_c\right){\rho }_e\psi +\\ +\alpha \psi +{\beta }_n|\psi {|}^{2n-2}\psi =0.\end{array}$ (1)

Здесь ω — центральная частота сигнала, k — волновое число на центральной частоте, z — координата, вдоль которой распространяется импульс, τ = t − z / v_g — время в сопутствующей системе координат, Δ_⊥ — лапласиан по координатам x и y, v_g — групповая скорость, β₂ — коэффициент дисперсии групповой скорости, β₃ — коэффициент дисперсии третьего порядка, γ — коэффициент кубической нелинейности, параметр T_R учитывает вклад вынужденного комбинационного саморассеяния. Величина $\sigma =k\omega {\tau }_c/{\rho }_c(1+{\omega }^2{\tau }_c^2)$ определяет сечение лавинной ионизации на основе модели Друде с характерным временем столкновений τ_c и критической плотностью плазмы ρ_c, а соответствующие члены в уравнении (1) учитывают вклад плазмы в нелинейный показатель преломления и потери за счет эффекта обратного тормозного излучения. Коэффициенты α и β_n учитывают линейное поглощение и потери на ионизацию (многофотонное поглощение), соответственно.

В дальнейшем будем рассматривать диапазон интенсивностей и длительностей импульсов [3], не приводящий к пробою с образованием кавитационных пузырьков, ударных волн и локальным ростом температуры, так что соответствующими эффектами можно пренебречь.

КИНЕТИКА НОСИТЕЛЕЙ ЗАРЯДА И ПРОДУКТОВ РАДИОЛИЗА

Кинетика носителей заряда и химических продуктов учитывается в настоящей модели на основе систем типа реакции-диффузии. Схемы основных процессов с соответствующими скоростями приведены в табл. 1, а продукты радиолиза и коэффициенты их диффузии — в табл. 2. При определении параметров использованы данные из работ [3, 6, 7, 9—11].

Таблица 1. Константы скорости процессов при радиолизе и повреждении ДНК

Схема процесса	Константа скорости
	Обозначение	Величина, 1010 M−1·с−1
H2O+ + H2O → H3O+ + •OH	kh	9.0
H2O+ + e‾ → H2О	kr	600
e‾ + H2О → H2О‾	katt	1802
H2О‾+ H2О → •OH + OH–+H2	$k_{H_2{O}^{-}}$	9.0
e‾ + H2О → e‾aq	kea	6.0
e‾aq + •OH → OH–	keOH	2.95
2e‾aq + 2H2О → H2 + 2OH–	$k_{e{H}_{2}O}$	0.5
e‾aq + H3O+ → H•+ H2О	$k_{e{H}_3{O}^{+}}$	2.11
e‾aq + H2O2 → OH– + •OH	$k_{e{H}_2{O}_2}$	1.41
H2+ •OH → H• + H2О	$k_{OH{H}_2}$	0.00417
•OH + •OH → H2O2	kOH	0.44
•OH + H• → H2O	kHOH	1.44
H• + H• → H2	kH	1.2
H3O+ + OH– → 2H2O	$k_{O{H}^{-}{H}_3{O}^{+}}$	14.3
e‾ + DNA → DNA-BD	kebd	163 420
e‾ + DNA → DNA-SSB	kessb	48 696
e‾ + DNA → DNA-DSB	kesdb	1615
•OH + DNA → DNA-BD	kOHbd	0.695
•OH + DNA → DNA-SSB	kOHssb	0.25
2 •OH + DNA → DNA-DSB	kOHdsb	125 M−1

Таблица 2. Коэффициенты диффузии продуктов радиолиза воды

Молекулярный продукт	Коэффициент диффузии
	Обозначение	Величина, 10–9 м2 ·с–1
e‾aq	Dea	4.9
•OH	DOH	2.8
H•	DH	7.0
H3O+	$D_{H_3{O}^{+}}$	9.0
H2	$D_{H_2}$	4.8
OH‾	$D_{O{H}^{-}}$	5.0
H2O2	$D_{H_2{O}_2}$	2.3

Динамика концентрации электронов ρ_e определяется процессами фотоионизации и лавинной ионизации в поле импульса. В видимом и ближнем ИК диапазонах, где линейное поглощение биологических тканей минимально, фотоионизация происходит в многофотонном режиме, когда для перехода электрона в зону проводимости воды требуется $n=Floor(U_{H_{2}O}/\hslash \omega +1)$ фотонов. ДНК в настоящей модели рассматривается как аморфный диэлектрик, распределенный по объему ядра клетки с концентрацией ρ_dna. Поскольку в ДНК эффективная ширина запрещенной зоны U_dna на участках цепи с гуанином может быть несколько меньше, чем в воде U_dna < $U_{H_{2}O}$, то соответствующий вклад может оказаться существенным. Скорости ионизации для воды σ_w и ДНК σ_dna в данной работе рассчитываются по модели Келдыша [12]. Попавший в зону проводимости электрон может набирать энергию в поле импульса за счет эффекта обратного тормозного излучения, сечение которого определяется . На данном этапе становится возможным возбуждение или ударная ионизация молекул. Поскольку данные процессы критичны для расчета повреждений ДНК, следуя работе [13], учтем кинетику набора энергии электроном за дискретное число скачков q, определяемое выражением $q=Floor(3U_{H_{2}O}/2\hslash \omega +1)$. При этом концентрация электронов разбивается на q + 1 компонент ${\rho }_e={\sum }_{l=0}^q{\rho }_l$, каждая из которых имеет кинетическую энергию lħω. Считаем, что ионизация происходит на временах порядка 1 фс, тогда соответствующая скорость процесса k_i =1 × 10¹⁵ c⁻¹.

Кинетические уравнения для концентраций электронов  и дырок  можно записать в виде

$\frac{\partial {\rho }_0}{\partial t}={\sigma }_w{I}^n{\rho }_w+{\sigma }_{dna}{I}^{n*}{\rho }_{dna}-\sigma I{\rho }_0/\hslash \omega +2k_i{\rho }_q-k_{ea}{\rho }_w{\rho }_0-k_r{\rho }_h{\rho }_0$, (2)

$\frac{\partial {\rho }_l}{\partial t}=\sigma I({\rho }_{l-1}-{\rho }_l)/\hslash \omega -k_r{\rho }_h{\rho }_l-k_{att}{\theta }_l{\rho }_w{\rho }_l-(k_{ebd}{b}_l+k_{essb}{s}_l+k_{edsb}{d}_l){\rho }_{dna}{\rho }_l$, (3)

$\frac{\partial {\rho }_q}{\partial t}=\sigma I{\rho }_{q-1}/\hslash \omega -k_i{\rho }_q-k_r{\rho }_h{\rho }_q-(k_{ebd}{b}_q+k_{essb}{s}_q+k_{edsb}{d}_q){\rho }_{dna}{\rho }_q$, (4)

$\frac{\partial {\rho }_h}{\partial t}={\sigma }_m{I}^m{\rho }_w+k_i{\rho }_q-k_h{\rho }_w{\rho }_h$, (5)

где дополнительно учтены процессы сольватирования электронов, захват свободных электронов молекулами воды с образованием анионов H₂О‾ (величина θ_l учитывает порог по кинетической энергии 6 эВ), рекомбинация электронов и дырок, а также ударная ионизация и захват электронов на участках ДНК с образованием повреждений нуклеиновых оснований (ПО)ρ_bd, однонитевых (ОР)ρ_ssb и двунитевых (ДР)ρ_dsb разрывов цепи ДНК. Данные процессы учтены неявно путем умножения известных констант реакций k на зависящие от энергии электрона эффективные выходы продуктов b_l = f_bd(lħω), s_l = f_ssb(lħω), d_l = f_dsb(lħω), полученные по интерполированным экспериментальным данным из работы [11]. Отметим, что в соответствующих сечениях процессов имеются резонансы. Так для ДР ДНК они наблюдаются на энергиях электронов примерно 5 и 10 эВ [11].

Дырки и анионы H₂О‾ в воде достаточно быстро распадаются на различные активные продукты, которые затем вступают в диффузионно-контролируемые реакции друг с другом и с сольватированными электронами (табл. 1), что можно записать в виде следующей цепочки уравнений:

$\frac{\partial {\rho }_{H_2{O}^{-}}}{\partial t}=k_{att}{\rho }_w\sum _{l=1}^{q-1}{\theta }_l{\rho }_l-k_{H_2{O}^{-}}{\rho }_w{\rho }_{H_2{O}^{-}}$, (6)

$$\begin{gathered} \frac{\partial {\rho }_{ea}}{\partial t}=D_{ea}\Delta {\rho }_{ea}+k_{ea}{\rho }_w{\rho }_0-k_{eOH}{\rho }_{ea}{\rho }_{OH}- \\ -k_{e{H}_3{O}^{+}}{\rho }_{ea}{\rho }_{H_3{O}^{+}}-k_{e{H}_{2}O}{\rho }_{ea}{\rho }_w-k_{e{H}_2{O}_2}{\rho }_{ea}{\rho }_{H_2{O}_2}, \end{gathered}$$ (7)

$$\begin{gathered} \frac{\partial {\rho }_{H_3{O}^{+}}}{\partial t}=D_{H_3{O}^{+}}\Delta {\rho }_{H_3{O}^{+}}+k_h{\rho }_h{\rho }_w-k_{e{H}_3{O}^{+}}{\rho }_{ea}{\rho }_{H_3{O}^{+}}- \\ -k_{O{H}^{-}{H}_3{O}^{+}}{\rho }_{O{H}^{-}}{\rho }_{H_3{O}^{+}}, \end{gathered}$$ (8)

$$\begin{gathered} \frac{\partial {\rho }_{O{H}^{-}}}{\partial t}=D_{O{H}^{-}}\Delta {\rho }_{O{H}^{-}}+k_{e{H}_{2}O}{\rho }_{ea}{\rho }_0+k_{H_2{O}^{-}}{\rho }_w{\rho }_{H_2{O}^{-}}+ \\ +k_{e{H}_2{O}_2}{\rho }_{ea}{\rho }_{H_2{O}_2}-k_{O{H}^{-}{H}_3{O}^{+}}{\rho }_{O{H}^{-}}{\rho }_{H_3{O}^{+}}, \end{gathered}$$ (9)

$$\begin{gathered} \frac{\partial {\rho }_H}{\partial t}=D_H\Delta {\rho }_H+k_{e{H}_3{O}^{+}}{\rho }_{ea}{\rho }_{H_3{O}^{+}}+k_{OH{H}_2}{\rho }_{OH}{\rho }_{H_2}- \\ -k_H{{\rho }_H}^2-k_{HOH}{\rho }_H{\rho }_{OH}-k_{eH}{\rho }_{ea}{\rho }_H, \end{gathered}$$ (10)

$$\begin{gathered} \frac{\partial {\rho }_{OH}}{\partial t}=D_{OH}\Delta {\rho }_{OH}+k_h{\rho }_h{\rho }_w+k_{e{H}_2{O}_2}{\rho }_{ea}{\rho }_{H_2{O}_2}+ \\ +k_{H_2{O}^{-}}{\rho }_w{\rho }_{H_2{O}^{-}}-k_{eOH}{\rho }_{ea}{\rho }_{OH}-k_{OH}{{\rho }_{OH}}^2- \\ -k_{HOH}{\rho }_H{\rho }_{OH}-k_{OH{H}_2}{\rho }_{OH}{\rho }_{H_2}- \\ -(k_{OHbd}+k_{OHssb}+k_{OHdsb}{\rho }_{OH}){\rho }_{dna}{\rho }_{OH}, \end{gathered}$$ (11)

$$\begin{gathered} \frac{\partial {\rho }_{H_2}}{\partial t}=D_{H_2}\Delta {\rho }_{H_2}+k_H{{\rho }_H}^2+k_{e{H}_{2}O}{\rho }_{ea}{\rho }_0+ \\ +k_{H_2{O}^{-}}{\rho }_w{\rho }_{H_2{O}^{-}}-k_{OH{H}_2}{\rho }_{OH}{\rho }_{H_2}, \end{gathered}$$ (12)

$\frac{\partial {\rho }_{H_2{O}_2}}{\partial t}=D_{H_2{O}_2}\Delta {\rho }_{H_2{O}_2}+k_{OH}{{\rho }_{OH}}^2-k_{e{H}_2{O}_2}{\rho }_{ea}{\rho }_{H_2{O}_2}$. (13)

Полученная система учитывает как прямые процессы диссоциации связей в воде и ДНК при ионизации и захвате электронов молекулами, так и химические реакции с продуктами радиолиза, которые в свою очередь будут приводить к образованию поврежденных участков ДНК (табл. 1). Как известно, наибольший вклад в последнем случае вносят •OH радикалы [9], поэтому остальными реакциями можно пренебречь.

РАСЧЕТ КОЛИЧЕСТВА ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК

Чтобы перейти к непосредственному расчету отмеченных выше типов повреждений ДНК и замкнуть систему (1)—(13) дополним её следующими уравнениями:

$\frac{\partial {\rho }_{bd}}{\partial t}=k_{ebd}{\rho }_{dna}\sum _{l=1}^q{b}_l{\rho }_l+k_{OHbd}{\rho }_{dna}{\rho }_{OH}$, (14)

$\frac{\partial {\rho }_{ssb}}{\partial t}=k_{essb}{\rho }_{dna}\sum _{l=1}^q{s}_l{\rho }_l+k_{OHssb}{\rho }_{dna}{\rho }_{OH}$, (15)

$\frac{\partial {\rho }_{dsb}}{\partial t}=k_{edsb}{\rho }_{dna}\sum _{l=1}^q{d}_l{\rho }_l+k_{OHdsb}{\rho }_{dna}{{\rho }_{OH}}^2$. (16)

Геометрия биологической среды, в которой распространяется импульс, может быть весьма сложной, что требует учета локальных неоднородностей показателя преломления, поглощения и распределения молекул-мишеней, в первую очередь интересующий нас генетический материал в виде ДНК, расположенный в ядре клеток.

Для простейшего анализа наилучшим образом подходят эксперименты с монослоями клеточных культур, когда лазерный импульс может быть сфокусирован в тонкий образец при прохождении оптической схемы флуоресцентного микроскопа, через которую в дальнейшем проводится анализ биологических эффектов [2—6]. На пространственном масштабе порядка размера ядра клетки ~20 мкм поле импульса в фокусе можно с хорошей степенью точности считать заданным [3].

Приведем характерные оценки. Для определенности рассмотрим клетки фибробластов с характерными размерами ядра эллиптической формы 14 × 14 × 5 мкм. При размере генома 6.4 × 10⁹ пар нуклеотидов (п. н.) концентрация ДНК в модели составит 1.2 × 10²⁵ м⁻³. В работе [14] при длительностях импульсов с длиной волны 0.73 мкм и длительностью 180 фс, сфокусированных до 0.5 мкм и пиковой интенсивности 0.8 ТВт/см² в клетках фибробластов, была получена приближенная оценка порядка 70 ДР ДНК на филамент. Расчет по теоретической модели дает 103 ДР ДНК при распространении вдоль длинной оси эллипсоида и 36 ДР ДНК при распространении вдоль короткой оси эллипсоида. При усреднении по произвольной ориентации клеток расчетные оценки практически совпадают с экспериментальной оценкой.

Для простоты считаем, что филамент формируется вдоль длинной полуоси эллипса при фокусировке импульса с гауссовым пространственно-временным распределением интенсивности. Тогда, проинтегрировав систему (2)—(16) с заданным начальным условием по интенсивности импульса, можно произвести расчет характерных выходов повреждений ДНК на одну клетку.

На рис. 1 приведены зависимости выходов ПО, ОР и ДР ДНК в клетках фибробластов от пиковой интенсивности лазерного импульса с длиной волны 0.8 мкм в сформированном филаменте при длительности и радиусе, величины которых заданы, соответственно, 100 фс и 1 мкм. Количество ДР ДНК относительно других более простых для последующей репарации типов повреждений, таких как ОР и ПО, растет с увеличением интенсивности и длительности импульса.

Рис. 1. Расчет количества основных типов повреждений ДНК на один филамент в клетке в зависимости от пиковой интенсивности импульса длиной волны 0.8 мкм, длительностью 100 фс и поперечным радиусом 1 мкм. Сплошная линия — повреждения оснований, пунктир — однонитевые разрывы, штриховая линия — двунитевые разрывы ДНК

С уменьшением длины волны, при одинаковой интенсивности больше ДР ДНК формируется на более коротких длинах волн (рис. 2), как и наблюдается в экспериментах [4, 15]. Это, очевидно, обусловлено тем, что число фотонов, затрачиваемое на фотоионизацию в этих случаях будет меньше.

Рис. 2. Расчет количества ДР ДНК на один филамент в клетке в зависимости от пиковой интенсивности импульса длительностью 100 фс и поперечным радиусом 1 мкм при различных длинах волн: 0.6 мкм (сплошная линия), 0.8 мкм (пунктир), 1 мкм (штриховая линия)

Отметим также, что с ростом интенсивности на разных длинах волн наблюдается неодинаковая скорость прироста количества повреждений ДНК. Это связано с вкладами разных механизмов в формирование повреждений. В видимом диапазоне в филаменте преобладают электроны с относительно малой кинетической энергией, которые либо дают простые повреждения, либо термализуются. В случае же ИК-диапазона фотоэлектроны в поле импульса успевают набрать кинетическую энергию, достаточную для ударной ионизации, и вклад лавинной ионизации в формирование повреждений ДНК начинает доминировать над фотоионизацией. Эта смена механизмов становится еще более выраженной с увеличением длительности импульса. Увеличение плотности электронов в филаменте ведет также к усилению выхода свободных радикалов и повышению вклада повреждений за счет химических реакций.

Следует отметить потенциальную возможность реализации режима стабилизации филамента и в объемной среде небольшой толщины (суспензии). В этом случае будет происходить самофокусировка импульса, которая может быть скомпенсирована процессами дифракции и нелинейной рефракции на плазменной нелинейности, что может привести к формированию оптических пуль. В этом случае из уравнения (1) можно приближенно определить параметры импульса в режиме квазистабилизации [16]. Более детальное рассмотрение модели подобных экспериментов выходит за рамки настоящей работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе предложена биофизическая модель для описания процессов в лазерных филаментов, порожденных интенсивными фемтосекундными импульсами видимого и ближнего ИК диапазонов в живых клетках. На ее основе оценен выход различных типов повреждений ДНК в монослое культуры клеток фибробластов.

Вклад в формирование двунитевых разрывов ДНК, оказывающих наибольшее влияние на жизнеспособность клеток, определяется двумя типами процессов. Первый процесс доминирует с увеличением длины волны (ИК диапазон) за счет приобретения первичными фотоэлектронами в поле импульса достаточной кинетической энергии, достаточной для захвата или выбивания вторичного электрона, что в дальнейшем ведет к диссоциации связей. Второй процесс будет преобладать с уменьшением длины волны (коротковолновая часть видимого диапазона). В этом случае электроны приобретают меньшую кинетическую энергию, более эффективно термализуются и рекомбинируют, а молекулярные повреждения происходят преимущественно в ходе диффузионно-контролируемых химических реакций с продуктами радиолиза воды. По указанным причинам относительная доля более простых повреждений (однонитевые разрывы и поврежденные основания) будет уменьшаться с ростом длины волны импульса. С другой стороны, абсолютное количество повреждений ДНК при заданной интенсивности будет больше на коротких длинах волн в связи с меньшим числом фотонов, затрачиваемых на единичный акт фотоионизации.

Отмеченные особенности взаимодействия лазерных импульсов с клетками могут быть использованы при изучении механизмов радиочувствительности нормальных и опухолевых клеток, путей репарации радиационных повреждений ДНК, а также действия радиозащитных препаратов как более доступная альтернатива источникам плотно-ионизирующих излучений, формирующих трековые структуры, таких как ускоренные протоны и многозарядные ионы.