Экспрессия эффекторов апоптоза, аутофагии и некроптоза в клетках гиппокампа крыс после избыточного потребления F-

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

В работе исследовали экспрессию маркеров апоптоза, аутофагии и некроптоза в клетках гиппокампа крыс после длительного потребления избыточных доз F- на уровне транскрипции и трансляции. Самцы крыс Wistar были разделены на 4 группы, получавшие 0.4 (контроль), 5, 20 и 50 мг/л F- (в виде NaF) в течение 12 месяцев. Изменения содержания эффекторов митохондриального (Bcl-2, Bax, каспазы-9, каспазы-3) и рецепторного (каспазы-8, Fas) путей апоптоза, посредников (Ulk-1, Beclin-1) и модуляторов (AMPK, Akt, mTOR) аутофагии, а также некроптоза (RIP и MLKL) в клетках оценивали методом иммуноблоттинга, экспрессию генов (Bcl2, Bax, Casp3, Ulk1, Beclin1, Prkaa1, Akt и mTor) – методом ПЦР в реальном времени. В гиппокампе животных, подвергавшихся действию F-, снижалось соотношение экспрессии генов Bcl2/Bax и белков Bcl-2/Bax, активировались каспаза-9 и каспаза-3, однако уровень каспазы-8 и мембранного рецептора Fas оставался стабильным. Длительное потребление F- не оказало влияния на содержание инициаторного белка аутофагии Ulk-1 и протеинкиназ AMPK, Akt и mTOR, но привело к ингибированию ключевого посредника аутофагии Beclin-1. Уровни экспрессии эффекторов некроптоза RIP и MLKL также не изменялись в клетках гиппокампа крыс, получавших избыток F-. Таким образом, длительное воздействие F- сопровождалось активацией апоптоза, преимущественно по митохондриальному пути, на фоне подавления аутофагии.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Соединения фтора (F) очень широко распространены в окружающей среде вследствие выброса в атмосферу и воду из природных и антропогенных источников [1, 2]. В регионах, где концентрация F- в воде, доступной для повседневного использования населением, превышает предельно допустимый уровень (1.5 мг/л), проживают около 300 миллионов человек. Такие регионы есть и на территории России [3]. За исключением чая и морской рыбы, содержание F- в пищевых продуктах незначительно, поэтому основным путем его поступления в организм человека и животных является вода [2, 4, 5]. В развитых странах большой вклад в потребление F- человеком вносит его намеренное добавление в питьевую воду, молоко, соль, а также стоматологическую продукцию и препараты для лечения остеопороза [1, 4, 6]. Случаи хронических или острых отравлений F- регистрируются на промышленных предприятиях по производству металлов, топлива и удобрений, на сельскохозяйственных предприятиях, интенсивно применяющих пестициды и фосфатные удобрения, при использовании угля для отопления и чистящих средств в быту. В результате поступление F- в организм может быть бесконтрольным и приводить к развитию флюороза – дегенеративного заболевания зубной и костной тканей [4, 7].

Однако в последние десятилетия появилось достаточно много работ о негативном влиянии F- на другие системы организма, в том числе о патологических изменениях в ЦНС. Обладая способностью проникать через гематоэнцефалический барьер, F- накапливается в различных отделах мозга и провоцирует множество неврологических и когнитивных расстройств [8–10]. Клинические обследования населения, проживающего в районах эндемического флюороза, выявили изменения локомоторной активности, ухудшение памяти и интеллектуальных способностей у взрослых, нарушение формирования памяти, дефицит абстрактного мышления и снижение среднего уровня IQ у детей. В тканях мозга экспериментальных животных, подверженных воздействию F-, были описаны многочисленные патологические процессы, в частности, нарушение синаптической передачи вследствие изменения синтеза нейротрансмиттеров, активности синаптических белков и молекул внутриклеточных сигнальных каскадов, участвующих в процессах формирования памяти, экспрессии транскрипционных и нейротрофических факторов, необходимых для поддержания жизнеспособности и функционирования нейронов, и повреждения структурных компонентов цитоскелета [8–10]. Все это ставит под сомнение необходимость широкого применения фтора для профилактики заболеваний зубов и показывает необходимость пересмотра его предельно допустимых доз.

В наших предыдущих работах в гиппокампе крыс, потреблявших избыточные дозы F- в течение длительного времени, были выявлены снижение когнитивных способностей, активация Са2+-зависимых сигнальных молекул, патоморфологические изменения и снижение численной плотности нейронов [11, 12]. Процессы гибели нейронов строго регулируются сложной сетью сигнальных путей, активирующихся в ответ на множество стрессовых стимулов и включающих изменения экспрессии генов и активности цитоплазматических белков-посредников [13, 14]. Ранее было описано, что патологические изменения, наблюдающиеся в тканях мозга при различных нейродегенеративных заболеваниях, запускают несколько разных механизмов гибели клеток, включая апоптоз, аутофагию и некроптоз [14–17]. Какой путь гибели будет активироваться в данных конкретных условиях, зависит от типа и интенсивности стрессового воздействия и соотношения активности внутриклеточных посредников различных сигнальных каскадов. Поэтому в данном исследовании были проанализированы изменения экспрессии инициаторов и эффекторов различных путей гибели клеток: митохондриального (Bax, Bcl-2, каспазы-9, каспазы-3) и рецепторного (каспазы-8, Fas) путей апоптоза, аутофагии (AMPK, Akt, mTOR, Ulk-1, Beclin-1) и некроптоза (MLKL, RIP) в клетках гиппокампа крыс после длительного потребления F-.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные. Для работы использовали 40 самцов крыс Wistar, полученных из вивария Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН. Животные содержались в стандартных условиях с температурой воздуха 22–25 °C и циклом освещение/темнота 12 ч/12 ч, получая корм из натуральных ингредиентов с низким содержанием F- и воду ad libitum.

В 6-недельном возрасте крысы были произвольно разделены на 4 группы по 10 особей в каждой. Животные из контрольной группы получали обычную воду с фоновым содержанием 0.2–0.4 мг F-/л. Крысам из других групп добавляли в воду 5 мг F-/л (11.05 мг NaF/л воды), 20 мг F-/л (44.2 мг NaF/л) и 50 мг F-/л (110.5 мг NaF/л). Длительность эксперимента составила 12 месяцев. Дозы NaF, выбранные для работы, позволили получить такие уровни F- в плазме крови крыс [18], которые сопоставимы с концентрациями F- в плазме крови людей, потребляющих воду с содержанием F- в диапазоне оптимальной и предельно допустимой концентраций (5 мг/л) или проживающих в регионах эндемического флюороза (20 и 50 мг/л) [19], учитывая более высокую (в среднем в 5 раз) скорость выведения F- из организма крыс.

Крыс выводили из эксперимента рассечением брюшной аорты после внутрибрюшинной анестезии Золетилом-100 (100 мг/кг массы тела). Мозг разрезали по продольной щели больших полушарий, из каждой части извлекали гиппокамп и сразу же замораживали его на сухом льду. Правый гиппокамп использовали для ПЦР анализа, левый – для иммуноблоттинга. До анализа пробы хранили при –80 °С.

ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией. Для выделения суммарной РНК из гиппокампа 0.5 мг ткани гомогенизировали с 1 мл реагента ExtractRNA (Евроген, Россия). Гомогенаты центрифугировали при 4 °C и 12000 g в течение 10 мин, супернатант смешивали с хлороформом (0.2 мл на 1 мл раствора ExtractRNA), смесь инкубировали в течение 5–6 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 4 °C и 12000 g в течение 15 мин. К водной фазе, содержащей РНК, добавляли изопропанол (0.5 мл на 1 мл раствора ExtractRNA), инкубировали 10 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 4 °C и 12000 g в течение 10 мин. Осадок промывали 75 %-ным этиловым спиртом, перерастворяли в dH2O и хранили при –80 °C. Общее содержание РНК в пробах (260 нм) и чистоту (260/280 нм) оценивали с помощью спектрофотометра NanoPhotometer–N50 (IMPLEN, Германия). Коэффициент поглощения при 260/280 нм превышал 1.8 во всех образцах, что указывало на их высокую чистоту.

Для синтеза кДНК путем обратной транскрипции 1 мкг РНК смешивали с 1 мкл смеси случайных декануклеотидных праймеров (Random(dN)10-primer), инкубировали 2 мин при 75 °C и останавливали реакцию на льду. К смеси добавляли 4 мкл Storage Buffer 5х (Евроген, Россия), 2 мкл смеси дезоксинуклеотидов (dNTP), 2 мкл дитиотреитола (DTT), 2 мкл деионизированной воды (dH2O) и 1 мкл MMLV ревертазы из набора MMLV RT (Евроген, Россия). Смесь инкубировали в течение 5 мин при 25 °C, 60 мин при 42 °C и 5 мин при 70 °C. Полученную кДНК разбавляли в 10 раз dH2O и хранили при –20 °C.

Реакции ПЦР проводили на термоциклере C1000 Touch с блоком обнаружения CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc., CA, США). Реакционная смесь общим объемом 25 мкл содержала 17 мкл dH2O, 5 мкл qPCRmix-HS SYBR Master Mix (Евроген, Россия), по 1 мкл прямого и обратного праймеров (10 нМ) и 1 мкл раствора исследуемого образца кДНК. Программа амплификации состояла из начальной денатурации при 95 °C (5 мин) и 45 циклов амплификации, каждый из которых включал этап денатурации при 95 °C (5 с), этап отжига при 57–63 °C (10–50 с) и этап элонгации при 72 °C (30 с).

Результаты ПЦР анализировали с помощью программного обеспечения CFX Manager. Специфичность амплификации определяли по количеству пиков кривых плавления. Для этого ампликоны подвергали термической денатурации, включающей инкубацию при 65 °C (5 с) и медленное нагревание до 95 °C, после чего измеряли флуоресценцию. Все реакции проводили в трех повторах. Все гены также анализировали без ДНК-матрицы.

Последовательности использованных праймеров (синтезированных компанией «Евроген», Россия) представлены в табл. 1. Для анализа были отобраны пары праймеров, имеющие эффективность амплификации, близкую к идеальному значению 2, и коэффициент корреляции 0.98 или выше. Температура плавления была оптимизирована с помощью программы Primer Blast tool (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Содержание GC составляло 40–60 %, размер продукта был ограничен 70–250 парами оснований. Эффективность амплификации рассчитывали по формуле E = 10(1/ α), где α – угол наклона стандартной кривой.

 

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных для ПЦР в реальном времени

Ген

Номер NCBI

Последовательность праймеров

Bcl2

NM_016993.2

Прямой: GGTGAACTGGGGGAGGATTG

Обратный: GCATGCTGGGGCCATATAGT

Bax

NM_017059.2

Прямой: TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG

Обратный: GTCCAGCCCATGATGGTTCT

Casp3

NM_012922.2

Прямой: AACGGACCTGTGGACCTGAA

Обратный: TCAATACCGCAGTCCAGCTCT

Becn1

NM_001034117.1

Прямой: AGCACGCCATGTATAGCAAAGA

Обратный: GGAAGAGGGAAAGGACAGCAT

Prkaa1

NM_019142.2

Прямой: AAACCCACAGAAATCCAAACAC

Обратный: CCTTCCATTCATAGTCCAACTG

Akt1

NM_033230.3

Прямой: CTCATTCCAGACCCACGAC

Обратный: ACAGCCCGAAGTCCGTTA

Mtor

NM_019906.2

Прямой: AGAACCTGGCTCAAGTACGC

Обратный: AGGATGGTCAAGTTGCCGAG

Eef1a1

NM_175838.1

Прямой: CTCCACTTGGTCGTTTTGCTG

Обратный: GCAGACTTGGTGACTTTGCC

Ppia

NM_017101.1

Прямой: AGGATTCATGTGCCAGGGTG

Обратный: CTCAGTCTTGGCAGTGCAGA

 

Относительную экспрессию целевых генов оценивали методом 2-ΔΔCT. В качестве референсных генов были выбраны Ppia и Eef1a1, для валидации использовали программу RefFinder, как описано ранее [20]. 

Иммуноблоттинг

Гиппокампы гомогенизировали в буфере, содержащем 150 мМ NaCl, 50 мМ Tris/HCl (pH 7.6), Triton X-100 (0.1 %), ингибиторы протеаз (P8340, Sigma-Aldrich, США) и фосфатаз (1 мМ Na3VO4 2 H2O и 1 мМ Na2-EDTA). Гомогенаты центрифугировали при 1000 g в течение 15 мин для удаления неразрушенных клеток, аликвоты супернатантов отбирали для дальнейшей работы, а оставшуюся часть центрифугировали при 11000 g в течение 15 мин. Полученные супернатанты замораживали при –80 °С до анализа. Общее содержание белка в пробах оценивали методом Лоури.

Полученные пробы гомогенатов гиппокампа смешивали с буфером Лэммли и нагревали при 90 °С в течение 10 мин для денатурации белков. Методом SDS-PAGE электрофореза белки в пробах разделяли по молекулярной массе, используя гели с 7.5, 10 % или 12 % акриламида. После разделения белки переносили из гелей на нитроцеллюлозные мембраны (GE Health Care/Life Sciences, Великобритания), неспецифическое связывание которых в течение часа блокировали 5 %-ным раствором обезжиренного молока в буфере TТBS (150 мМ NaCl, 20 мМ Tris-HCl, 0.1 % Tween-20). Затем мембраны инкубировали в течение ночи с первичными антителами к тестируемым белкам. В работе использовали кроличьи антитела производства Cell Signaling (США) – Bcl-2 (D17C4) (1: 500, #3498), Bax (1: 500, #2772), Cleaved Caspase-9 (Asp353) (1: 200, #9507), Caspase-3 (D3R6Y) (1: 500, #14220), Cleaved caspase-3 (Asp175) (5A1E) (1: 200, #9664), Caspase-8 (D35G2) (1: 500, #4790), Ulk-1 (D8H5) (1: 500, #8054), Beclin-1 (D40C5) (1: 500, #3495), Phospho-Beclin-1 (Ser30) (E1C4X) (1: 200, #35955), AMPKα (D5A2) (1: 500, #5831), Akt (pan) (C67E7) (1: 500, #4691), RIP (D94C12) (1: 750, #3493), MLKL (D2I6N) (1: 750, #14993); BioVision (США) – Fas (1: 1000, #3070R) и Sigma-Aldrich (США) – mTOR (1: 500, # SAB4501038), а также мышиные антитела Cell Signaling к Caspase-9 (C9) (1: 1000, #9508) и Cleaved Caspase-8 (Asp384) (11G10) (1: 200, #9748). В качестве вторичных использовали анти-кроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (1: 1000, GE Health Care/Life Sciences, Великобритания). Иммунопозитивный сигнал визуализировали с помощью набора хемилюминесцентных растворов ECL (GE Health Care/Life Sciences, Великобритания), используя рентгеновскую пленку и проявочные растворы фирмы CEA (Швеция). Для нормализации экспрессии изучаемых белков мембраны инкубировали с первичными антителами мыши или кролика к GAPDH (1: 1000, sc-32233, sc-166545, sc-25778) производства Santa Cruz Biotechnology (США). Денситометрический анализ экспрессии белков проводили с помощью программы ImageJ program (NIH, США).

Результаты экспериментов анализировали в программе GraphPad Prism 8.1 (San Diego, CA, США), нормальность распределения оценивали с помощью критерия Shapiro-Wilk, для проверки выборок на выбросы использовали критерий ROUT (α = 0.05). Статистически значимые различия определяли с помощью алгоритмов ANOVA и апостериорного теста Dunnet’s. Различия считались достоверными при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспрессия посредников митохондриального и рецепторного путей апоптоза в клетках гиппокампа крыс

Для анализа влияния избыточного потребления F- на экспрессию посредников митохондриального каскада апоптоза были выбраны белки семейства Bcl-2 (Bcl-2 и Bax), инициаторная каспаза-9 и эффекторная каспаза-3.

Уровень мРНК гена Bcl2, кодирующего антиапоптотический белок Bcl-2, в клетках гиппокампа крыс, получавших F-, не изменялся по сравнению с таковым у животных, получавших воду с нормальным содержанием F-. Экспрессия гена Bax, кодирующего проапоптотический белок Bax, напротив, статистически значимо увеличивалась в гиппокампе животных из всех групп, подверженных действию F- (рис. 1a). Содержание белка Bcl-2 снижалось по сравнению с контролем в клетках гиппокампа животных, потреблявших 20 и 50 мг/л F-. Наоборот, уровень экспрессии белка Bax увеличивался в гиппокампе крыс, получавших все три дозы F- (рис. 1b, c). Такие изменения привели к снижению соотношения между экспрессией антиапоптотического и проапоптотического маркеров этого семейства как на уровне транскрипции (рис. 1d), так и на уровне трансляции (рис. 1e).

 

Рис. 1. Изменения экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 и проапоптотического белка Bax в гиппокампе крыс после воздействия F- на уровне транскрипции и трансляции. (a) – Уровни экспрессии генов Bcl2 и Bax в клетках гиппокампа, нормализованные по отношению к экспрессии пары референсных генов Eef1a1+Ppia (средние значения ± SE, n = 7–9). (b) – Репрезентативные иммуноблоты для одной крысы из каждой группы. (c) – Среднее содержание белков Bcl-2 и Bax ± SE в клетках гиппокампа, рассчитанное по отношению к оптической плотности референсного белка GAPDH (n = 7). (d) – Отношение экспрессии генов Bcl-2 и Bax. (e) – Соотношение уровней белка Bcl-2 и Bax. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 по сравнению с контрольной группой (Con).

 

Средний уровень нативной формы каспазы-9 с молекулярной массой 51 kDa был низким в цитоплазме клеток гиппокампа контрольных животных, однако он повышался в гиппокампе крыс из всех групп, получавших избыток фтора (рис. 2a, b). Кроме того, в гиппокампе животных, получавших 20 и 50 мг/л F-, наблюдалось увеличение содержания зрелой формы каспазы-9 с молекулярной массой 38 kDa (рис. 2a, b). Такие процессы приводят к изменению соотношения уровней экспрессии прокаспазы-9, не обладающей протеолитической активностью, и активной каспазы-9, принимающей участие в реализации программы апоптоза.

 

Рис. 2. Уровень каспазы-9 в гиппокампе крыс, потреблявших избыток F-. (a) – Типичные примеры иммуноблотов нативной формы каспазы-9 и активной каспазы-9 для одной крысы из каждой экспериментальной группы. (b) – Среднее содержание ± SE двух форм каспазы-9, нормализованное по GAPDH (n = 5). * p < 0.05, *** p < 0.001 по сравнению с контролем.

 

Экспрессия гена Casp-3, кодирующего один из ключевых посредников апоптоза – каспазу-3, была сравнима в клетках гиппокампа крыс из всех экспериментальных групп (рис. 3a). Однако содержание этой эффекторной молекулы изменялось на уровне белка. В гиппокампе контрольных животных практически весь клеточный пул каспазы-3 был представлен ее протеолитически неактивной проформой с молекулярной массой 32 kDa, однако у крыс, получавших 20 и 50 мг/л F-, уровень этой нативной формы достоверно снижался (рис. 3b, c). В противоположность этому в клетках гиппокампа крыс из контрольной группы определялись лишь небольшие количества активной каспазы-3 с молекулярной массой 17 kDa, но воздействие 5, 20 и 50 мг/л F- привело к значительному увеличению ее содержания. Такие изменения уровней экспрессии прокаспазы-3 и активной каспазы В привели к смещению соотношения в сторону последней (рис. 3d) и подтверждают стимуляцию процессов апоптоза.

 

Рис. 3. Стимуляция каспазы-3 в гиппокампе крыс, потреблявших избыток F-. (a) – Уровни Casp3 мРНК в клетках гиппокампа крыс всех экспериментальных групп (средние значения ± SE, n = 8–10). (b) – Типичные примеры иммуноблотов нативной формы каспазы-3 и активной каспазы-3 для одной крысы из каждой экспериментальной группы. (c) – Среднее содержание ± SE двух форм каспазы-3, нормализованное по GAPDH. (d) – Изменения соотношения уровней прокаспазы-3 и активной каспазы-3 (n = 6). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 по сравнению с контролем.

 

Однако длительное воздействие избыточных доз F⁻ на организм крыс не оказало влияния на уровень белка одного из ключевых компонентов рецепторного пути апоптоза – каспазы-8 в клетках гиппокампа (рис. 4a, b). Содержание мембранного рецептора Fas в гиппокампе крыс, получавших избыточные дозы F-, было сравнимо с таковым у контрольных животных (рис. 4a, b).

 

Рис. 4. Экспрессия на уровне белка двух форм каспазы-8 и рецепторов Fas в клетках гиппокампа крыс после длительного воздействия F-. (a) – Пример иммуноблотов для одного животного из каждой группы. (b) – Среднее содержание белков каспазы-8 и Fas ± SE в клетках, рассчитанное по отношению к содержанию референсного белка GAPDH (n = 4).

 

Таким образом, длительное потребление крысами избыточных доз F- сопровождается активацией эффекторов митохондриального, но не рецепторного пути апоптоза.

Экспрессия посредников аутофагии в клетках гиппокампа крыс, получавших избыточные дозы F⁻

В клетках гиппокампа крыс, получавших избыток F⁻, содержание белка Ulk-1, который принимает сигналы от разнообразных внутриклеточных протеинкиназ, регулирующих процессы клеточного метаболизма, и таким образом функционирует как инициатор аутофагии, не изменялось по сравнению с таковым у контрольных крыс (рис. 5a). Однако длительное воздействие всех экспериментальных доз F- привело к изменению экспрессии гена Beclin1, кодирующего белок Beclin-1, который играет важнейшую роль в процессе формирования и созревания фагофора (рис. 5b). В гиппокампе крыс, потреблявших 20 и 50 мг/л F-, также снижались уровни нативной и фосфорилированной форм этого ключевого посредника аутофагии (рис. 5c).

 

Рис. 5. Экспрессия посредников аутофагии в гиппокампе крыс, подверженных воздействию F-. (a) – Типичные иммуноблоты и средние уровни ± SE белка ULK-1 в клетках гиппокампа крыс, получавших разные дозы F- (n = 7). (b) – Изменения экспрессии гена Beclin1 в гиппокампе животных, получавших избыток F-, на уровне транскрипции (n = 6). (c) – Изменения содержания белка Beclin-1 в гиппокампе животных после длительного потребления F- (n = 6). Показаны типичные иммуноблоты для одного животного из каждой группы и средние значения ± SE нативной и фосфорилированной форм (Ser30) Beclin-1. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, # p < 0.0001 по сравнению с контролем.

 

Длительное потребление крысами избыточных доз F- также не оказало влияния на уровни мРНК и белка некоторых внутриклеточных модуляторов аутофагии – киназы AMPK, функционирующей как энергетический сенсор клеток и напрямую фосфорилирующей белок Ulk-1, киназы Akt – посредника сигнального пути PI3K/Akt, регулирующего рост и выживание клеток, и киназы mTOR, предотвращающей взаимодействие Ulk1 и АМРК (рис. 6).

 

Рис. 6. Экспрессия модуляторов аутофагии AMPK, Akt и mTOR в гиппокампе крыс, получавших избыток F-, на уровне транскрипции и трансляции. (a) – Уровни экспрессии генов Prkaa1, Akt и mTOR в клетках гиппокампа крыс. (b) – Репрезентативные иммуноблоты для одного животного из каждой группы. (c) – Средние значения ± SE содержания AMPK, Akt и mTOR на уровне белка (n = 5).

 

Влияние избыточного потребления F- крысами на экспрессию посредников некроптоза в гиппокампе крыс

Экспрессия исследуемых посредников некроптоза – белков RIP и MLKL также не изменялась в клетках гиппокампа крыс, получавших избыток фтора (рис. 7).

 

Рис. 7. Уровни белков RIP и MLKL в гиппокампе крыс, получавших разные дозы F-. (a) – Показательные иммуноблоты для одного животного из каждой группы. (b) – Средние значения содержания ± SE белков RIP и MLKL в клетках гиппокампа (n = 5).

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты данного исследования показали, что длительное потребление крысами избыточных количеств F- привело к изменениям экспрессии маркеров гибели клеток, функционирующих как регуляторы митохондриального пути апоптоза, в частности, к снижению уровня антиапоптотического белка Bcl-2, но активации проапоптотического белка Bax, инициаторной каспазы-9 и эффекторной каспазы-3 (рис. 1–3). Однако воздействие F- не оказало влияния на экспрессию каспазы-8 и мембранных рецепторов Fas – важнейших эффекторов рецепторного пути апоптоза (рис. 4).

Апоптоз представляет собой многоступенчатый и хорошо контролируемый тип клеточной гибели, играющий ключевую роль в процессах разрушения и утилизации поврежденных или лишних клеток как в ходе нормального физиологического развития и роста организма, так и при патологических состояниях [13–15]. Семейство Bcl-2 (B-cell lymphoma/leukemia-2) включает в себя несколько белков, функционирующих как активаторы каспаз [21, 22]. Располагаясь на внешней мембране митохондрий, Bcl-2 связывает проапоптотические белки (в том числе Bax), таким образом подавляя их активность и обеспечивая целостность мембраны. Если уровень Bcl-2 снижается, Bax олигомеризуется и образует поры на внешней мембране митохондрий, что увеличивает ее проницаемость и приводит к выходу нескольких белков, включая цитохром С, из межмембранного пространства в цитоплазму клеток. Эти и множество других летальных стимулов, формирующихся внутри клеток или на их мембранах, последовательно стимулируют инициаторные (каспазы-2, -8, -9, -10, -12) и эффекторные (каспазы-3, -6 и -7) каспазы – цистеиновые протеазы, участвующие в протеолитическом расщеплении клеточных субстратов и разрушении клеточных компонентов [23, 24]. Таким образом, белки Bcl-2 и каспазы являются ключевыми игроками сигнальных каскадов митохондриального каскада апоптоза.

Апоптотическая трансформация клеток мозга экспериментальных животных, подверженных действию F-, и клеток нейрональных линий, культивируемых в присутствии высоких концентраций F-, была описана в нескольких работах ранее [25, 26]. Например, число апоптотических клеток увеличивалось в поле гиппокампа СА3 18-дневных эмбрионов и крысят первых 28 дней жизни, чьи матери потребляли 45–50 мг/л F- в период гестации и лактации [27, 28]. Повышенный уровень апоптоза также наблюдался в гиппокампе или целом мозге взрослых крыс, подвергавшихся воздействию 50–100 мг/л NaF в течение 6 месяцев [28–31]. Гибель клеток микроглии была описана у крыс, потреблявших 60–120 мг/л F- в течение 10 недель [32]. Развитие апоптоза сопровождалось ингибированием активности белка Bcl-2, но увеличением экспрессии белка Bax, каспазы-12, каспазы-9, каспазы-3, высвобождением PARP и цитохрома С как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции [27, 31, 32]. Снижение экспрессии Bcl-2, но стимуляция Bax и каспазы-3 были выявлены и в клетках нейробластомы линий PC12 и SH-SY5Y, культивируемых с NaF [33, 34].

Одновременно со стимуляцией эффекторов апоптоза в клетках гиппокампа крыс, потреблявших избыток F- в течение года, наблюдалось ингибирование ключевого посредника аутофагии Beclin-1 (рис. 5), хотя экспрессия инициаторного белка аутофагии Ulk-1 (рис. 5) и его модуляторов AMPK, Akt и mTOR (рис. 6) не изменялась. Аутофагия представляет собой сложный катаболический процесс, характеризующийся формированием аутофагосом, доставляющих поврежденные белки и органеллы к лизосомам, что приводит к образованию аутолизосом с последующей деградацией и утилизацией содержимого [14, 15]. Аутофагия обычно активируется в ответ на недостаток питательных веществ, а нарушение ее процессов в клетках мозга часто наблюдается при различных нейродегенеративных заболеваниях [16, 17]. Каскад киназ PI3K/Akt/mTOR (phosphoinositide 3-kinase/Akt kinase/mammalian target of rapamycin) является одним из важнейших сигнальных путей, контролирующих такие клеточные функции, как пролиферация, рост, метаболизм и выживание [35]. Белок Ulk-1 критически необходим для ранних этапов биогенеза аутофагосом и играет центральную роль в индукции аутофагии, запуская каскад фосфорилирования нижестоящих эффекторов в составе белковых комплексов. Протеинкиназа AMPK фосфорилирует Ulk-1 по нескольким аминокислотным остаткам, включая Ser317, Ser555 и Ser777, в то время как mTOR фосфорилирует Ulk-1 по Ser757 и нарушает взаимодействие между Ulk-1 и AMPK. В свою очередь, Ulk-1 фосфорилирует ключевой посредник аутофагии – Beclin-1, который локализуется около митохондрий и в нормальных клетках ингибирует этот тип клеточной гибели, образуя комплексы с антиапоптотическими белками Bcl-2 и Bcl-xL [36–38]. Однако стрессовые стимулы приводят к диссоциации Beclin-1 от Bcl-2 вследствие конкурентного взаимодействия Bcl-2 и Bax. Активный свободный Beclin-1 вместе с киназой PI3K запускает формирование и созревание фагофора. Если же уровень Bcl-2 в клетках снижается, Beclin-1 деактивируется и начинается процесс апоптоза. Таким образом, кинетика взаимодействия Beclin-1 и Bcl-2 является одним из основных факторов выбора клеток между аутофагией и апоптозом.

В нашем исследовании длительное отравление крыс F- привело к подавлению важнейшего посредника аутофагии и смещению механизмов гибели клеток гиппокампа в сторону апоптоза, вероятнее всего, через нарушение взаимодействия Beclin-1 и Bcl-2 или истощение клеточного пула этих молекул. Однако в нескольких предыдущих исследованиях, наоборот, была описана активация ключевых маркеров аутофагии в мозге лабораторных животных. Так, в гиппокампе крыс, получавших 25–100 мг/л F- в течение 6 месяцев, было выявлено значимое повышение уровней Beclin-1, LC3-II и p62 [39, 40]. Мы полагаем, что такое расхождение может быть связано с разной длительностью воздействия F-. Аутофагия часто используется клетками как альтернативный источник энергии, поэтому ее активация после короткого действия стрессовых стимулов может быть адаптивным компенсаторным ответом, чтобы избежать гибели. В случае продолжительного влияния неблагоприятных факторов на клетки уровней или активности эффекторов аутофагии может быть недостаточно, поэтому активируются процессы апоптоза.

Экспрессия посредников некроптоза RIP и MLKL также оставалась стабильной в клетках гиппокампа крыс, получавших избыток F- (рис. 7). Некроптоз, один из путей некротического типа гибели, запускается разнообразными воспалительными сигналами и негативно регулируется каспазами. Этот механизм инициируется через комплексы, называемые некросомами и состоящие из киназ RIP (receptor-interacting protein) и их мишеней MLKL (mixed lineage kinase domain-like protein) [14, 41]. Возможное участие некроптоза в реализации патологических процессов в мозге лабораторных животных под действием F- не было исследовано ранее, однако наша работа показала, что токсические эффекты F- на клетки гиппокампа крыс даже после продолжительного воздействия не связаны с активацией этого типа гибели.

Таким образом, морфологические изменения и гибель клеток гиппокампа, включая нейроны, описанные в нашем предыдущем исследовании, осуществляются преимущественно по митохондриальному пути апоптоза на фоне ингибирования аутофагии.

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Идея исследования и дизайн эксперимента (Н. И. А.), проведение экспериментов и сбор материала для исследования (Н. И. А., О. В. Н.), обработка результатов (Н. И. А., О. В. Н.), написание и редактирование текста (Н. И. А., О. В. Н.).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств бюджета государственного задания № 075–00264–24–00 Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН. Исследование проведено с использованием оборудования Центра коллективного пользования Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН. Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

CОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эксперименты с животными проводились в соответствии с международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований с лабораторными животными и были одобрены Комитетом по биоэтике Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (протокол № 9/2020 от 24.09.2020).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

×

Об авторах

О. В. Надей

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Email: nagalak@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Н. И. Агалакова

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: nagalak@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Johnston NR, Strobel SA (2020) Principles of fluoride toxicity and the cellular response: a review. Arch Toxicol 94(4): 1051–1069. https://doi.org/10.1007/s00204-020-02687-5
  2. Shaji E, Sarath KV, Santosh M, Krishnaprasad PK, Arya BK, Manisha S Babu (2024) Fluoride contamination in groundwater: a global review of the status, processes, challenges, and remedial measures. Geosci Front 15: 101734. https://doi.org/10.1016/j.gsf.2023.101734
  3. Макеева ИМ, Волков АГ, Мусиев АА (2017) Эндемический флюороз зубов – причины, профилактика и лечение. Росс стоматол журн 21(6): 340–344. [Makeeva IM, Volkov AG, Musiev AA (2017) Endemic fluorosis of teeth – causes, prevention and treatment. Russ Stomatol J 21(6): 340–344. (In Russ)].
  4. Lubojanski A, Piesiak-Panczyszyn D, Zakrzewski W, Dobrzynski W, Szymonowicz M, Rybak Z, Mielan B, Wiglusz RJ, Watras A, Dobrzynski M (2023) The safety of fluoride compounds and their effect on the human body-a narrative review. Materials (Basel) 16(3): 1242. https://doi.org/10.3390/ma16031242
  5. Taher MK, Momoli F, Go J, Hagiwara S, Ramoju S, Hu X, Jensen N, Terrell R, Hemmerich A, Krewski D (2024) Systematic review of epidemiological and toxicological evidence on health effects of fluoride in drinking water. Crit Rev Toxicol 6: 1–33. https://doi.org/10.1080/10408444.2023.2295338
  6. Petrović B, Kojić S, Milić L, Luzio A, Perić T, Marković E, Stojanović GM (2023) Toothpaste ingestion-evaluating the problem and ensuring safety: systematic review and meta-analysis. Front Public Health 11: 1279915. https://doi.org/10.3389/fpubh.2023.1279915
  7. Veneri F, Iamandii I, Vinceti M, Birnbaum LS, Generali L, Consolo U, Filippini T (2023) Fluoride exposure and skeletal fluorosis: a systematic review and dose-response meta-analysis. Curr Environ Health Rep 10(4): 417–441. https://doi.org/10.1007/s40572-023-00412-9
  8. Agalakova NI, Nadei OV (2020) Inorganic fluoride and functions of brain. Crit Rev Toxicol 50(1): 28–46. https://doi.org/10.1080/10408444.2020.1722061
  9. Ottappilakkil H, Babu S, Balasubramanian S, Manoharan S, Perumal E (2023) Fluoride induced neurobehavioral impairments in experimental animals: a brief review. Biol Trace Elem Res 201(3): 1214–1236. https://doi.org/10.1007/s12011-022-03242-2
  10. Veneri F, Vinceti M, Generali L, Giannone ME, Mazzoleni E, Birnbaum LS, Consolo U. Filippini T (2023) Fluoride exposure and cognitive neurodevelopment: systematic review and dose-response meta-analysis. Environ Res 221: 115239. https://doi.org/10.1016/j.envres.2023.115239
  11. Nadei OV, Khvorova IA, Agalakova NI (2020) Cognitive decline of rats with chronic fluorosis is associated with alterations in hippocampal calpain signaling. Biol Trace Elem Res 197(2): 495–506. https://doi.org/10.1007/s12011-019-01993-z
  12. Надей ОВ, Иванова ТИ, Суфиева ДА, Агалакова НИ (2020) Морфологические изменения нейронов гиппокампа крыс как результат избыточного потребления фтора. Журн анат гистопатол 9(2): 53–60. [Nadei OV, Ivanova TI, Sufieva DA, Agalakova NI (2020) Morphological Changes of the Rat Hippocampal Neurons Following Excessive Fluoride Consumption. J Anat Histopathol 9(2): 53–60. (In Russ)]. https://doi.org/10.18499/2225-7357-2020-9-2-53-60
  13. Newton K, Strasser A, Kayagaki N, Dixit VM (2024) Cell death. Cell 187(2): 235–256. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.11.044
  14. Ai Y, Meng Y, Yan B, Zhou Q, Wang X (2024) The biochemical pathways of apoptotic, necroptotic, pyroptotic, and ferroptotic cell death. Mol Cell 84(1): 170–179. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.11.040
  15. Gupta R, Ambasta RK, Pravir Kumar (2021) Autophagy and apoptosis cascade: which is more prominent in neuronal death? Cell Mol Life Sci 78(24): 8001–8047. https://doi.org/10.1007/s00018-021-04004-4
  16. Deng Z, Zhou X, Lu JH, Yue Z (2021) Autophagy deficiency in neurodevelopmental disorders. Cell Biosci 11(1): 214. https://doi.org/10.1186/s13578-021-00726-x
  17. Liénard C, Pintart A, Bomont P (2024) Neuronal autophagy: regulations and implications in health and disease. Cells 13(1): 103. https://doi.org/10.3390/cells13010103
  18. Agalakova NI, Gusev GP (2013) Excessive fluoride consumption leads to accelerated death of erythrocytes and anemia in rats. Biol Trace Elem Res 153(1–3): 340–349. https://doi.org/10.1007/s12011-013-9691-y
  19. Baselt RC (2004) Disposition of Toxic Drugs and Chemicals in Man. 7th ed. Biomedical Publications. Foster City. CA. 468–470. https://doi.org/10.1373/clinchem.2004.039271
  20. Nadei OV, Agalakova NI (2024) Optimal reference genes for RT-qPCR experiments in hippocampus and cortex of rats chronically exposed to excessive fluoride. Biol Trace Elem Res 202(1): 199–209. https://doi.org/10.1007/s12011-023-03646-8
  21. King LE, Hohorst L, Garcıá-Sáez AJ (2023) Expanding roles of BCL-2 proteins in apoptosis execution and beyond. J Cell Sci 136(22): jcs260790. https://doi.org/10.1242/jcs.260790
  22. Gong Q, Wang H, Zhou M, Zhou L, Wang R, Li Y (2024) B-cell lymphoma-2 family proteins in the crosshairs: Small molecule inhibitors and activators for cancer therapy. Med Res Rev 44(2): 707–737. https://doi.org/10.1002/med.21999
  23. Dixit VM (2023) The road to death: caspases, cleavage, and pores. Science Adv 9(17): eadi2011. https://doi.org/10.1126/sciadv.adi2011
  24. Sahoo G, Samal D, Khandayataray P, Murthy MK (2023) Review on caspases: key regulators of biological activities and apoptosis. Mol Neurobiol 60(10): 5805–5837. https://doi.org/10.1007/s12035-02-03433-5
  25. Ribeiro DA, Cardoso CM, Yujra VQ, De Barros Viana M, Aguiar O Jr, Pisani LP, Oshima CT (2017) Fluoride induces apoptosis in mammalian cells: in vitro and in vivo studies. Anticancer Res 37: 4767–4777. https://doi.org/10.21873/anticanres.11883
  26. Angwa LM, Nyadanu SD, Kanyugo AM, Adampah T, Pereira G (2023) Fluoride-induced apoptosis in non-skeletal tissues of experimental animals: A systematic review and meta-analysis. Heliyon 9(8): e18646. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2023.e18646
  27. Sun Y, Ke L, Zheng X, Li T, Ouyang W, Zhang Z (2017) Effects of different levels of calcium intake on brain cell apoptosis in fluorosis rat offspring and its molecular mechanisms. Biol Trace Elem Res 176(2): 355–366. https://doi.org/10.1007/s12011-016-0850-9
  28. Wei N, Dong YT, Deng J, Wang Y, Qi XL, Yu WF, Xiao Y, Zhou JJ, Guan ZZ (2018) Changed expressions of N-methyl-d-aspartate receptors in the brains of rats and primary neurons exposed to high level of fluoride. J Trace Elem Med Biol 45: 31–40. https://doi.org/10.1016/j.jtemb.2017.09.020
  29. Liu YJ, Guan ZZ, Gao Q, Pei JJ (2011) Increased level of apoptosis in rat brains and SH-SY5Y cells exposed to excessive fluoride – a mechanism connected with activating JNK phosphorylation. Toxicol Lett 204: 183–189. https://doi.org/10.1016/j.toxlet.2011.04.030
  30. Wang C, Liang C, Ma J, Manthari RK, Niu R, Wang J, Wang J, Zhang J (2018) Co-exposure to fluoride and sulfur dioxide on histological alteration and DNA damage in rat brain. J Biochem Mol Toxicol 32(2). https://doi.org/10.1002/jbt.22023
  31. Tang Y, Zhang J, Hu Z, Xu W, Xu P, Ma Y, Xing H, Niu Q (2023) PRKAA1 induces aberrant mitophagy in a PINK1/Parkin-dependent manner, contributing to fluoride-induced developmental neurotoxicity. Ecotoxicol Environ Saf 255: 114772. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2023.114772
  32. Yan N, Liu Y, Liu S, Cao S, Wang F, Wang Z, Xi S (2016) Fluoride-induced neuron apoptosis and expressions of inflammatory factors by activating microglia in rat brain. Mol Neurobiol 53: 4449–4460. https://doi.org/10.1007/s12035-015-9380-2
  33. Liao Q, Zhang R, Wang X, Nian W, Ke L, Ouyang W, Zhang Z (2017) Effect of fluoride exposure on mRNA expression of cav1.2 and calcium signal pathway apoptosis regulators in PC12 cells. Environ Toxicol Pharmacol 54: 74–79. https://doi.org/10.1016/j.etap.2017.06.018
  34. Tu W, Zhang Q, Liu Y, Han L, Wang Q, Chen P, Zhang S, Wang A, Zhou X (2018) Fluoride induces apoptosis via inhibiting SIRT1 activity to activate mitochondrial p53 pathway in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Toxicol Appl Pharmacol 347: 60–69. https://doi.org/10.1016/j.taap.2018.03.030
  35. Chen J, Rodriguez AS, Morales MA, Fang X (2023) Autophagy modulation and its implications on glioblastoma treatment. Curr Issues Mol Biol 45(11): 8687–8703. https://doi.org/10.3390/cimb45110546
  36. Menon MB, Dhamija S (2018) Beclin 1 Phosphorylation – at the center of autophagy regulation. Front Cell Dev Biol 6: 137. https://doi.org/10.3389/fcell.2018.00137
  37. Rong Z, Zheng K, Chen J, Jin X (2022) Function and regulation of ULK1: From physiology to pathology. Gene 840: 146772. https://doi.org/10.1016/j.gene.2022.146772
  38. Prerna K, Dubey VK (2022) Beclin1-mediated interplay between autophagy and apoptosis: new understanding. Int J Biol Macromol 204: 258–273. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2022.02.005
  39. Niu Q, Chen J, Xia T, Li P, Zhou G, Xu C, Zhao Q, Dong L, Zhang S, Wang A (2018) Excessive ER stress and the resulting autophagic flux dysfunction contribute to fluoride-induced neurotoxicity. Environ Pollut 233: 889–899. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2017.09.015
  40. Han X, Tang Y, Zhang Y, Zhang J, Hu Z, Xu W, Xu S, Niu Q (2022) Impaired V-ATPase leads to increased lysosomal pH, results in disrupted lysosomal degradation and autophagic flux blockage, contributes to fluoride-induced developmental neurotoxicity. Ecotoxicol Environ Saf 236: 113500. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2022.113500
  41. Zhang L, Hu Z, Li Z, Lin Y (2024) Crosstalk among mitophagy, pyroptosis, ferroptosis, and necroptosis in central nervous system injuries. Neural Regen Res 19(8): 1660–1670. https://doi.org/10.4103/1673-5374.389361

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Изменения экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 и проапоптотического белка Bax в гиппокампе крыс после воздействия F- на уровне транскрипции и трансляции. (a) – Уровни экспрессии генов Bcl2 и Bax в клетках гиппокампа, нормализованные по отношению к экспрессии пары референсных генов Eef1a1+Ppia (средние значения ± SE, n = 7–9). (b) – Репрезентативные иммуноблоты для одной крысы из каждой группы. (c) – Среднее содержание белков Bcl-2 и Bax ± SE в клетках гиппокампа, рассчитанное по отношению к оптической плотности референсного белка GAPDH (n = 7). (d) – Отношение экспрессии генов Bcl-2 и Bax. (e) – Соотношение уровней белка Bcl-2 и Bax. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 по сравнению с контрольной группой (Con).

Скачать (204KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Уровень каспазы-9 в гиппокампе крыс, потреблявших избыток F-. (a) – Типичные примеры иммуноблотов нативной формы каспазы-9 и активной каспазы-9 для одной крысы из каждой экспериментальной группы. (b) – Среднее содержание ± SE двух форм каспазы-9, нормализованное по GAPDH (n = 5). * p < 0.05, *** p < 0.001 по сравнению с контролем.

Скачать (91KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Стимуляция каспазы-3 в гиппокампе крыс, потреблявших избыток F-. (a) – Уровни Casp3 мРНК в клетках гиппокампа крыс всех экспериментальных групп (средние значения ± SE, n = 8–10). (b) – Типичные примеры иммуноблотов нативной формы каспазы-3 и активной каспазы-3 для одной крысы из каждой экспериментальной группы. (c) – Среднее содержание ± SE двух форм каспазы-3, нормализованное по GAPDH. (d) – Изменения соотношения уровней прокаспазы-3 и активной каспазы-3 (n = 6). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 по сравнению с контролем.

Скачать (156KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Экспрессия на уровне белка двух форм каспазы-8 и рецепторов Fas в клетках гиппокампа крыс после длительного воздействия F-. (a) – Пример иммуноблотов для одного животного из каждой группы. (b) – Среднее содержание белков каспазы-8 и Fas ± SE в клетках, рассчитанное по отношению к содержанию референсного белка GAPDH (n = 4).

Скачать (120KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Экспрессия посредников аутофагии в гиппокампе крыс, подверженных воздействию F-. (a) – Типичные иммуноблоты и средние уровни ± SE белка ULK-1 в клетках гиппокампа крыс, получавших разные дозы F- (n = 7). (b) – Изменения экспрессии гена Beclin1 в гиппокампе животных, получавших избыток F-, на уровне транскрипции (n = 6). (c) – Изменения содержания белка Beclin-1 в гиппокампе животных после длительного потребления F- (n = 6). Показаны типичные иммуноблоты для одного животного из каждой группы и средние значения ± SE нативной и фосфорилированной форм (Ser30) Beclin-1. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, # p < 0.0001 по сравнению с контролем.

Скачать (135KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Экспрессия модуляторов аутофагии AMPK, Akt и mTOR в гиппокампе крыс, получавших избыток F-, на уровне транскрипции и трансляции. (a) – Уровни экспрессии генов Prkaa1, Akt и mTOR в клетках гиппокампа крыс. (b) – Репрезентативные иммуноблоты для одного животного из каждой группы. (c) – Средние значения ± SE содержания AMPK, Akt и mTOR на уровне белка (n = 5).

Скачать (166KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Уровни белков RIP и MLKL в гиппокампе крыс, получавших разные дозы F-. (a) – Показательные иммуноблоты для одного животного из каждой группы. (b) – Средние значения содержания ± SE белков RIP и MLKL в клетках гиппокампа (n = 5).

Скачать (85KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».