Elastic properties of the cell surface and metabolic profile of an embryonic primary mixed culture of hippocampal neurons under conditions of P2X3 receptor blockade

Capa

Citar

Texto integral

Resumo

P2X3-receptors localized in the hippocampus participate in the transmission of excitation and the formation of synaptic plasticity underlying learning and memory. P2X3-receptors are of great importance in the occurrence of neuropathic pain in epilepsy, acute and inflammatory pain of various genesis and localization as well as in the activation and growth of nerves after traumatic brain injury. The aim of the study was to study the elastic properties of the surface and the metabolic profile of neurons in an embryonic primary mixed hippocampal culture under P2X3-receptor blockade. The study was performed on a primary mixed culture of hippocampal neurons obtained from CD1 mice on the 18th day of gestation (E18). The highly selective blocker 5-(5-iodo-2-isopropyl-4-methoxyphenoxy)pyrimidine-2.4-diamine monochloride salt was selected as a P2X3-receptor blocker. To assess the elastic properties of neurons Young's modulus that characterizes the rigidity of the cell surface was measured. Measurements on an atomic force microscope applying a load in 25 local areas of the cell surface were performed. At each point, the force curves of the cantilever approach and retraction were recorded with subsequent calculation of Young's modulus. The metabolic profile of the neuroglial culture in Energy Phenotype test on a Seahorse HS mini cell metabolism analyzer (USA) was studied. The Young's modulus of the cell surface of neurons in the control was in the range from 6.8 ± 0.1 to 9.7 ± 0.2 kPa, and under the action of the P2X3-receptor blocker in the range from 3.1 ± 0.1 kPa to 8.5 ± 0.1 kPa. Under the conditions of P2X3-receptor blockade on the 5th day of differentiation the Young's modulus of the cell surface was reduced by 62% (p < 0.05), on the 8th day it increased by 22% (p < 0.05) and by the 11th day it decreased by 16.7% (p < 0.05) compared to the control. Aerobic respiration was characteristic of the embryonic hippocampal culture both in the control and with the P2X3-receptor blockade. Consequently, the blockade of the P2X3-receptor did not affect the metabolic profile of the E18 hippocampal culture. The obtained data indicate the direct participation of the P2X3-receptor in the formation of biomechanical properties of the cell surface in the processes of differentiation and signal transduction. It is possible, that the blockade of the P2X3-receptor will be one of the promising molecular targets that can reduce neuronal damage in brain injuries, neuroinflammation, hypoxia, and epilepsy. In addition, the study of the P2X3-receptor blockade can expand the fundamental understanding of the role of the purinergic signaling system in the formation of complex neuronal morphology at early stages of embryonic development under conditions of rapid excitatory signal transmission mediated by the ATP molecule.

Texto integral

ВВЕДЕНИЕ

Пуринергическая сигнальная система гиппокампа задействована в процессах нейротрансмиссии [1, 2], синаптической пластичности нейронной сети [3], передачии модуляции сигналов воспаления, опосредованных рецепторами Р2Х [4], а также пролиферации, дифференцировки и регенерации клеток, происходящих с участием Р2Y-рецепторов [5, 6]. Среди пуринергических рецепторов особый интерес представляет Р2Х3, поскольку принимает участие не только в возникновении, развитии нейропатической и воспалительной боли [7–9], но и выполняет нейропротекторную роль после нарушения целостности нервного волокна [8, 10], участвуя в процессе регенерации нервных окончаний [11, 12]. Рецепторы Р2Х3 экспрессируются в гиппокампе, где выявлена локализация мРНК Р2Х3 в аксонах клеток зубчатой извилины, формирующих мшистые волокна, проецирующиеся на полиморфный слой зубчатой извилины и проксимальные дендриты пирамидальных клеток гиппокампа [13]. Функциональной особенностью семейства рецепторов Р2Х является проницаемость для Са2+ при мембранном потенциале покоя [14], в отличие от ионотропных рецепторов глутамата (NMDA-каналов), вход кальция через которые происходит только при деполяризации мембраны [15]. Кроме того, известна роль Р2Х3-рецептора в нейрогенезе, который на ранних стадиях развития эмбрионов может быть единственным подтипом рецептора, участвующим в быстрой возбуждающей передаче сигналов, опосредованной АТФ [16]. Известно, что в условиях ингибирования гена P2rx3 нарушается нейрогенез гиппокампа, который сопровождается снижением пролиферации и недоразвитием нейритов в головном мозге, что было показано на мышиной модели болезни Альцгеймера [17]. Несмотря на спектр работ, посвященных различным аспектам функционирования Р2Х3-рецептора, малоизученным остается вопрос о взаимосвязи рецептора с митохондриальной функцией, определяющей активность клеточного метаболизма, кальциевый гомеостаз, и, как следствие, регуляцию синаптической пластичности гиппокампа [18]. Неизученным остается вопрос о влиянии Р2Х3-рецептора на биомеханические свойства клеточной поверхности, так как механическая трансдукция сигналов происходит в 40 раз быстрее, чем трансдукция биохимических сигналов в цитоплазме [19]. Целью выполненного исследования явилось изучить упруго-эластические свойства поверхности и метаболический профиль нейронов эмбриональной первичной смешанной культуры гиппокампа в условиях блокады Р2Х3-рецептора.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные

В работе использованы мыши линии CD1 в возрасте 2 месяца массой 23–25 г. Животные были приобретены в филиале "Столбовая" Федерального государственного бюджетного учреждения науки "Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства" России (сертификат № 18980 от 23.05.2023). Животные содержались в условиях конвенционального вивария Белгородского государственного национального исследовательского университета, искусственно регулируемого светового дня (12 ч темного и 12 ч светлого времени) при температурном режиме 22–26 °C и имели свободный доступ к корму и воде. В эксперимент были взяты 5 беременных самок, от каждой отбирали по 6 хорошо сформированных эмбрионов.

Выделение культуры гиппокампа эмбрионов мыши (Е18)

В исследовании в качестве объекта выбрана эмбриональная первичная смешанная культура гиппокампа, которая является универсальной моделью для создания первичных культур с преобладающим числом нейронов над глиальными клетками. Культуры, полученные от 18-дневных эмбрионов, представляют модель дифференцированных нейронов [20]. Для получения культуры гиппокампа Е18 вскрывали брюшную полость, проводили эктомию матки с эмбрионами на 18-й день гестации. Все манипуляции выполняли в чашке Петри с охлажденным раствором Хенкса на льду. Выделение гиппокампа проводили под бинокуляром (Leica, ув. Х4). Гиппокамп делили скальпелем на 6–8 частей, переносили в пробирку с предварительно подогретым до 37 °C 0.25%-ным раствором трипсин-ЭДТА (Панэко) и помещали в инкубатор Binder (Германия) при 37 ºC, 5% CO2 на 20 мин. Клеточную суспензию трижды отмывали фосфатно-буферным раствором (PBS) c рН 7.4. К полученной суспензии добавляли 2 мл нейробазальной среды (Панэко), содержащей 2% добавки белка B-27 (НейроМакс, Панэко), 0.5 мМ L-Glutamax (Gibco, 25030081), 1% ПенСтреп (ПанЭко). Для оценки упруго-эластических свойств нейронов гиппокампа первичную культуру высеивали на предварительно подготовленные прокаленные стекла в концентрации 1 х 106 клеток на стекло. Общее число засеянных стекол равно десяти, по пять в опытной и контрольной группах. Для изучения метаболического профиля первичную смешанную культуру нейронов гиппокампа высеивали и культивировали в 8-луночных планшетах Cell Culture Miniplates (США), плотность посадки составила 2 х 105 клеток на лунку. Всего было засеяно 16 планшетов.

Оценка упруго-эластических свойств клеточной поверхности

Стекла контрольной группы инкубировали в нейробазальной среде (Панэко), содержащей 2% добавки белка B-27 (НейроМакс, Панэко), 0.5 мМ L-Glutamax (Gibco, 25030081), 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко), 1% PenStrep (ПанЭко). В нейробазальную среду опытной группы добавляли высокоселективный блокатор рецептора Р2Х3 5-(5-йод-2-изопропил-4-метоксифенокси) пиримидин-2.4-диамин монохлоридная соль (Ro-4; Selleckchem, США, No.S0405) в конечной концентрации 12 нМ. Выбор дозы препарата основан на известной для данного лиганда концентрации полумаксимального ингибирования (IC50), которая по данным литературы составляет 3.16 нМ [21]. Смену культуральной среды проводили каждые 24 ч, блокатор постоянно находился в культуральной среде опытных проб.

Упруго-эластические свойства нейронов гиппокампа исследовали на 1-, 5-, 8-, 11- и 14-е сутки дифференцировки. Культуральную среду удаляли из лунок планшета на определенные сутки инкубации, трижды промывали PBS (рН 7.4). Затем на стекла наносили 95%-ный спирт до полного покрытия поверхности стекла и фиксировали препарат в течение 3 мин. По истечении времени фиксации препараты промывали трижды PBS, а затем ополаскивали дистиллированной водой. Сушили стекла в ламинарном шкафу и затем (через 24 ч) сканировали на атомно-силовом микроскопе ИНТЕГРА Вита (конфигурация на базе инвертированного оптического микроскопа Olympus IX-71, Зеленоград, Россия). Измерение модуля Юнга предполагает непосредственный контакт кантилевера с клеточной мембраной и его погружение в мембрану, в связи с чем клетки могут отрываться от подложки. В процессе работы был выбран способ пробоподготовки стекол для сканирования с использованием фиксатора, учитывая, что условия подготовки препаратов в опытной и контрольной группах были одинаковыми, то фиксация в данном случае не повлияла на объективность полученных данных. Согласно экспериментальным данным исследований, представленных в доступной литературе, фиксация нейрональных клеток перед измерением модуля Юнга помогает обойти многие потенциальные проблемы, сопровождающие измерения в реальном времени, такие как проблемы с адгезией клеточного субстрата, подвижностью и поддержанием жизнеспособности нейронов во время измерения [22]. На неподвижных нейрональных клетках были проведены механические измерения в области сомы и конуса роста. Фиксированные нейроны обычно имеют значения модуля упругости порядка от 10 до сотен кПа [23, 24].

Сканирование проводили в режиме силовой спектроскопии с частотой развертки сканирования 0.6–0.8 Гц, используя кантилевер серии NSG03 (Nanoworld, США) с жесткостью 1.1 Н/м и радиусом закругления 10 нм. Механические свойства поверхности оценивали в локальных участках согласно картам локальной упругости. Для этого на клеточную поверхность сомы нейрона накладывали нагрузку в 25 локальных участках клеточной поверхности. Измерения проводили в области сомы нейрона (рис. 1).

 

Рис. 1. Процедура атомно-силовой спектроскопии клеточной поверхности нейрона на 1-е сутки дифференцировки в культуре: (a) – принципиальная схема сканирования образца: клетка на подложке; кантилевер, который перемещается по клеточной поверхности; луч лазера настроен на гибкую консоль кантилевера, которая отклоняется при перемещении по поверхности и передает информацию на 4-секционный фотодиод, (b) – изображение нейрона, полученное при сканировании в программном обеспечении Nova с наложением нагрузки (1 нН) в 25 точках поверхности, (c) – кривые подвода (синяя) и отвода (красная) в каждой точке наложения нагрузки, по которым программное обеспечение строит карты локальной упругости, (d) – карта локальной упругости поверхности нейрона (темные участки карты указывают на высокие значения модуля Юнга, а значит и более высокую жесткость поверхности).

 

Алгоритм процедуры расчета модуля Юнга по силовым кривым подвода и отвода осуществляли в соответствии с ранее опубликованным способом [25]. С каждого стекла отсканировано по 20 клеток. Общее число проведенных измерений 1000.

Метаболический профиль культуры Е18 гиппокампа

Оценку энергетического фенотипа нейронов проводили на 14-е сутки дифференцировки клеток в культуре с использованием набора Cell Energy Phenotype (Kit 103325–100, Agilent, США). В наборе использовали олигомицин (ингибитор АТФ-синтазы) и FCCP (митохондриальный разобщитель). Конечная концентрация стрессового раствора олигомицин/FCCP в ячейке составила 1.0/1.0 мкМ. С целью фармакологической блокады рецептора Р2Х3 блокатор Ro-4 вводили в опытные ячейки (B, C, D) культуральных планшетов за 24 ч до проведения измерений в конечной концентрации 12 нМ. В качестве контроля были ячейки (E, F, H) с культурой без препарата. В каждой опытной и контрольной ячейках выполнено по 3 технических измерения, в которых оценивали скорость потребления кислорода (OCR) и скорость закисления среды (ECAR). Нормализацию результатов проводили по числу клеток, подсчет клеток – после выполненного теста. По результатам измерений строили метаболические карты с помощью программного продукта Nova 1.3 (США) и Multi-File Seahorse XF Cell Energy Phenotype (США).

Статистический анализ

Результаты экспериментальных данных обработаны с использованием пакета описательной статистики Excel 10.0. В исследовании выполнена проверка гипотезы о нормальном распределении. Данные модуля Юнга приведены в виде средних значений со стандартной ошибкой, полученные результаты подвергаются нормальному распределению, в связи с чем для оценки достоверности использовали критерий Стьюдента при р < 0.05.

Данные по оценке метаболического профиля приведены на рисунке в виде средних значений со стандартным отклонением, результаты не подчинялись гипотезе нормального распределения, поэтому для оценки достоверности полученных результатов использовали критерий Манна – Уитни для выборок с ненормальным распределением. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался при p = 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Модуль Юнга клеточной поверхности культуры нейронов гиппокампа Е18

Модуль Юнга клеточной поверхности нейронов находился в пределах от 6.8 ± 0.1 до 9.7 ± 0.2 кПА в контроле, а под действием блокатора Р2Х3-рецептора диапазон изменений установлен от 3.1 ± 0.1 кПа до 8.5 ± 0.1 кПА. В условиях блокады Р2Х3-рецептора достоверные различия в значениях модуля Юнга установлены на 5-, 8- и 11-е сутки дифференцировки клеток в культуре (рис. 2). Так, на 5-е сутки дифференцировки в условиях блокады Р2Х3-рецептора модуль Юнга клеточной поверхности был снижен на 62% (p < 0.05) по сравнению с контролем. На 8-е сутки модуль Юнга под действием блокатора увеличился на 22% (р < 0.05), а к 11-м суткам снизился на 16.7% (р < 0.05) по сравнению с контролем.

 

Рис. 2. Модуль Юнга клеточной поверхности первичной смешанной культуры нейронов Е18 в условиях блокады Р2Х3 рецептора. * достоверные различия при р < 0.05 по критерию Стьюдента.

 

Упруго-эластические свойства клеточной поверхности нейронов изменяются в зависимости от степени дифференцировки клеток в культуре. В контрольной группе максимумы значений модуля Юнга приходятся на 5- и 11-е сутки дифференцировки клеток в культуре. В условиях блокады рецептора Р2Х3 максимальные значения модуля Юнга зафиксированы на 8-е сутки дифференцировки.

В выполненном исследовании проанализировано изменение модуля Юнга в 25 локальных участках клеточной поверхности нейронов отдельно в те дни дифференцировки, в которых установлены достоверные изменения данного параметра. Данные по точкам сгруппированы в зависимости от пространственной локализации, т. е. 1–6, 10–11, 15, 16, 20–25 точки отнесены к краевой зоне клетки, точки 7–9, 12–14, 17–19 – к области ядра и околоядерного пространства. Согласно полученным данным, в условиях блокады Р2Х3-рецептора на 5-е сутки дифференцировки установлено снижение модуля Юнга как по краю клетки, так и в области ядра соответственно на 61% (р < 0.05) и 64% (р < 0.05) по сравнению с контролем (табл. 1).

 

Таблица 1. Модуль Юнга (кПА) клеточной поверхности нейронов в отдельных зонах клетки по данным карт локальной упругости

Сутки дифференцировки/группы

Краевая зона клетки

Зона в области ядра

5-е сутки

контроль

8.3 ± 0.1

8.3 ± 0.2

блокатор Ro-4

3.2 ± 0.1*

3.0 ± 0.1*

8-е сутки

контроль

6.5 ± 0.1

6.6 ± 0.2

блокатор Ro-4

8.4 ± 0.2*

8.5 ± 0.2*

11-е сутки

контроль

9.8 ± 0.2

9.7 ± 0.2

блокатор Ro-4

8.4 ± 0.2*

8.2 ± 0.2*

Примечание. Данные точек наноиндентирования 1–6, 10, 11, 15, 16, 20–25 – сгруппированы в столбец "Краевая зона клетки", данные точек наноиндентирования 7–9, 12–14, 17–19 сгруппированы в столбец "Зона области ядра"; * – достоверные значения по сравнению с контролем при р < 0.05 по критерию Стьюдента.

 

На 8-е сутки дифференцировки под действием блокатора наблюдали увеличение модуля Юнга на 29% (р < 0.05) как по краю клетки, так и в области ядра. К 11-м суткам дифференцировки в условиях блокады Р2Х3-рецептора модуль Юнга был снижен на 16.6% (р < 0.05) по краю клетки и на 18% (р < 0.05) в области ядра по сравнению с контролем.

Метаболический профиль культуры Е18 гиппокампа

В работе проанализировано влияние блокады Р2Х3-рецептора на тип клеточного метаболизма. Выделяют четыре состояния, описывающих тип клеточного метаболизма: аэробный – клетка использует преимущественно митохондриальное дыхание, гликолитический – клетка использует преимущественно гликолиз, состояние покоя – когда в клетке сведены к минимуму любые из метаболических путей, энергетический фенотип – когда клетка использует окислительное фосфорилирование и гликолиз. В выполненном исследовании изучен энергетический фенотип и построена метаболическая карта, отражающая соотношение в метаболизме культуры окислительного фосфорилирования и гликолиза в физиологических условиях и при внесении стрессоров (смеси олигомицин/FCCP) на фоне блокады Р2Х3-рецептора (рис. 3).

 

Рис. 3. Метаболическая карта энергетического фенотипа первичной смешанной культуры нейронов: обозначены области дыхания Aerobic – аэробное дыхание; Quiescence – дыхательный покой; Energy – клеточный метаболизм, основанный на смешанном дыхании (окислительное фосфорилирование и гликолиз); Glycolytic – анаэробное дыхание. Серым цветом указана контрольная группа, черным – опытная группа (блокатор Ro-4). Закрашенные квадратики обозначают дыхание до блокады цепи переноса электронов, незакрашенные квадратики означают дыхание после блокады цепи переноса электронов стрессорами.

 

Под влиянием блокатора рецепторов Р2Х3 в нейроглиальной культуре гиппокампа Е18 не установлено достоверных изменений в параметрах OCR и ECAR при введении стрессового раствора, блокирующего работу АТФ-синтазы и вызывающего разобщение митохондриального дыхания. Согласно построенной карте биоэнергетического профиля, культура сохраняла достаточно высокий тип аэробного дыхания. Следовательно, энергетический фенотип нейронов под влиянием блокатора не изменился.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В проведенном исследовании изучено влияние блокады Р2Х3-рецептора на изменения упруго-эластических свойств клеточной поверхности и метаболический профиль нейронов гиппокампа. Показано, что в условиях блокады Р2Х3-рецептора на 5-е и 11-е сутки дифференцировки жесткость клеточной поверхности снижается, в то время как в контроле – возрастает. Наблюдаемое изменение упруго-эластических свойств клеточной поверхности мы связываем с реорганизацией основных элементов цитоскелета нейронов – актиновых филаментов [26]. В эксперименте доказано, что повышение плотности кортикальной сети актина в подмембранном пространстве приводит к увеличению жесткости клеточной поверхности [27]. Кроме того, области высоких значений модуля Юнга в телах нейронов могут быть связаны с динамической перестройкой и высокой плотностью микротрубочек [28]. Тем не менее основным белком цитоскелета, экспрессируемым в нервной системе, выступает актин [29], он обеспечивает механические свойства клеток, рост дендритов и аксонов [30], а также участвует в транспорте белков, рецепторов и внутриклеточных везикул [31, 32]. На сенсорных нейронах спинномозгового ганглия доказано, что активация комплекса Epac-PKC усиливает мембранную экспрессию P2X3R, и этот эффект опосредован F-актином [33]. Однако участки взаимодействия между F-актином и P2X3-рецептором на данный момент не идентифицированы. В качестве кандидатов, опосредованно влияющих на взаимодействие между Р2Х3-рецепторами и F-актином, ученые рассматривают Ca2+-зависимые каналы с транзиторным рецепторным потенциалом (TRPV4), которые взаимодействуют с актином и микротрубочками. Комплекс TRPV4/актин/микротрубочки взаимодействует с комплексом PKC и Са2+/кальмодулин-зависимой протеинкиназой (CAMK) [34]. Известно, что в состоянии физиологического покоя рецептор P2X3 связан с Ca2+/кальмодулин-зависимой сериновой протеинкиназой (CASK), которая контролирует закрепление его в мембране и ограничивает спонтанное высвобождение АТФ [35]. CASK содержит кальмодулин-связывающий домен с внутренней чувствительностью к Ca2+ [36]. При передаче сигнала может реализовываться функциональное взаимодействие между внутриклеточным Ca2+, CaMKII и CASK. Доказана тесная ассоциация P2X3 с CASK, которая во многом зависит от кальциевого канала CaV2.1 и активности CAMKII [37]. CASK может также регулировать аутофосфорилирование CaMKII и синаптический рост в глутаматергических мотонейронах [36]. Не исключено, что наблюдаемое на 5-е сутки дифференцировки нейронов в культуре снижение жесткости в условиях блокады сигнального пути от рецептора Р2Х3 может быть связано с отсутствием полимеризации F-актина в подмембранном пространстве.

На 8-е сутки дифференцировки в условиях блокады Р2Х3-рецептора мы наблюдали увеличение жесткости клеточной поверхности. Данный факт мы связываем с протекающим в культуре глиогенезом и дифференцировкой глиальных клеток. В эксперименте по изучению упруго-эластических свойств стволовых клеток, дифференцирующихся в различные морфологические типы нейронов, было установлено снижение жесткости клеточной поверхности форм с типичной морфологией нейронов через 24 ч и в течение 240 ч дифференцировки в культуре [38]. Сома истинных нейронов имеет низкие значения постоянной упругости, так как демонстрирует слабые взаимодействия между плазмалеммой и цитоскелетом [39]. Клетки с астроцитарным фенотипом появлялись через 72 ч в культуре, характеризовались более жесткой поверхностью за счет реорганизации актинового цитоскелета, состоящего из сформированных волокон определенного рисунка [39]. Мы полагаем, рост глиальных клеток сделал в целом первичную смешанную культуру нейронов нечувствительной к блокаде Р2X3-рецептора. В одной из экспериментальных работ была проверена гипотеза о том, что в первичных астроцитах крыс только некоторые рецепторы семейства Р2 функционально связаны с увеличением концентрации внутриклеточного Са2+. Показано отсутствие Са2+-токов под влиянием агониста Р2Х3-рецептора альфа, бета метилен-АТФ (α, β meАТФ) [40]. В корковых астроцитах крыс АТФ-индуцированный кальциевый сигнал был опосредован Р2Х7- и P2Y1-рецепторами [41]. Следовательно, отсутствие АТФ-индуцированного Са2+-тока в глиальных клетках [42], скорее всего, не приводит к перестройке элементов цитоскелета и, как следствие, к снижению жесткости поверхности на 8-е сутки дифференцировки, что, вероятно, связано с глиогенезом и интенсивным развитием глии в культуре in vitro.

Блокада Р2Х3-рецептора не оказывала влияния на метаболический профиль культуры на 14-е сутки дифференцировки. Для эмбриональной культуры гиппокампа был характерен аэробный тип дыхания как в контроле, так и при блокаде Р2Х3-рецептора. При введении стрессора митохондриального дыхания, блокирующего работу АТФ-синтазы и разобщающего цепь переноса электронов, тип дыхания сохранился в аэробной области, но скорость потребления кислорода немного снизилась как в опытной, так и в контрольной группе. Наблюдаемый эффект является компенсаторным влиянием глиальных клеток. Согласно данным литературы, астроциты функционируют без окислительного фосфорилирования, обеспечивают GSH-зависимый защитный эффект на нейроны, являясь синтезаторами/экспортерами биоэнергетических молекул (лактат/кетоновые тела) для окислительного фосфорилирования [43].

Блокада Р2Х3-рецептора оказывает влияние на биомеханические свойства поверхности, изменяя ее жесткость. Выявленные изменения упруго-эластических свойств клеточной поверхности нейронов могут быть включены в обеспечение синаптической пластичности в гиппокампе. Роль Р2Х3-рецепторов в гиппокампе связана с синаптической передачей и участием в краткосрочной пластичности синапсов мшистых волокон гиппокампа, обеспечивающих передачу возбуждения по цинк-чувствительным АТФ-зависимым каналам на пирамидальные клетки СА3 [44]. В stratum oriens поля СА1 гиппокампа, которая получает сигнал от холинергической септальной области, установлена локализация Р2Х3 [13], что указывает на связь данных рецепторов с никотиновыми холинорецепторами на пресинаптическом уровне для контроля чрезмерной активации норадренергических терминалей в гиппокампе [45]. Показано, что ингибирование рецепторов Р2Х (семейства Р2Х3, Р2Х4, Р2Х6) способствует индукции феномена долговременного потенцирования в клетках СА1 гиппокампа, что лежит в основе обучения и памяти [14]. При этом пуринергический синаптический вход может служить основным источником внутриклеточного Са2+ вблизи потенциала покоя [46], что влияет на базальный уровень инактивации рецепторов NMDA и определяет порог индукции потенциалов действия, лежащих в основе обучения и памяти [14].

Еще одним важным аспектом выполненного исследования, требующим более детальных работ на перспективу, является изучение роли митохондрий в регуляции внутриклеточного кальциевого гомеостаза, связанного с нейрональной возбудимостью и синаптической пластичностью гиппокампа, в условиях блокады Р2Х3-рецептора [47]. Показано, что возбудимость нейронов, связанная с чрезмерной экспрессией Р2Х3-рецептора, играет ключевую роль в невропатической боли и повышенной возбудимости при эпилепсии [48]. Кроме того, при ноцицепции и повреждении нейронов спинного мозга ингибирование рецепторов Р2Х3 достаточно, чтобы снизить их повреждение [49]. Установленное нами отсутствие переключения метаболического фенотипа нейронов в условиях блокады P2Х3-рецептора не дает полного представления о функции митохондриального каскада и продукции АТФ в этих условиях. Необходимы исследования, нацеленные на изучение функционального состояния митохондриальной биоэнергетики в условиях блокады Р2Х3-рецептора. Не исключено, что блокада Р2Х3-рецептора при таких состояниях, как травмы головного мозга, гипоксия, эпилепсия может явиться молекулярной мишенью для снижения повреждений нейронов за счет митохондриального контроля внутриклеточного кальциевого гомеостаза. Изучение блокады Р2Х3-рецептора может расширить фундаментальные представления о роли пуринергической сигнальной системы в формировании сложной морфофизиологии нейронов на ранних стадиях развития эмбрионов в условиях быстрой возбуждающей передачи сигналов, опосредуемой молекулой АТФ.

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Идея работы и планирование эксперимента (М. Ю. С. и А. В. Д.), сбор данных (А. С. З., В. С. Ш., Ю. В. С.), обработка данных (А. С. З., М. Ю. С., В. С. Ш., Ю. В. С.), написание и редактирование манускрипта (А. С. З., В. С. Ш., Ю. В. С., М. Ю. С., А. В. Д.).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эксперименты с животными проводились в соответствии с международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований с лабораторными животными и были одобрены Комиссией по этике Белгородского государственного национального исследовательского университета (НИУ «БелГУ»), протокол № 01и/23 от 23.01.2023 г.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств бюджета Российского научного фонда (проект № 23–24–00600). Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

×

Sobre autores

A. Zelentsova

Belgorod State National Research University

Email: marinaskorkina0077@gmail.com
Rússia, Belgorod

V. Shmigerova

Belgorod State National Research University

Email: marinaskorkina0077@gmail.com
Rússia, Belgorod

Y. Stepenko

Belgorod State National Research University

Email: marinaskorkina0077@gmail.com
Rússia, Belgorod

M. Skorkina

Belgorod State National Research University

Autor responsável pela correspondência
Email: marinaskorkina0077@gmail.com
Rússia, Belgorod

A. Deykin

Belgorod State National Research University

Email: marinaskorkina0077@gmail.com
Rússia, Belgorod

Bibliografia

  1. Papp L, Balázsa T, Köfalvi A, Erdélyi F, Szabó G, Vizi ES, Sperlágh B (2004) P2X receptor activation elicits transporter-mediated noradrenaline release from rat hippocampal slices. J Pharmacol Exp Ther 3: 973–380. https://doi.org/10.1124/jpet.104.066712
  2. Rodrigues RJ, Almeida T, Richardson PJ, Oliveira CR, Cunha RA (2005) Dual presynaptic control by ATP of glutamate release via facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 receptors in the rat hippocampus. J Neurosci 25: 6286–6295. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0628-05.2005
  3. Pankratov Y, Lalo U, Krishtal OA, Verkhratsky A (2009) P2X receptors and synaptic plasticity. Neuroscience 158: 137–148. https://doi.org/10.1016/j.neuroscience.2008.03.076
  4. Abbracchio MP, Burnstock G (1998) Purinergic signalling: Pathophysiological roles. Jpn J Pharmacol 78: 113–145. https://doi.org/10.1254/jjp.78.113
  5. Burnstock G, Knight GE (2004) Cellular distribution and functions of P2 receptor subtypes in different systems. Int Rev Cytol 240: 31–304. https://doi.org/10.1016/S0074-7696(04)40002-3
  6. Mishra SK, Braun N, Shukla V, Füllgrabe M, Schomerus C, Korf HW, Gachet C, Ikehara Y, Sévigny J, Robson SC, Zimmermann H (2006) Extracellular nucleotide signaling in adult neural stem cells: synergism with growth factor-mediated cellular proliferation. Development 133: 675–684. https://doi.org doi: 10.1242/dev.02233
  7. Brederson JD, Jarvis MF (2008) Homomeric and heteromeric P2X3 receptors in peripheral sensory neurons. Curr Opin Investig Drugs 9: 716–725.
  8. Burnstock G (2015) Physiopathological roles of P2X receptors in the central nervous system. Curr Med Chem 22: 819–844. https://doi.org/10.2174/0929867321666140706130415
  9. Burnstock G (2017) Purinergic signalling: therapeutic developments. Front Pharmacol 8: 661. https://doi.org/10.3389/fphar.2017.00661
  10. Pedata F, Dettori I, Coppi E (2016) Purinergic signalling in brain ischemia. Neuropharmacology 104: 105–130. https://doi.org/10.1016/j.neuropharm.2015.11.007
  11. Heine C, Sygnecka K, Franke H (2016) Purines in neurite growth and astroglia activation. Neuropharmacology 104: 255–271. https://doi.org/10.1016/j.neuropharm.2015.10.022
  12. Heine C, Heimrich B, Vogt J, Wegner A, Illes P, Franke H (2006) P2 receptor-stimulation influences axonal outgrowth in the developing hippocampus in vitro. Neuroscience 138: 303–311. https://doi.org/10.1016/j.neuroscience.2005.11.056
  13. Lommen J, Detken J, Harr K, von Gall C, Ali AAH (2021) Analysis of spatial and temporal distribution of purinergic P2 receptors in the mouse hippocampus. Int J Mol Sci 22: 8078. https://doi.org/10.3390/ijms22158078
  14. Pankratov YV, Lalo UV, Krishtal OA (2002) Role for P2X receptors in long-term potentiation. J Neurosci 22: 8363–8369. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.22-19-08363.2002
  15. Lüscher C, Malenka RC (2012) NMDA receptor-dependent long-term potentiation and long-term depression (LTP/LTD). Cold Spring Harb Perspect Biol 4: a005710. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a005710
  16. Cheung K-K, Burnstock G (2002) Localization of P2X3 receptors and coexpression with P2X2 receptors during rat embryonic neurogenesis. J Comp Neur 443: 368–382. https://doi.org/10.1002/cne.10123
  17. Gong M, Ye S, Li WX, Zhang J, Liu Y, Zhu J, Lv W, Zhang H, Wang J, Lu A, He K (2020) Regulatory function of praja ring finger ubiquitin ligase 2 mediated by the P2rx3/P2rx7 axis in mouse hippocampal neuronal cells. Am J Physiol Cell Physiol 318: C1123–C1135. https://doi.org/10.1152/ajpcell.00070.2019
  18. Devine MJ, Kittler JT (2018) Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nat Rev Neurosci 19: 63–80. https://doi.org/10.1038/nrn.2017.170
  19. Na S, Collin O, Chowdhury F, Tay B, Ouyang M, Wang Y, Wang N (2008) Rapid signal transduction in living cells is a unique feature of mechanotransduction. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 6626–6631. https://doi.org/10.1073/pnas.0711704105
  20. Kaech S, Banker G (2006) Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc 1: 2406–2415. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.356
  21. Carter DS, Alam M, Cai H, Dillon MP, Ford APDW, Gever J (2009) Identification and SAR of novel diaminopyrimidines. Part 1: the discovery of RO-4. a dual P2X3/P2X2/3 antagonist for the treatment of pain. Bioorg Med Chem Lett 19: 1628–1631. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2009.02.003
  22. Spedden E, Staii C (2013) Neuron biomechanics probed by atomic force microscopy. Int J Mol Sci 14: 16124–16140. https://doi.org/10.3390/ijms140816124
  23. Jiang FX, Lin DC, Horkay F, Langrana NA (2011) Probing mechanical adaptation of neurite outgrowth on a hydrogel material using atomic force microscopy. Ann Biomed Eng 39: 706–713. https://doi.org/10.1007/s10439-010-0194-0
  24. Xiong Y, Lee AC, Suter DM, Lee GU (2009) Topography and nanomechanics of live neuronal growth cones analyzed by atomic force microscopy. Biophys J 96: 5060–5072. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2009.03.032
  25. Skorkina MY, Fedorova MZ, Sladkova EA, Muravuov AV (2012) The use of nanomechanic sensor for studies of morphofunctional properties of lymphocytes from healthy donors and patients with chronic lymphoblastic leukemia. Bull Exp Biol Med 154: 163–166. https://doi.org/10.1007/s10517-012-1899-x
  26. Lowery LA, Van Vactor D (2009) The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol: 332–343. https://doi.org/10.1038/nrm2679
  27. Kronlage C, Schafer-Herte M, Boning D, Oberleithner H, Fels J (2015) Feeling for filaments: quantification of the cortical actin web in live vascular 10endothelium Biophys J 109: 687–698. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2015.06.066
  28. Spedden E, White JD, Naumova EN, Kaplan DL, Staii C (2012) Elasticity maps of living neurons measured by combined fluorescence and atomic force microscopy. Biophys J 103: 868–877. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2012.08.005
  29. Coles CH, Bradke F (2015) Coordinating neuronal actin-microtubule dynamics. Curr Biol 25: R677–R691. https://doi.org/10.1016/j.cub.2015.06.020
  30. Pollard TD, Cooper J (2009) Actin: a central player in cell shape and movement. Science 326: 1208–1212. https://doi.org/10.1126/science.1175862
  31. Verstegen AM, Tagliatti E, Lignani G, Marte A, Stolero T, Atias M, Corradi A, Valtorta F, Gitler D, Onofri F, Fassio A, Benfenati F (2014) Phosphorylation of synapsin I by cyclin-dependent kinase-5 sets the ratio between the resting and recycling pools of synaptic vesicles at hippocampal synapses. J Neurosci 34: 7266–7280. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.3973-13.2014
  32. Cesca F, Baldelli P, Valtorta F, Benfenati F (2010) The synapsins: key actors of synapse function and plasticity. Prog Neurobiol 91: 313–348. https://doi.org/10.1016/j.pneurobio.2010.04.006.
  33. Gu Y, Wang C, Li G, Huang LY (2016) EXPRESS: F-actin links Epac-PKC signaling to purinergic P2X3 receptors sensitization in dorsal root ganglia following inflammation. Mol Pain 12: 1744806916660557. https://doi.org/10.1177/1744806916660557
  34. Goswami C, Kuhn J, Heppenstall PA, Hucho T (2010) Importance of non-selective cation channel TRPV4 interaction with cytoskeleton and their reciprocal regulations in cultured cells. PLoS One 5: e11654. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0011654
  35. Bele T, Fabbretti E (2016) The scaffold protein calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase controls ATP release in sensory ganglia upon P2X3 receptor activation and is part of an ATP keeper complex. J Neurochem 138: 587–597. https://doi.org/10.1111/jnc.13680
  36. Gillespie JM, Hodge JJ (2013) CASK regulates CaMKII autophosphorylation in neuronal growth, calcium signaling, and learning. Front Mol Neurosci 6: 27. https://doi.org/10.3389/fnmol.2013.00027
  37. Gnanasekaran A, Bele T, Hullugundi S, Simonetti M, Ferrari MD, van den Maagdenberg AM, Nistri A, Fabbretti E (2013) Mutated CaV2.1 channels dysregulate CASK/P2X3 signaling in mouse trigeminal sensory neurons of R192Q Cacna1a knock-in mice. Mol Pain 9: 62. https://doi.org/10.1186/1744-8069-9-62
  38. Soares J, Araujo GRS, Santana C, Matias D, Moura-Neto V, Farina M, Frases S, Viana NB, Romão L, Nussenzveig HM, Pontes B (2020) Membrane elastic properties during neural precursor cell differentiation. Cells 9: 1323. https://doi.org/10.3390/cells9061323
  39. Pontes B, Ayala Y, Fonseca AC, Romão LF, Amaral RF, Salgado LT, Lima FR, Farina M, Viana NB, Moura-Neto V, Nussenzveig HM (2013) Membrane elastic properties and cell function. PLoS One 8: e67708. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0067708
  40. Abbracchio MP, Ceruti S (2006) Roles of P2 receptors in glial cells: focus on astrocytes. Purinerg Signal 2: 595–604. https://doi.org/10.1007/s11302-006-9016-0
  41. Fumagalli M, Brambilla R, D'Ambrosi N, Volonté C, Matteoli M, Verderio C, Abbracchio MP (2003) Nucleotide-mediated calcium signaling in rat cortical astrocytes: Role of P2X and P2Y receptors. Glia 43: 218–223. https://doi.org/10.1002/glia.10248
  42. Abbracchio MP, Saffrey MJ, Hopker V, Burnstock G (1994) Modulation of astroglial cell proliferation by analogues of adenosine and ATP in primary cultures of rat striatum. Neuroscience 59: 67–76. https://doi.org/10.1016/0306-4522(94)90099-x
  43. Rose J, Brian C, Pappa A, Panayiotidis MI, Franco R (2020) Mitochondrial metabolism in astrocytes regulates brain bioenergetics. Neurotransmission and redox balance. Front Neurosci 14: 536682. https://doi.org/10.3389/fnins.2020.536682
  44. Séguéla P, Haghighi A, Soghomonian JJ, Cooper E (1996) A novel neuronal P2x ATP receptor ion channel with widespread distribution in the brain. J Neurosci 16: 448–455. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-02-00448.1996
  45. Rodrigues RJ, Almeida T, Díaz-Hernández M, Marques JM, Franco R, Solsona C, Miras-Portugal MT, Ciruela F, Cunha RA (2016) Presynaptic P2X1–3 and α3-containing nicotinic receptors assemble into functionally interacting ion channels in the rat hippocampus. Neuropharmacology 105: 241–257. https://doi.org/10.1016/j.neuropharm.2016.01.022
  46. Cunha RA, Vizi ES, Ribeiro JA, Sebastião AM (1996) Preferential release of ATP and its extracellular catabolism as a source of adenosine upon high- but not low-frequency stimulation of rat hippocampal slices. J Neurochem 67: 2180–2187. https://doi.org/10.1046/j.1471-4159.1996.67052180.x
  47. Levy M, Faas GC, Saggau P, Craigen WJ, Sweatt JD (2003) Mitochondrial regulation of synaptic plasticity in the hippocampus. J Biol Chem 278: 17727–17734. https://doi.org/10.1074/jbc.M212878200
  48. Zhou X, Ma LM, Xiong Y, Huang H, Yuan JX, Li RH, Li JN, Chen YM (2016) Upregulated P2X3 receptor expression in patients with intractable temporal lobe epilepsy and in a rat model of epilepsy. Neurochem Res 41: 1263–1273. https://doi.org/10.1007/s11064-015-1820-x
  49. Chen Y, Zhang X, Wang C, Li G, Gu Y, Huang LY (2008) Activation of P2X7 receptors in glial satellite cells reduces pain through downregulation of P2X3 receptors in nociceptive neurons. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 16773–16778. https://doi.org/10.1073/pnas.0801793105

Arquivos suplementares

Arquivos suplementares
Ação
1. JATS XML
Baixar
2. Fig. 1. Atomic force spectroscopy procedure of the neuron cell surface on the first day of differentiation in culture: (a) – schematic diagram of sample scanning: cell on a substrate; cantilever that moves along the cell surface; laser beam is tuned to a flexible cantilever console that deflects when moving along the surface and transmits information to a 4-section photodiode, (b) – neuron image obtained by scanning in Nova software with load (1 nN) applied at 25 points on the surface, (c) – approach (blue) and retraction (red) curves at each load application point, based on which the software constructs local elasticity maps, (d) – local elasticity map of the neuron surface (dark areas of the map indicate high values ​​of Young's modulus, and therefore higher surface rigidity).

Baixar (174KB)
Metadados
3. Fig. 2. Young's modulus of the cell surface of the primary mixed culture of E18 neurons under conditions of P2X3 receptor blockade. * significant differences at p < 0.05 according to Student's criterion.

Baixar (99KB)
Metadados
4. Fig. 3. Metabolic map of the energy phenotype of the primary mixed neuronal culture: the following respiration regions are indicated: Aerobic – aerobic respiration; Quiescence – respiratory rest; Energy – cellular metabolism based on mixed respiration (oxidative phosphorylation and glycolysis); Glycolytic – anaerobic respiration. The control group is shown in gray, the experimental group (Ro-4 blocker) in black. Filled squares indicate respiration before the blockade of the electron transport chain, unfilled squares indicate respiration after the blockade of the electron transport chain by stressors.

Baixar (113KB)
Metadados

Declaração de direitos autorais © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».