2-APB prevents atrophic changes and alters cellular signalling during unloading of rat M. Soleus

封面

如何引用文章

全文:

详细

IP3 receptors are found in significant quantities in muscle fibers in the sarcoplasmic reticulum, nucleus and mitochondria. We hypothesized that activation of IP3 receptors (IP3Rs) during muscle unloading may induce a weak calcium release signal, both cytosolic and nucleoplasmic, that promotes (possibly with other signaling cascades) the activation of transcription factors, leading to the expression or repression of genes involved in muscle phenotype. This hypothesis was tested by blocking IP3R during unloading of rat muscles by administering 2-APB (2-aminoethoxydiphenyl borate). Wistar rats were administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/mg in 5 % DMSO daily. We found that the IP3R state influences the development of atrophic processes in the postural m. soleus during unloading. Administration of the IP3R blocker 2-APB to animals successfully prevented a decrease in m. soleus cross-sectional area (CSA) of both fast and slow muscle fibers. The slowdown in CSA decrease upon administration IP3R inhibitor during 7 days m. soleus unloading is associated with the prevention of a decrease in ribosomal biogenesis and an increase in the expression of autophagy markers ULK-1 and IL-6.

全文:

ВВЕДЕНИЕ

Функциональная разгрузка скелетных мышц включает в себя отсутствие или же значительное снижение активности мышц, а также механической нагрузки на мышцу. Такое состояние в той или иной степени наблюдается в условиях постельной гипокинезии, гипсовой иммобилизации конечностей при травмах, а также в условиях микрогравитации при космическом полете. В лабораторных условиях функциональную разгрузку изучают с использованием модели вывешивания задних конечностей грызунов [1]. Функциональная разгрузка приводит к развитию атрофии и слабости мышц, которые сохраняются достаточно долгое время после возвращения к нормальному режиму активности. Молекулярные механизмы развития этих процессов изучены недостаточно, в частности, роль кальций-зависимых сигнальных путей. При функциональной разгрузке мышц обнаружено накопление ионов Ca2+ в мышечных волокнах [2, 3] и в миоядрах [4], а активация кальций-зависимых протеаз кальпаинов вносит существенный вклад в деградацию цитоскелетных белков камбаловидной мышцы [5]. Похожее накопление кальция в миоплазме происходит при ряде патологических состояний, таких как старение или различные миодистрофии [6, 7], и может вносить вклад в развитие атрофических процессов. Помимо непосредственного участия в атрофии за счет активации протеолиза, кальций может работать и как регулятор транскрипции генов [8].

Ионы кальция при разгрузке мышц поступают в саркоплазму из саркоплазматического ретикулума (СР) в ответ на деполяризацию мышечной мембраны через механизм сопряжения DHPR/RyR (дигидропиридиновые рецепторы/рианодиновые каналы) [9]. IP3-рецепторы (IP3R) также находятся в СР, митохондриях, а также в ядре и в дополнение к поглощению Ca2+ в СР, регулируют обмен кальция с ядром [10, 11]. Пропускная способность IP3R регулируется ионами Са2+ и IP3, при этом в зависимости от концентрации IP3 IP3R варьируют силу кальциевого сигнала [12]. IP3 вырабатывается после активации различных рецепторов плазматической мембраны клетки внеклеточными сигналами [13]. SERCA (саркоплазматическая Ca2+АТФаза) играет ключевую роль в удалении ионов кальция из СР и ее активность при разгрузке мышц снижена [14, 15]. Мы полагаем, что снижение ее активности при разгрузке мышц может вносить дополнительный вклад в накопление кальция в мышечных волокнах. Высвобождение Ca2+, вызванное деполяризацией клеток скелетных мышц, можно разделить на два независимых компонента: быстрый транзитный Ca2+, равномерно распределенный по клетке, что соответствует сопряжению возбуждения и сокращения, и медленный транзитный Ca2+ с отчетливым ядерным компонентом, генерируемый IP3 [16]. «Медленный» Ca2+ может стимулировать активацию внутриклеточных сигнальных путей и мышечную атрофию, а также участвует в сопряжении возбуждения и транскрипции [17–19]. Термин «медленный» кальций относится к ионам Ca2+, повышенная концентрация которых не связана с сокращением и сохраняется в саркоплазме в течение длительного времени (пик достигается через 60–100 с и в основном связан с ядрами клеток). В работах [20, 21] в экспериментах на культуре миотуб было обнаружено, что медленные кальциевые процессы опосредованы IP3, но не RyR. В работах с участием Jaimovich (2000–2023 гг.) показано, что IP3R необходимы для нормальной активности скелетных мышц, оказывая свое действие путем регулирования экспрессии генов, энергетического обмена и активности митохондрий. Мы полагаем, что при функциональной разгрузке скелетных мышц механизм генерации IP3 может осуществляться посредством активации метаботропных пуринергических рецепторов P2Y внеклеточным АТФ, высвобождаемым через механизм, зависимый от паннексина 1, сопряженного с работой сенсора напряжения DHPR. Ранее аналогичный механизм был описан в лаборатории Jaimovich в экспериментах на культуре миотуб, мышечных волокон, а также в модели mdx мышей [20, 22–24]. Инактивация Na, K-АТФазы при разгрузке мышц приводит к деполяризации сарколеммы [9], что, в свою очередь, вызывает активацию DHPR [25] и открытие RyR. DHPR соединены в сарколемме с паннексиновыми каналами. Нами показано, что при функциональной разгрузке АТФ из мышцы через паннексиновые каналы может выходить во внеклеточное пространство [26]. Эти нуклеотиды затем могут взаимодействовать с каналами P2Y (G protein Y-coupled receptors) [27]. Известно, что они активируют PI3 K gamma (PI3K) (в Т-каналах мембраны) и в конечном итоге запускают образование инозитол-1,4,5-трифосфата (IP3). Затем IP3 может связываться с IP3R, присутствующими в саркоплазматической сети, митохондриях и в ядерной мембране, вызывая высвобождение кальция в нуклеоплазме, что способствует (вероятно, вместе с другими сигнальными каскадами) активации факторов транскрипции, приводящей к экспрессии или репрессии генов, вовлеченных в регуляцию фенотипа мышечных клеток. Отмечено, что IP3-опосредованный кальциевый сигнал вызывал активацию ряда транскрипционных факторов и генов [17, 28]. Гипотеза о роли кальций-зависимой регуляции экспрессии генов при разгрузке скелетных мышц была выдвинута Kandarian и Stevenson в 2002 г. [29].

Мы полагаем, что накопление ионов кальция и IP3 в миоплазме при функциональной разгрузке может вызвать активацию IP3R, что может способствовать (возможно, совместно с другими сигнальными каскадами) активации транскрипционных факторов и стимулировать запуск атрофических процессов при разгрузке мышц. К настоящему времени не было изучено, какую роль играют IP3R при функциональной разгрузке мышц в контроле атрофических процессов. Мы впервые проверяли эту гипотезу в нашем исследовании, применив ингибирование IP3R при функциональной разгрузке m. soleus в модели вывешивания задних конечностей крыс в течение 7 суток, т. к. известно, что после 7 суток вывешивания происходит достоверное снижение размеров волокон камбаловидной мышцы и трансформация миозинового фенотипа волокон из «медленного» в «быстрый». Если наша гипотеза верна, то ингибирование IP3R при функциональной разгрузке должно снизить развитие протеолитических процессов и предотвратить усиление распада белка в мышце.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведение эксперимента

Функциональная разгрузка моделировалась вывешиванием задних конечностей по стандартной методике Ильина – Новикова в модификации Morey-Holton [1]. Вывешивание проводилось под углом 45 градусов к полу клетки так, что задние конечности крыс не касались пола, а передние свободно опирались на пол, и животные свободно передвигались. Пищу и воду животные получали ad libitum. 32 самца крыс линии Wistar были распределены на 4 группы – виварный контроль с введением плацебо (7С, n = 8), виварный контроль с введением препарата 2-APB (2-aminoethoxydiphenyl borate) (7СA, n = 8), группа вывешивания с введением плацебо (7НS, n = 8) и группа вывешивания с введением препарата 2-APB (7НSA, n = 8). Препарат вводился внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг в 5 %-ном растворе ДМСО ежедневно. Применение этого ингибитора in vivo было описано ранее [30]. 2-APB, широко применяемый в качестве ингибитора IP3R препарат [31], ингибирует IP3-зависимые сигналы [19]. Известные для него неспецифические эффекты вызывались большими концентрациями в разы, а в некоторых случаях на порядки [32], чем используемая нами для ингибирования IP3R доза препарата.

Через 7 дней эксперимента крыс наркотизировали авертином (5 мл/кг массы тела 10 %-ного раствора), выделяли m. soleus и немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при –85 °C до проведения анализов. Эвтаназия крыс осуществлялась дислокацией шейных позвонков под авертиновым наркозом.

Электрофорез и Вестерн-блоттинг

Для выделения тотальной фракции белка с образцов m. soleus на микротоме-криостате фирмы Leica были сделаны срезы толщиной 20 мкм (общей массой 15–20 мг на 1 пробу) и немедленно прогомогенизированы в шариковом гомогенизаторе TissueLyser LT (QIAGEN, Германия) в течение 25 мин в 100 мкл лизирующего буфера RIPA (Santa-Cruz, США), содержащего 50 мМ Tris (pH 7.4), 150 мМ NaCl, 0.1 % Triton X-100, 0.1 % SDS, 5 мМ EDTA (pH 8.0), 1 мМ DTT, 1 мМ PMSF, 1мМ Na3VO4, 1 мМ PMSF, апротинин (10 мкг/мл), леупептин (10 мкг/мл), пепстатин А (10 мкг/мл), протеазный ингибиторный коктейль (Santa-Cruz, США) и фосфатазный ингибиторный коктейль (Santa-Cruz, США). Затем образцы центрифугировали при 20000 g в течение 15 мин. Супернатант отбирали, разаликвотировали и убирали на хранение при –85 °C.

Часть мышечных лизатов отбирали для определения концентрации общего белка с помощью реактива Бредфорда (Bio-Rad Laboratories, США). Определения проводились на планшетном фотометре Epoch при длине волны 595 нм. Пробы для нанесения разводились в 2-кратном Laemli-буфере для образцов (5.4 мМ Tris-HCl (pH 6.8), 4 %-ный Ds-Na, 20 %-ный глицерин, 10 %-ный β-меркаптоэтанол, 0.02 %-ный бромфеноловый синий). Заливку и подготовку ПААГ гелей проводили с помощью заливочных столов фирмы и стекол «Bio-Rad Laboratories». Гели устанавливали в камеры mini-Protean 3 Cell «Bio-Rad Laboratories». Электрофорез проводили в 10 %-ном разделяющем ПААГ (0.2 %-ный метилбисакриламид, 0.1 %-ный Ds-Na, 375 мМ Tris-HCl (pH 8.8), 0.05 %-ный персульфат аммония, 0.1 %-ный ТЕМЕД) и в 5 %-ном концентрирующем ПААГ (0.2 %-ный метилбисакриламид, 0.1 %-ный Ds-Na, 125 мМ Tris-HCl (pH 6.8), 0.5 %-ный аммоний персульфат, 0.1 %-ный ТЕМЕД). Для проведения электрофореза был использован трис-глициновый буфер (192 мМ Tris-глицин (pH 8.6), 0.1 %-ный Ds-Na). Образцы каждой группы загружались на один гель с контрольными образцами и маркерами молекулярных весов. Образцы загружались из расчета 20 мкг общего белка на дорожку. Уровень фосфорилирования белков определяли, нормируя содержание фосфорилированной формы белка на содержание тотальной формы этого же белка в образце. Электрофорез проводился при 15 мА на гель в мини-системе («Bio-Rad Laboratories») при комнатной температуре. После электрофореза гели переносились в установку для электропереноса белков на мембрану. Электроперенос проводился в буфере (25 мМ Tris (pH 8.3), 192 мМ глицин, 20 %-ный этанол, 0.04 %-ный Ds-Na) на нитроцеллюлозную мембрану при 100 V при температуре 4 °C в системе mini Trans-Blot («Bio-Rad Laboratories») в течение 2 ч. После электропереноса мембраны инкубировались в течение 5 мин в 0.3 %-ном растворе Ponceau Red в 5 %-ной уксусной кислоте, затем отмывались в PBS (Биолот) с 0.1 %-ным Tween 20 (PBST) до появления четких белковых полос на мембране. Этот этап проводился для контроля эффективности переноса; а также для того, чтобы убедиться, что количество общего белка, внесенного в каждую дорожку, было одинаковым. Мембраны блокировались в растворе 5 %-ного сухого молока («Bio-Rad Laboratories») в PBST в течение 1 ч при комнатной температуре, затем помещались в раствор первичных антител на ночь при 4 °C. Для выявления белковых полос были использованы первичные антитела против p-CaMKIIb (1: 1000, #12716), CaMKII (1: 1000, #3362) фирмы «Cell Signaling Technology». На следующий день мембрана отмывалась от первичных антител в PBST 3 раза по 5 мин на шейкере и инкубировалась 1 ч со вторичными антителами goat-anti-rabbit (1: 30000, «Jackson Immuno Research», США). Потом мембрана отмывалась от вторичных антител в PBST 3 раза по 5 мин на шейкере. Выявление проводилось с помощью Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad Laboratories, США). Хемилюминесцентный сигнал детектировался с помощью сканера C-DiGit Blot Scanner (LI–COR, США). Мембраны, на которых детектировали данные белки, после детекции содержания фосфорилированной формы белка отмывали в восстанавливающем растворе Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific), после чего анализировали содержание тотальной формы на этих же мембранах путем инкубирования с первичными антителами к тотальным формам белков в течение ночи при 4 °C. Затем мембраны отмывали и инкубировали со вторичными антителами и проявляли, как описано выше. Для каждого параметра электрофорез с последующим иммуноблоттингом был повторен не менее 3 раз. Белковые полосы были анализированы с использованием Image Studio Software (LI–COR). Хемилюминесцентный сигнал полосы контрольной группы на анализируемой мембране принимали за 100 %, а сигнал полос других групп сравнивали с сигналом полос контрольной группы, расположенных на одной и той же мембране.

ПЦР в реальном времени

Для исследования экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени проводили выделение РНК из образцов мышечной ткани. Для выделения РНК из скелетных мышц была использована методика выделения РНК на микроколонках «RNeasy Micro» («Qiagen», Германия) согласно рекомендациям производителя. Определение концентрации мРНК осуществлялось по поглощению раствора мРНК при помощи спектрофотометра NanoPhotometer IMPLEN. Измерение каждой пробы проводилось не менее 3 раз. Для проведения обратной транскрипции были использованы реагенты фирмы «Синтол» (Россия) согласно рекомендациям производителя. Праймеры сконструированы с помощью программы Primer3 v.0.4.0, находящейся в свободном доступе (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). В работе были использованы следующие праймеры: 5’-gccaatttggtgctttttgt-3’ и 5’-aaattcagtcctctccccgt-3’ для MuRF-1; 5’-ctacgatgttgcagccaaga-3’ и 5’-ggcagtcgagaagtccagtc-3’ для MAFbx; 5’-caccaagaaggtcaaacagga-3’ и 5’-gcaagaactttattcaaag-tgcaa-3’ для убиквитина; 5’- ccggagaggagacttcacag-3’ и 5’-acagtgcatcatcgctgttc-3’ для IL6, 5'-cat-gac-ctc-cct-tgc-atg-taa-c-3' и 5'-acc-agg-tgg-tgg-gta-agg-aac-3' для ULK1, 5'-cag-gaa-cgt-ggg-cca-taa-ca-3' и 5'-tcc-aga-gct-tca-tcg-cca-tc-3' для IP3R, 5’-gta-ccc-ttc-ctc-ttc-cct-atg-c-3’ и 5’-caa-tgc-caa-ctc-tcg-tca-aca-g-3’ для RPL19. Для проведения ПЦР в реальном времени использовали набор для проведения ПЦР в реальном времени с добавлением SYBR Green фирмы «Синтол» (Россия) согласно рекомендациям производителя.

Электрофорез РНК

Для проведения электрофореза РНК, выделенную как описано ранее, смешивали с равным объемом денатурирующего буфера для нанесения (Thermo Scientific, США) и нагревали 10 мин при 70 °C согласно рекомендациям производителя. Для электрофореза использовали 1.2 %-ный агарозный гель с использованием бромистого этидия (0.5 мкг/мл), приготовленный на буфере TBE (89 мМ ТРИС, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА, pH 8.0). Электрофорез проводили при напряжении 10 В/см длины геля в буфере TBE. Для определения длин полос РНК использовали маркеры RiboRuler (Thermo Scientific, США). Результаты электрофореза визуализировали на Gel Doc EZ Imager (Biorad, США). Для обсчета результатов использовали программное обеспечение Image Studio Digits v. 4.0. Степень деградации РНК определяли по вычислению соотношения 28S РНК к 18S РНК.

Иммуногистохимический анализ

C помощью криомикротома изготавливали поперечные срезы замороженной мышцы толщиной 9 мкм. Срезы высушивали на воздухе и хранили при –20 °C. Перед окрашиванием срезы оттаивали и регидратировали при комнатной температуре в фосфатно-буферном растворе (PBS) в течение 20 мин, а затем инкубировали с антителами против тяжелых цепей миозина быстрого или медленного типов (MHCI и MHCII, Sigma, США) 1: 400 в PBS во влажной камере при 37 °C в течение часа (или при 4 °C на ночь). Затем антитела отмывали в PBS 3 раза по 5 мин. Инкубацию со вторичными антителами, конъюгированными с AlexaFluor (1: 500) в PBS, проводили в течение 40 мин при комнатной температуре. После отмывки вторичных антител срезы заключали в среду, стабилизирующую флуоресцентную метку. Срезы анализировали с использованием флуоресцентного микроскопа LeicaQ500MC с встроенной цифровой фотокамерой (TCM 300F, Leica, Германия), с увеличением х200. Анализ изображений проводился с помощью программы Image J. Измеряли площадь поперечного сечения по крайней мере 100 волокон.

Статистическая обработка данных

Для анализа данных полученных с помощью ПЦР в реальном времени, применялось относительное количественное определение исследуемого гена, нормализованное к референсному, метод 2-ΔΔСt (метод Ливака). В качестве референсного гена был использован RPL19, экспрессия которого постоянна в m. soleus в условиях эксперимента. Статистическая обработка данных производилась с помощью программы REST 2009 v.2.0.12, пакета SigmaPlot 11.0 (Systat Software, Inc., 2008). Достоверность отличий между группами определялась с помощью критерия Краскела – Уоллиса. В тексте и на гистограммах результаты ПЦР представлены в виде медианы и интерквартильной широты. Количество (n) в выборках равно 8. Статистически достоверными различия считали при уровне значимости p ˂ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Мы не обнаружили различий в массе m. soleus и индексе сырой массы m. soleus между вывешенными HS и HSA группами (они были ниже, чем у контрольных групп С и CA), рис. 1.

 

Рис. 1. Масса тела животных (а), масса m. soleus (b) и индекс сырой массы m. soleus (c). 7С – виварный контроль с введением плацебо, 7СA – виварный контроль с введением 2-APB, 7HS – 7-суточное вывешивание с введением плацебо, 7HSA – 7-суточное вывешивание с введением 2-APB. * – значимые отличия между группами (p < 0.001).

 

В то же время мы обнаружили, что площадь поперечного сечения как медленных, так и быстрых мышечных волокон m. soleus в группе 7-суточного вывешивания (7HS) была достоверно ниже значений групп контроля (7С и 7СA) (p < 0.05), рис. 2. Введение ингибитора IP3R при вывешивании (7HSA) предотвратило снижение площади поперечного сечения медленных и быстрых мышечных волокон (их значения не отличались от групп контроля и были достоверно выше, чем в группе 7HS (p < 0.001)).

 

Рис. 2. Площадь поперечного сечения медленных волокон (а), быстрых волокон (b) и микрофотографии иммуногистохимической окраски медленного миозина (зеленые) и быстрого миозина (красные) (c). 7С – виварный контроль с введением плацебо, 7СA – виварный контроль с введением 2-APB, 7HS – 7-суточное вывешивание с введением плацебо, 7HSA – 7-суточное вывешивание с введением 2-APB. * – значимые отличия между группами. Размерная полоса равна 200 мкм.

 

Мы обнаружили существенное снижение содержания маркеров рибосомального биогенеза рРНК 18S (малая субъединица рибосомы) и pРНК 28S (большая субъединица рибосомы) только у вывешенных без введения ингибитора IP3R животных (группа 7HS, рис. 3) относительно контрольных групп.

 

Рис. 3. Содержание 18S рРНК (a), 28S рРНК (b) в m. soleus при введении 2-APB на фоне 7-суточного вывешивания. 7С – виварный контроль с введением плацебо, 7СA – виварный контроль с введением 2-APB, 7HS – 7-суточное вывешивание с введением плацебо, 7HSA – 7-суточное вывешивание с введением 2-APB, * – значимые отличия между группами.

 

Экспрессия маркеров убиквитин-протеасомной системы Е3 лигаз MuRF1 и MAFbx/Atrogin-1, а также убиквитина была существенно повышена в обеих вывешенных группах крыс (относительно групп контроля), рис. 4. Введение ингибитора IP3R не выявило отличий по сравнению с группой вывешивания без препарата 7HS.

 

Рис. 4. Экспрессия мРНК MuRF1 (а), MAFbx (b), убиквитина (c) в m. soleus при введении 2-APB на фоне 7-суточного вывешивания. 7С – виварный контроль с введением плацебо, 7СA – виварный контроль с введением 2-APB, 7HS – 7-суточное вывешивание с введением плацебо, 7HSA – 7-суточное вывешивание с введением 2-APB. * – значимые отличия между группами.

 

Уровень экспрессии мРНК маркера аутофагии ULK1 (серин-пролиновая киназа, участвующая в аутофагии) был повышен только в группе вывешивания без препарата (7HS), но не в группе с введением ингибитора IP3R (7HSA) относительно групп контроля, рис. 5а. Аналогичные результаты были получены и для экспрессии мРНК интерлейкина 6 (IL6) и рецепторов IL6 (IL6R). Мы обнаружили предотвращение увеличения экспрессии мРНК IL6 (рис. 5b) в группе 7HSA при введении ингибитора IP3R во время вывешивания крыс относительно группы 7С.

 

Рис. 5. Экспрессия мРНК ULK1 (а) и IL6 (b) в m. soleus при введении 2-APB на фоне 7-суточного вывешивания. 7С – виварный контроль с введением плацебо, 7СA – виварный контроль с введением 2-APB, 7HS – 7-суточное вывешивание с введением плацебо, 7HSA – 7-суточное вывешивание с введением 2-APB. * – значимые отличия между группами.

 

Содержание маркеров кальций-зависимых сигнальных путей IP3R и p-CaMK при 7-дневном вывешивании крыс. Фосфорилирование кальций-кальмодулинкиназы IIb (CaMKIIb) было увеличено в ненагруженной камбаловидной мышце (гр. HS) относительно группы контроля, рис. 6. Введение ингибитора IP3R предотвратило эти изменения. Аналогичные результаты получены для содержания мРНК IP3R, рис. 7.

 

Рис. 6. Уровень фосфорилирования CaMKIIb в m. soleus при введении 2-APB на фоне 7-суточного вывешивания. 7С – виварный контроль с введением плацебо, 7СA – виварный контроль с введением 2-APB, 7HS – 7-суточное вывешивание с введением плацебо, 7HSA – 7-суточное вывешивание с введением 2-APB. * – значимые отличия между группами.

 

Рис. 7. Экспрессия мРНК IP3R в m. soleus при введении 2-APB на фоне 7-суточного вывешивания. 7С – виварный контроль с введением плацебо, 7СA – виварный контроль с введением 2-APB, 7HS – 7-суточное вывешивание с введением плацебо, 7HSA – 7-суточное вывешивание с введением 2-APB. * – значимые отличия между группами.

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Введение блокатора IP3R2-APB вывешенным животным успешно предотвращало снижение площади поперечного сечения как быстрых, так и медленных волокон камбаловидной мышцы. В то же время возникает вопрос, по каким причинам предотвращение атрофии волокон камбаловидной мышцы не отражается на изменении массы мышц экспериментальных животных (рис. 1). Расхождение данных по площади поперечного сечения волокон и массы мышц может быть связано с неволоконными компонентами мышц, такими как внеклеточный матрикс и жидкость (вода, кровь, лимфа). В частности, известно, что в условиях вывешивания снижается мышечный кровоток и, соответственно, кровенаполнение камбаловидной мышцы [33], что могло повлиять на массу мышц. Причины снижения степени атрофии m. soleus при функциональной разгрузке могут быть в следующем: гипокинезия приводит к атрофии скелетных мышц из-за нарушения баланса между синтезом белка и его деградацией [34].

Маркеры анаболического сигналинга. рРНК осуществляют трансляцию – считывание информации с мРНК и катализ образования пептидных связей между присоединенными к тРНК аминокислотами. В группе 7HSA (с введением ингибитора IP3R) существенных отличий от групп контроля по этим параметрам не наблюдалось. Таким образом, введение 2-APB вывешенным животным (7HSA) приводит к предотвращению снижения содержания рибосомальных РНК 18S и 28S. Можно предположить, что предотвращение снижения площади поперечного сечения медленных и быстрых мышечных волокон m. soleus животных, вывешенных 7 суток с ингибированием IP3R, могло быть связано с улучшениями в работе рибосом.

Механизм, за счет которого введение 2-APB регулирует содержание 18S и 28S рибосомальных РНК, может быть связан с 2-APB-зависимой регуляцией уровня миоплазматического и, возможно, ядерного кальция. Ранее было показано, что активность рибосомальных генов, с которых происходит транскрипция рРНК, регулируется метилированием CpG-островков [35, 36]. Рост CpG-метилирования ведет к блокированию экспрессии генов; данному процессу противодействуют транслоказы, деметилирующие CpG [37]. Транслоказы TET могут подвергаться протеолизу со стороны кальций-зависимых протеаз кальпаинов [38]. Таким образом, накопление кальция может приводить к активации кальпаинов, деградации TET и росту метилирования CpG-островков на промоторах рибосомальных генов: введение 2-APB может противодействовать данному процессу, предотвращая накопление кальция, активацию кальпаинов и деградацию транслоказ TET.

Маркеры белковой деградации. Для исследования сигналинга деградации белка мы определили содержание маркеров убиквитин-протеасомной системы: Е3-убиквитинлигазы MuRF1 и MAFbx/Atrogin-1, а также убиквитина. Их экспрессия была существенно повышена в обеих вывешенных группах крыс (относительно групп контроля). Увеличение экспрессии этих маркеров при функциональной разгрузке показано ранее [39]. Итак, мы не обнаружили взаимосвязи между частичным снижением атрофии m. soleus в группе 7HSA крыс и содержанием маркеров убиквитин-протеасомной системы.

Однако кроме убиквитин-протеасомной системы, деградацию белка контролирует лизосомально-протеасомная система, поэтому мы определили экспрессию маркера ULK1. В группе вывешенных крыс ее уровень был повышен, что согласуется с предыдущими исследованиями [9, 40]. Ингибирование IP3R на фоне вывешивания привело к частичному предотвращению роста экспрессии мРНК ULK1. Наши результаты согласуются с ранними исследованиями, где обнаружено, что активность IP3R1 в мышцах mdx мышей повышала уровень аутофагии, тогда как нокаут IP3R1 возвращал его к базальному уровню [24]. IP3R могут как стимулировать, так и ингибировать аутофагию [41] посредством нескольких механизмов, таких как изменение цитозольного и/или митохондриального уровня Ca2+ [42]. В работе [24] описано влияние уровня кальция и АТФ на экспрессию ULK-1, в регуляции которых участвуют IP3R. При разгрузке мышц уровень кальция и АТФ в цитоплазме также повышен, что могло быть стимулом повышения ULK-1.

Аналогичные результаты были получены и для экспрессии мРНК IL6 на 7-е сутки вывешивания при введении 2-APB. Известно, что содержание миокина IL-6 увеличивается при функциональной разгрузке мышц [27, 43, 44]. IL-6 способен влиять на генную экспрессию через эпигеномную модификацию [45–47]. Блокирование рецепторов IL-6 предотвращает развитие атрофии m. soleus [43], а введение IL-6 в мышцу, напротив, ведет к ее атрофии [48]. Ранее показано, что IP3-опосредованный кальциевый сигнал индуцирует активацию гена IL-6 [17, 28]. Повышенный уровень IP3 в m. soleus вывешенных крыс обнаружен ранее [4]. При блокировании DHPR во время вывешивания уровень IL-6 в m. soleus крыс снижался [44], что свидетельствует о кальций-зависимых процессах, регулирующих его экспрессию. IP3R регулируют гомеостаз в том числе внутриядерного кальция [30], за счет чего они способны регулировать экспрессию генов.

Можно заключить, что к частичному предотвращению снижения площади поперечного сечения волокон камбаловидной мышцы при введении ингибитора IP3R на фоне 7-дневного вывешивания крыс могло привести предотвращение повышения уровня экспрессии мРНК IL6 и мРНК маркера аутофагии ULK1. Мы не обнаружили влияния маркеров убиквитин-протеасомной системы на регуляцию этого процесса.

Содержание кальций-зависимых маркеров при 7-суточном вывешивании крыс. Мы определили уровень фосфорилирования по Thr-286 кальций-зависимого маркера CaMKIIb (кальций-кальмодулинкиназы) в тотальной белковой фракции. Внутриклеточный кальций является одним из регуляторов активности CaMKIIb [49, 50]; аминокислотный остаток Thr-286 молекулы CaMKIIb фосфорилируется при повышении содержания ионов кальция [46, 47]. Фосфорилирование CaMKIIb было увеличено в ненагруженной камбаловидной мышце (группа HS) относительно группы контроля (рис. 6), однако введение ингибитора IP3R предотвратило эти изменения. Эти результаты хорошо согласуются с ранее обнаруженным накоплением ионов кальция в миоплазме на фоне вывешивания [2], а также свидетельствуют в пользу того, что применение ингибитора IP3R2-APB на фоне вывешивания может быть связано со снижением кальциевого сигнала в мышечных волокнах.

Также в работе было обнаружено повышенное содержание мРНК IP3R в ненагруженной камбаловидной мышце по сравнению с контрольной группой. Увеличенный уровень IP3R был обнаружен ранее в m. soleus вывешенных крыс [4]. Такого повышения не наблюдалось в группе с введением 2-APB. Хотя 2-APB ингибирует IP3R за счет связывания с их активным центром, в литературе есть данные о снижении экспрессии IP3R в тканях при введении 2-APB [51], что согласуется с результатами наших исследований.

IP3R находятся в мембране саркоплазматического ретикулума, ядра, а также митохондрий, активируются IP3 и Ca2+ [10, 11, 52], а также регулируют гомеостаз кальция в клетке [53]. CaMKII – кальций-зависимая киназа [54]. Наблюдаемое снижение экспрессии IP3R в группе 7HSA, наряду с ингибирующим действием 2-APB на активные центры рецепторов, могло внести вклад в снижение кальций-зависимого фосфорилирования CaMKIIb в данной экспериментальной группе.

Можно заключить, что к снижению степени атрофии m. soleus при введении ингибитора IP3R на фоне 7-дневного вывешивания крыс могло привести предотвращение снижения рибосомального биогенеза, а также предотвращение повышения уровня экспрессии маркера аутофагии ULK1 и IL6. Мы не обнаружили включения маркеров убиквитин-протеасомной системы в регуляцию этого процесса. Эффекты введения ингибитора IP3R2 – APB могут быть связаны с IP3-зависимой регуляцией внутриядерного кальция.

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Идея работы и планирование эксперимента – Н. Т. Л., сбор данных – З. К. А., Б. Р. О., Ш. К. А., обработка данных – З. К. А., Б. Р. О., Ш. К. А., Б. С. П., написание и редактирование манускрипта – Н. Т. Л., Б. С. П.

ФИНАНСИРОВАНИE РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств бюджета РНФ в рамках научного проекта № 24–15–00088. Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эксперименты с животными проводились в соответствии с международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований с лабораторными животными и были одобрены Комиссией по биомедицинской этике Института медико-биологических проблем РАН (протокол № 627 от 6 декабря 2022 г.).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

×

作者简介

K. Zaripova

Institute of Biomedical Problems RAS

Email: Nemirovskaya@bk.ru
俄罗斯联邦, Moscow

R. Bokov

Institute of Biomedical Problems RAS

Email: Nemirovskaya@bk.ru
俄罗斯联邦, Moscow

K. Sharlo

Institute of Biomedical Problems RAS

Email: Nemirovskaya@bk.ru
俄罗斯联邦, Moscow

S. Belova

Institute of Biomedical Problems RAS

Email: Nemirovskaya@bk.ru
俄罗斯联邦, Moscow

T. Nemirovskaya

Institute of Biomedical Problems RAS

编辑信件的主要联系方式.
Email: Nemirovskaya@bk.ru
俄罗斯联邦, Moscow

参考

  1. Morey-Holton E, Globus RK, Kaplansky A, Durnova G (2005) The hindlimb unloading rat model: literature overview, technique update and comparison with space flight data. Adv Space Biol Med 10: 7–40. https://doi.org/10.1016/s1569-2574(05)10002-1
  2. Ingalls CP, Warren GL, Armstrong RB (1999) Intracellular Ca2+ transients in mouse soleus muscle after hindlimb unloading and reloading. J Appl Physiol (1985) 87(1): 386–390. https://doi.org/10.1152/jappl.1999.87.1.386
  3. Shenkman BS, Nemirovskaya TL (2008) Calcium-dependent signaling mechanisms and soleus fiber remodeling under gravitational unloading. J Muscle Res Cell Motil 29(6–8): 221–230. https://doi.org/10.1007/s10974-008-9164-7
  4. Yang H, Wang H, Pan F, Guo Y, Cao L, Yan W, Gao Y (2023) New Findings: Hindlimb Unloading Causes Nucleocytoplasmic Ca(2+) Overload and DNA Damage in Skeletal Muscle. Cells 12(7): https://doi.org/10.3390/cells12071077
  5. Melnikov IY, Tyganov SA, Sharlo KA, Ulanova AD, Vikhlyantsev IM, Mirzoev TM, Shenkman BS (2022) Calpain-dependent degradation of cytoskeletal proteins as a key mechanism for a reduction in intrinsic passive stiffness of unloaded rat postural muscle. Pflugers Arch 474(11): 1171–1183. https://doi.org/10.1007/s00424-022-02740-5
  6. Mijares A, Allen PD, Lopez JR (2020) Senescence Is Associated With Elevated Intracellular Resting [Ca(2 +)] in Mice Skeletal Muscle Fibers. An in vivo Study. Front Physiol 11: 601189. https://doi.org/10.3389/fphys.2020.601189
  7. Turner PR, Westwood T, Regen CM, Steinhardt RA (1988) Increased protein degradation results from elevated free calcium levels found in muscle from mdx mice. Nature 335(6192): 735–738. https://doi.org/10.1038/335735a0
  8. Carafoli E, Krebs J (2016) Why Calcium? How Calcium Became the Best Communicator. J Biol Chem 291(40): 20849–20857. https://doi.org/10.1074/jbc.R116.735894
  9. Chibalin AV, Benziane B, Zakyrjanova GF, Kravtsova VV, Krivoi II (2018) Early endplate remodeling and skeletal muscle signaling events following rat hindlimb suspension. J Cell Physiol 233(10): 6329–6336. https://doi.org/10.1002/jcp.26594
  10. Georgiev T, Svirin M, Jaimovich E, Fink RH (2015) Localized nuclear and perinuclear Ca(2+) signals in intact mouse skeletal muscle fibers. Front Physiol 6: 263. https://doi.org/10.3389/fphys.2015.00263
  11. Taylor CW, Tovey SC (2010) IP(3) receptors: toward understanding their activation. Cold Spring Harb Perspect Biol 2(12): a004010. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a004010
  12. Foskett JK, White C, Cheung KH, Mak DO (2007) Inositol trisphosphate receptor Ca2+ release channels. Physiol Rev 87(2): 593–658. https://doi.org/10.1152/physrev.00035.2006
  13. Berridge MJ (2016) The Inositol Trisphosphate/Calcium Signaling Pathway in Health and Disease. Physiol Rev 96(4): 1261–1296. https://doi.org/10.1152/physrev.00006.2016
  14. Midrio M, Danieli-Betto D, Megighian A, Betto R (1997) Early effects of denervation on sarcoplasmic reticulum properties of slow-twitch rat muscle fibres. Pflugers Arch 434(4): 398–405. https://doi.org/10.1007/s004240050413
  15. Sharlo KA, Lvova ID, Tyganov SA, Zaripova KA, Belova SP, Kostrominova TY, Shenkman BS, Nemirovskaya TL (2023) The Effect of SERCA Activation on Functional Characteristics and Signaling of Rat Soleus Muscle upon 7 Days of Unloading. Biomolecules 13(9): https://doi.org/10.3390/biom13091354
  16. Jaimovich E, Reyes R, Liberona JL, Powell JA (2000) IP(3) receptors, IP(3) transients, and nucleus-associated Ca(2+) signals in cultured skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol 278(5): C998–C1010. https://doi.org/10.1152/ajpcell.2000.278.5.C998
  17. Arias-Calderon M, Almarza G, Diaz-Vegas A, Contreras-Ferrat A, Valladares D, Casas M, Toledo H, Jaimovich E, Buvinic S (2016) Characterization of a multiprotein complex involved in excitation-transcription coupling of skeletal muscle. Skelet Muscle 6: 15. https://doi.org/10.1186/s13395-016-0087-5
  18. Casas M, Altamirano F, Jaimovich E (2012) Measurement of calcium release due to inositol trisphosphate receptors in skeletal muscle. Methods Mol Biol 798: 383–393. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-343-1_22
  19. Cardenas C, Liberona JL, Molgo J, Colasante C, Mignery GA, Jaimovich E (2005) Nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate receptors regulate local Ca2+ transients and modulate cAMP response element binding protein phosphorylation. J Cell Sci 118(Pt 14): 3131–3140. https://doi.org/10.1242/jcs.02446
  20. Araya R, Liberona JL, Cardenas JC, Riveros N, Estrada M, Powell JA, Carrasco MA, Jaimovich E (2003) Dihydropyridine receptors as voltage sensors for a depolarization-evoked, IP3R-mediated, slow calcium signal in skeletal muscle cells. J Gen Physiol 121(1): 3–16. https://doi.org/10.1085/jgp.20028671
  21. Powell JA, Carrasco MA, Adams DS, Drouet B, Rios J, Muller M, Estrada M, Jaimovich E (2001) IP(3) receptor function and localization in myotubes: an unexplored Ca(2+) signaling pathway in skeletal muscle. J Cell Sci 114(Pt 20): 3673–3683. https://doi.org/10.1242/jcs.114.20.3673
  22. Altamirano F, Valladares D, Henriquez-Olguin C, Casas M, Lopez JR, Allen PD, Jaimovich E (2013) Nifedipine treatment reduces resting calcium concentration, oxidative and apoptotic gene expression, and improves muscle function in dystrophic mdx mice. PLoS One 8(12): e81222. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081222
  23. Casas M, Buvinic S, Jaimovich E (2014) ATP signaling in skeletal muscle: from fiber plasticity to regulation of metabolism. Exerc Sport Sci Rev 42(3): 110–116. https://doi.org/10.1249/JES.0000000000000017
  24. Valladares D, Utreras-Mendoza Y, Campos C, Morales C, Diaz-Vegas A, Contreras-Ferrat A, Westermeier F, Jaimovich E, Marchi S, Pinton P, Lavandero S (2018) IP(3) receptor blockade restores autophagy and mitochondrial function in skeletal muscle fibers of dystrophic mice. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis 1864(11): 3685–3695. https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2018.08.042
  25. Kravtsova VV, Paramonova II, Vilchinskaya NA, Tishkova MV, Matchkov VV, Shenkman BS, Krivoi II (2021) Chronic Ouabain Prevents Na, K-ATPase Dysfunction and Targets AMPK and IL-6 in Disused Rat Soleus Muscle. Int J Mol Sci 22(8): https://doi.org/10.3390/ijms22083920
  26. Zaripova KA, Kalashnikova EP, Belova SP, Kostrominova TY, Shenkman BS, Nemirovskaya TL (2021) Role of Pannexin 1 ATP-Permeable Channels in the Regulation of Signaling Pathways during Skeletal Muscle Unloading. Int J Mol Sci 22(19): https://doi.org/10.3390/ijms221910444
  27. Zaripova KA, Belova SP, Kostrominova TY, Shenkman BS, Nemirovskaya TL (2024) P2Y1 and P2Y2 receptors differ in their role in the regulation of signaling pathways during unloading-induced rat soleus muscle atrophy. Arch Biochem Biophys 751: 109844. https://doi.org/10.1016/j.abb.2023.109844
  28. Carrasco MA, Riveros N, Rios J, Muller M, Torres F, Pineda J, Lantadilla S, Jaimovich E (2003) Depolarization-induced slow calcium transients activate early genes in skeletal muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol 284(6): C1438–С1447. https://doi.org/10.1152/ajpcell.00117.2002
  29. Kandarian SC, Stevenson EJ (2002) Molecular events in skeletal muscle during disuse atrophy. Exerc Sport Sci Rev 30(3): 111–116. https://doi.org/10.1097/00003677-200207000-00004
  30. Ye L, Zeng Q, Ling M, Ma R, Chen H, Lin F, Li Z, Pan L (2021) Inhibition of IP3R/Ca2+ Dysregulation Protects Mice From Ventilator-Induced Lung Injury via Endoplasmic Reticulum and Mitochondrial Pathways. Front Immunol 12: 729094. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.729094
  31. Gambardella J, Morelli MB, Wang X, Castellanos V, Mone P, Santulli G (2021) The discovery and development of IP3 receptor modulators: an update. Expert Opin Drug Discov 16(6): 709–718. https://doi.org/10.1080/17460441.2021.1858792
  32. Bilmen JG, Wootton LL, Godfrey RE, Smart OS, Michelangeli F (2002) Inhibition of SERCA Ca2+ pumps by 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB). 2-APB reduces both Ca2+ binding and phosphoryl transfer from ATP, by interfering with the pathway leading to the Ca2+-binding sites. Eur J Biochem 269(15): 3678–3687. https://doi.org/10.1046/j.1432-1033.2002.03060.x
  33. Kimura S, Inaoka PT, Yamazaki T (2012) Influence of passive stretching on inhibition of disuse atrophy and hemodynamics of rat soleus muscle. J Jpn Phys Ther Assoc 15(1): 9–14. https://doi.org/10.1298/jjpta.Vol15_002
  34. Baldwin KM, Haddad F (2002) Skeletal muscle plasticity: cellular and molecular responses to altered physical activity paradigms. Am J Phys Med Rehabil 81(11 Suppl): S40–S51. https://doi.org/10.1097/01.PHM.0000029723.36419.0D
  35. D'Aquila P, Montesanto A, Mandala M, Garasto S, Mari V, Corsonello A, Bellizzi D, Passarino G (2017) Methylation of the ribosomal RNA gene promoter is associated with aging and age-related decline. Aging Cell 16(5): 966–975. https://doi.org/10.1111/acel.12603
  36. Grummt I, Langst G (2013) Epigenetic control of RNA polymerase I transcription in mammalian cells. Biochim Biophys Acta 1829(3–4): 393–404. https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2012.10.004
  37. Williams K, Christensen J, Helin K (2011) DNA methylation: TET proteins-guardians of CpG islands? EMBO Rep 13(1): 28–35. https://doi.org/10.1038/embor.2011.233
  38. Wang Y, Zhang Y (2014) Regulation of TET protein stability by calpains. Cell Rep 6(2): 278–284. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2013.12.031
  39. Bodine SC, Baehr LM (2014) Skeletal muscle atrophy and the E3 ubiquitin ligases MuRF1 and MAFbx/atrogin-1. Am J Physiol Endocrinol Metab 307(6): E469–E484. https://doi.org/10.1152/ajpendo.00204.2014
  40. Belova SP, Zaripova K, Sharlo K, Kostrominova TY, Shenkman BS, Nemirovskaya TL (2022) Metformin attenuates an increase of calcium-dependent and ubiquitin-proteasome markers in unloaded muscle. J Appl Physiol (1985) https://doi.org/10.1152/japplphysiol.00415.2022
  41. Parys JB, Decuypere JP, Bultynck G (2012) Role of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor/Ca2+-release channel in autophagy. Cell Commun Signal 10(1): 17. https://doi.org/10.1186/1478-811X-10-17
  42. Criollo A, Vicencio JM, Tasdemir E, Maiuri MC, Lavandero S, Kroemer G (2007) The inositol trisphosphate receptor in the control of autophagy. Autophagy 3(4): 350–353. https://doi.org/10.4161/auto.4077
  43. Yakabe M, Ogawa S, Ota H, Iijima K, Eto M, Ouchi Y, Akishita M (2018) Inhibition of interleukin-6 decreases atrogene expression and ameliorates tail suspension-induced skeletal muscle atrophy. PLoS One 13(1): e0191318. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191318
  44. Вильчинская НА, Парамонова ИИ, Немировская ТЛ, Ломоносова ЮН, Шенкман БС (ред) (2020) Экспрессия интерлейкина-6 в камбаловидной мышце крысы в условиях функциональной разгрузки. Динамика процесса и роль кальциевых каналов L-типа. Авиакосм экол мед 54(3): 70–78. [Vil'chinskaya NA, Paramonova II, Nemirovskaya TL, Lomonosova YN, Shenkman BS (2020) Expression of interleukin-6 in the rat soleus muscle under conditions of functional unloading. Dynamics of the process and the role of L-type calcium channels. Aviakosm ekol med 54(3): 70–78. (In Russ)]. https://doi.org/10.21687/0233-528X-2020-54-3-70-78
  45. Hodge DR, Cho E, Copeland TD, Guszczynski T, Yang E, Seth AK, Farrar WL (2007) IL-6 enhances the nuclear translocation of DNA cytosine-5-methyltransferase 1 (DNMT1) via phosphorylation of the nuclear localization sequence by the AKT kinase. Cancer Genomics Proteomics 4(6): 387–398. https://doi.org/
  46. Rose AJ, Kiens B, Richter EA (2006) Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase expression and signalling in skeletal muscle during exercise. J Physiol 574(Pt 3): 889–903. https://doi.org/10.1113/jphysiol.2006.111757
  47. Rostas JAP, Skelding KA (2023) Calcium/Calmodulin-Stimulated Protein Kinase II (CaMKII): Different Functional Outcomes from Activation, Depending on the Cellular Microenvironment. Cells 12(3): https://doi.org/10.3390/cells12030401
  48. Sun H, Sun J, Li M, Qian L, Zhang L, Huang Z, Shen Y, Law BY, Liu L, Gu X (2021) Transcriptome Analysis of Immune Receptor Activation and Energy Metabolism Reduction as the Underlying Mechanisms in Interleukin-6-Induced Skeletal Muscle Atrophy. Front Immunol 12: 730070. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.730070
  49. Witczak CA, Sharoff CG, Goodyear LJ (2008) AMP-activated protein kinase in skeletal muscle: from structure and localization to its role as a master regulator of cellular metabolism. Cell Mol Life Sci 65(23): 3737–3755. https://doi.org/10.1007/s00018-008-8244-6
  50. Raney MA, Turcotte LP (2008) Evidence for the involvement of CaMKII and AMPK in Ca2+-dependent signaling pathways regulating FA uptake and oxidation in contracting rodent muscle. J Appl Physiol (1985) 104(5): 1366–1373. https://doi.org/10.1152/japplphysiol.01282.2007
  51. Liang Q, Zhang Y, Zeng M, Guan L, Xiao Y, Xiao F (2018) The role of IP3R-SOCCs in Cr(vi)-induced cytosolic Ca(2+) overload and apoptosis in L-02 hepatocytes. Toxicol Res (Camb) 7(3): 521–528. https://doi.org/10.1039/c8tx00029h
  52. Hohendanner F, Maxwell JT, Blatter LA (2015) Cytosolic and nuclear calcium signaling in atrial myocytes: IP3-mediated calcium release and the role of mitochondria. Channels (Austin) 9(3): 129–138. https://doi.org/10.1080/19336950.2015.1040966
  53. Gomes DA, Leite MF, Bennett AM, Nathanson MH (2006) Calcium signaling in the nucleus. Can J Physiol Pharmacol 84(3–4): 325–332. https://doi.org/10.1139/y05-117
  54. Park S, Scheffler TL, Gerrard DE (2011) Chronic high cytosolic calcium decreases AICAR-induced AMPK activity via calcium/calmodulin activated protein kinase II signaling cascade. Cell Calcium 50(1): 73–83. https://doi.org/10.1016/j.ceca.2011.05.009

补充文件

附件文件
动作
1. JATS XML
下载
2. Fig. 1. Animal body weight (a), m. soleus weight (b) and m. soleus wet weight index (c). 7C – vivaro control with placebo administration, 7CA – vivaro control with 2-APB administration, 7HS – 7-day suspension with placebo administration, 7HSA – 7-day suspension with 2-APB administration. * – significant differences between groups (p < 0.001).

下载 (108KB)
索引源数据
3. Fig. 2. Cross-sectional area of ​​slow fibers (a), fast fibers (b) and micrographs of immunohistochemical staining of slow myosin (green) and fast myosin (red) (c). 7C – vivaro control with placebo administration, 7CA – vivaro control with 2-APB administration, 7HS – 7-day suspension with placebo administration, 7HSA – 7-day suspension with 2-APB administration. * – significant differences between groups. The size bar is 200 μm.

下载 (404KB)
索引源数据
4. Fig. 3. Content of 18S rRNA (a), 28S rRNA (b) in m. soleus after administration of 2-APB against the background of 7-day suspension. 7C – vivaro control with administration of placebo, 7CA – vivaro control with administration of 2-APB, 7HS – 7-day suspension with administration of placebo, 7HSA – 7-day suspension with administration of 2-APB, * – significant differences between groups.

下载 (119KB)
索引源数据
5. Fig. 4. Expression of MuRF1 (a), MAFbx (b), and ubiquitin (c) mRNA in m. soleus upon administration of 2-APB during 7-day suspension. 7C – vivaro control with administration of placebo, 7CA – vivaro control with administration of 2-APB, 7HS – 7-day suspension with administration of placebo, 7HSA – 7-day suspension with administration of 2-APB. * – significant differences between groups.

下载 (104KB)
索引源数据
6. Fig. 5. Expression of ULK1 (a) and IL6 (b) mRNA in m. soleus upon administration of 2-APB against the background of 7-day suspension. 7C – vivaro control with administration of placebo, 7CA – vivaro control with administration of 2-APB, 7HS – 7-day suspension with administration of placebo, 7HSA – 7-day suspension with administration of 2-APB. * – significant differences between groups.

下载 (92KB)
索引源数据
7. Fig. 6. CaMKIIb phosphorylation level in m. soleus after 2-APB administration against the background of 7-day suspension. 7C – vivaro control with placebo administration, 7CA – vivaro control with 2-APB administration, 7HS – 7-day suspension with placebo administration, 7HSA – 7-day suspension with 2-APB administration. * – significant differences between groups.

下载 (67KB)
索引源数据
8. Fig. 7. Expression of IP3R mRNA in m. soleus upon administration of 2-APB against the background of 7-day suspension. 7C – vivaro control with administration of placebo, 7CA – vivaro control with administration of 2-APB, 7HS – 7-day suspension with administration of placebo, 7HSA – 7-day suspension with administration of 2-APB. * – significant differences between groups.

下载 (52KB)
索引源数据

版权所有 © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».