Аберрантная репарация 8-оксогуанина в коротких выпетливаниях ДНК

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Присутствие повреждений в ДНК может увеличить частоту ошибок репликации ДНК и значительно повысить количество мутаций. В частности, паузы ДНК-полимераз в месте повреждения могут приводить к проскальзыванию полимеразы и образованию коротких выпетливаний длиной 1–2 нуклеотида. Репарация таких структур по неповрежденной ДНК-матрице ведет к микроделециям. Для одного из наиболее часто встречаемых окислительных повреждений ДНК, 8-оксогуанина (oxoG), показано образование микроделеций по неизвестному на данный момент механизму. В работе изучена аберрантная репарация oxoG, находящегося в одно- и двухнуклеотидных выпетливаниях, системами эксцизионной репарации оснований ДНК Escherichia coli и человека. Показано, что репарация в таких субстратах может служить механизмом фиксации микроделеций у бактерий, но не у человека.

Полный текст

Ошибки ДНК-полимераз во время репликации могут приводить к образованию коротких выпетливаний длиной 1–2 нуклеотида в матричной или дочерней цепи ДНК. Неспаренные основания в них могут принимать как внутри-, так и внеспиральную конформацию [1–3] в зависимости от условий и нуклеотидного окружения. Такие структуры инициируют мутации со сдвигом рамки считывания – микроинсерции и микроделеции. Основной путь образования коротких выпетливаний – это проскальзывание ДНК-полимераз, что зачастую вызвано временными остановками фермента при наличии в ДНК повреждений [4]. Если ДНК-полимераза, сделав паузу в месте повреждения, включает dNMP, комплементарный первому или второму следующему по ходу нуклеотиду матрицы, возникает выпетливание. Если впоследствии оно удаляется системами репарации ДНК, происходит микроделеция (рис. 1а). Подобные события «аберрантной репарации», закрепляющие мутации, вносят заметный вклад в общую геномную нестабильность [5].

В число самых распространенных повреждений ДНК входит 8-оксогуанин (oxoG, рис. 1б) [6]. Он представляет собой предмутагенное повреждение, поскольку при репликации способен образовывать хугстеновскую пару oxoG:A. Однако спектр мутаций, вызванных oxoG, этим не ограничивается; среди продуктов репликации в клетках E. coli и человека наблюдается заметное число микроделеций в месте oxoG, что говорит об образовании выпетливаний при попытке ДНК-полимераз пройти повреждение [7–9].

 

Рис. 1. Схема образования микроделеций при проскальзывании ДНК-полимеразы (а); схема строения использованных в работе ДНК-субстратов (б); графики зависимости начальной скорости реакции от исходной концентрации субстрата [S] для фермента Fpg (4.2 нМ) (условия реакции: 25 мМ Трис–HCl pH 7.5, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 37 °C) (в); кинетические кривые расщепления субстратов ферментом OGG1 в том же буфере при [E]0 = 5 мкМ, [S]0 = 20 нМ (г) и [E]0 = 10 нМ, [S]0 = 100 нМ (д). Для субстратов X.2.1 и X.2.2 расщепления в (д) не наблюдалось. После реакции с OGG1 смеси прогревали со 100 мМ NaOH (5 мин, 95°C). Во всех случаях продукты реакции разделяли электрофорезом в 20%-ном полиакриламидном геле в присутствии 7 М мочевины и анализировали с помощью установки радиолюминесцентного сканирования Typhoon 9500 (GE Healthcare). На графиках приведены средние значения и стандартные отклонения по трем независимым экспериментам.

 

OxoG удаляется из ДНК по пути эксцизионной репарации оснований, который инициируется ДНК-гликозилазами Fpg (у бактерий) и OGG1 (у эукариот). Эти ферменты негомологичны и имеют совершенно разную третичную структуру. Тем не менее их субстратная специфичность практически идентична: оба они гидролизуют N-гликозидную связь oxoG в парах oxoG:C. Далее продукт реакции подвергается последовательно действию апурин-апиримидиновой эндонуклеазы (Xth или Nfo у E. coli, APE1 у человека), ДНК-полимеразы (ДНК-полимераза I у E. coli, ДНК-полимераза β у человека) и ДНК-лигазы, что восстанавливает целостность ДНК.

Несмотря на то что репарация oxoG изучена достаточно подробно, до сих пор практически не затрагивалась проблема его удаления из неканонических структур ДНК, в частности выпетливаний, что важно для понимания механизмов индукции микроделеций этим поврежденным основанием. В настоящей работе изучено удаление oxoG из выпетливаний ферментами Fpg и OGG1. Исследуемые субстраты представляют собой олигодезоксирибонуклеотидные дуплексы, в которых напротив oxoG расположен C или oxoG находится в составе одно- или двухнуклеотидного выпетливания; в последнем случае повреждение располагается в первой или второй позиции внеспирального участка (рис. 1б). Выпетливания снижали стабильность дуплекса, однако температура плавления всех субстратов оставалась заметно выше 37 °C (табл. 1; Tпл измеряли, регистрируя поглощение при 260 нм при помощи спектрофотометра Cary 300-Bio Melt, снабженного термостатным блоком). Цепь, содержащая oxoG, была помечена по 5′-концу 32P для экспериментов по связыванию и расщеплению ДНК-субстратов или флуорофором Cy3 для экспериментов по реконструкции репарации. Белки Fpg E. coli, OGG1, APE1 и ДНК-полимеразу β человека выделяли по описанным методикам [10–13].

 

Таблица 1. Кинетические и термодинамические параметры реакций расщепления ДНК-субстратов ферментами Fpg и OGG1

Субстрат

Tпл, °C

Фермент

Fpg

OGG1

KM, нМ

kcat, мин−1

kcat/KM, нМ−1 мин−1, ×102

Kd, нМ

k2, мин−1

k3, мин−1, ×104

Kd, нМ

X.0

70.7

35 ± 7

14 ± 1

41 ± 10

7.3 ± 1.6

22 ± 2

210 ± 60

94 ± 29

X.1

60.7

23 ± 8

11 ± 1

49 ± 22

6.7 ± 2.2

0.27 ± 0.03

–

54 ± 16

X.2.1

59.9

190 ± 50

4.3 ± 0.4

2.2 ± 0.7

24 ± 10

0.22 ± 0.09

–

420 ± 110

X.2.2

55.6

96 ± 32

2.6 ± 0.5

2.7 ± 1.5

11 ± 4

0.61 ± 0.12

–

230 ± 70

 

Кинетику реакции, катализируемой ферментом Fpg, можно описать стандартной схемой Михаэлиса – Ментен [14]. На рис. 1в приведены графики, отражающие расщепление исследованных субстратов ферментом Fpg. Зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата носила ожидаемый гиперболический характер. Полученные для разных субстратов значения константы Михаэлиса KM и каталитической константы kcat сведены в табл. 1. Как видно, для субстрата X.1, в котором oxoG находится в однонуклеотидном выпетливании, кинетика реакции не отличается от таковой для стандартной пары oxoG:C. Известно, что при узнавании oxoG фермент Fpg выворачивает его из спирали ДНК в свой активный центр, и вполне вероятно, что однонуклеотидное выпетливание может имитировать структуру ДНК в этом комплексе. Оба субстрата с двухнуклеотидным выпетливанием, X.2.1 и X.2.2, показывали повышение KM и снижение kcat в несколько раз, вследствие чего показатель специфичности kcat/KM был для них примерно в 20 раз ниже, чем для субстратов X.0 и X.1 (см. табл. 1). Очевидно, в этих случаях даже при внеспиральной локализации oxoG правильное размещение его в активном центре затруднено. Для всех изученных субстратов количество продукта не менялось при остановке реакции 0.1 М NaOH, который вызывает разрыв ДНК по АП-сайтам. Это свидетельствует о том, что снижение активности фермента Fpg по отношению к субстратам X.2.1 и X.2.2 происходит именно на уровне гидролиза N-гликозидной связи, а не последующих стадий реакции.

В отличие от Fpg, для фермента OGG1 скорость реакции лимитируется стадией высвобождения продукта [15], поэтому для канонического субстрата (oxoG:C) возможно отдельно измерить константу каталитической стадии (k2) и константу скорости высвобождения продукта (k3) в условиях кинетики одного оборота ([E]0 >> [S]0) и кинетики фазы всплеска ([E]0 << [S]0) соответственно. Даже в случае однонуклеотидного выпетливания каталитическая константа OGG1 была на 1.5–2.0 порядка ниже, чем для канонического субстрата (см. рис. 1г, табл. 1).

Такое снижение приводило к тому, что стадия высвобождения продукта переставала быть скоростьлимитирующей, на графике накопления продукта со временем отсутствовала характерная фаза всплеска (см. рис. 1д), и определить константу скорости высвобождения продукта было невозможно (см. табл. 1). Таким образом, OGG1 неэффективно использует oxoG в составе одно- и двухнуклеотидных выпетливаний как субстрат. Разница с ферментом Fpg, по-видимому, объясняется разницей в общей пространственной структуре и в архитектуре активного центра этих белков, которые принадлежат к разным структурным суперсемействам. Так, активный центр OGG1 более тесный по сравнению с активным центром Fpg; кроме того, оба белка по-разному взаимодействуют с фосфатами, окружающими поврежденный нуклеозид, для его выворачивания из ДНК [16, 17].

Для анализа связывания Fpg и OGG1 с субстратной ДНК без ее расщепления методом сайт-направленного мутагенеза получили их каталитически неактивные варианты Fpg E2Q и OGG1 K249Q [16, 18]. Белки выделяли по тем же схемам, что и белки дикого типа. Связывание определяли по изменению подвижности комплекса в неденатурирующем геле; результаты эксперимента приведены в табл. 1. Образование выпетливаний лишь умеренно влияло на сродство обоих белков к ДНК: максимальное повышение Kd наблюдалось для субстрата X2.1 и составляло 3.3 раза для Fpg и 4.5 раз для OGG1. Интересно, что для субстрата X.1 сродство к ДНК-гликозилазам оставалось неизменным или даже несколько повышалось, что, возможно, отражает лучшее связывание ДНК с внеспиральным поврежденным нуклеотидом. Таким образом, ухудшение связывания ДНК не может полностью объяснить снижение активности Fpg и OGG1 на 1.5–2.0 порядка при наличии выпетливаний в ДНК.

Дальнейшие шаги репарации после действия ДНК-гликозилаз изучали при помощи реконструкции цикла репарации из очищенных рекомбинантных белков: Fpg, эндонуклеазы IV (Nfo) и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (дефицитного по 3′→5′-экзонуклеазной активности) для системы E. coli и OGG1, АП-эндонуклеазы APE1 и ДНК-полимеразы β для системы человека. Эффективность образования лигируемого разрыва оценивали с использованием ДНК-лигазы бактериофага T4. При наличии oxoG в дцДНК действие Fpg приводит к образованию 3′-концевого фосфата, который затем удаляется Nfo, вызывая снижение электрофоретической подвижности продукта из-за уменьшения общего заряда олигонуклеотидного фрагмента (рис. 2а, дорожки 1–3). ДНК-полимераза затем ведет синтез с вытеснением цепи (см. рис. 2а, дорожка 4) либо при наличии только dGTP в реакционной смеси включает его с образованием лигируемого разрыва (рис. 2, дорожка 14). Аналогичная картина наблюдалась и для субстрата X.1 с некоторым снижением эффективности всех стадий относительно дцДНК (см. рис. 2б). Однако субстраты X2.1 и X2.2 вели себя по-разному: в первом случае цикл репарации проходил до конца с еще более низкой эффективностью, чем для X.0 и X.1, а во втором ДНК-полимеразная реакция не протекала, и продукт имел ту же подвижность, что и после АП-эндонуклеазной реакции (см. рис. 2в, г). В системе репарации человека фермент OGG1 оставляет на 3′-конце α,β-ненасыщенный альдегид, который удаляется АП-эндонуклеазой APE1, однако подвижности продуктов при этом мало отличаются (рис. 2а, дорожки 7, 8, 17, 18). При этом в присутствии APE1 количество расщепленной ДНК возрастает, поскольку собственная АП-лиазная активность фермента OGG1 невысока по сравнению с его ДНК-гликозилазной активностью. В то время как oxoG в составе дцДНК полностью репарировался в системе, реконструированной из ферментов человека, АП-эндонуклеазная реакция проходила только в случае субстрата X.1, а образования разрывов с лигируемыми концами на субстратах с выпетливаниями практически не наблюдалось.

 

Рис. 2. Репрезентативные флуоресцентные снимки после электрофоретического разделения в денатурирующем 20%-ном полиакриламидном геле продуктов реакции в реконструированной системе репарации субстратов X.0 (а), X.1 (б), X.2.1 (в) и X.2.2 (г). Условия реакции: 50 мМ Трис–HCl (pH 7.5), 10 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ, 1 мМ ATP, 25 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 50 нМ ДНК-субстрат, 0.5 ед. акт./мкл ДНК-лигазы, 200 нМ прочие ферменты, 250 мкМ dNTP, 30 мин при 37 °C. Структуры расщепляемой цепи ДНК и интермедиатов репарации обозначены римскими цифрами: (i) исходная поврежденная цепь ДНК, (iia) продукт расщепления ферментом Fpg, (iib) продукт расщепления ферментом OGG1, (iii) продукт расщепления АП-эндонуклеазами, (iv) продукт включения одного нуклеотида ДНК-полимеразами. X – oxoG, Y – C или T, B – C, G или T, звездочка обозначает 5′-концевую флуоресцентную метку (Cy3).

 

Таким образом, в работе показано, что репарация oxoG, находящегося в выпетливаниях длиной 1–2 нуклеотида, может служить механизмом фиксации микроделеций в ДНК E. coli и, вероятно, других бактерий. Однако система эксцизионной репарации оснований человека неэффективно узнает и процессирует подобные субстраты, и в клетках человека такой механизм маловероятен.

Конфликт интересов

Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Благодарности

Секвенирование ДНК выполнялось сотрудниками Центра коллективного пользования «Геномика» СО РАН. Белок Nfo был любезно предоставлен А.А. Ищенко (Университет Париж-Саклэ, Франция).

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований 21-54-12025 ННИО_а.

Соблюдение этических норм и стандартов

Соблюдение этических стандартов: в данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

×

Об авторах

Д. А. Ерошенко

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Email: dzharkov@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск; Новосибирск

Е. А. Дятлова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: dzharkov@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск

В. М. Голышев

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: dzharkov@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск

А. В. Ендуткин

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: dzharkov@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск

Д. О. Жарков

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: dzharkov@niboch.nsc.ru

член-корреспондент

Россия, Новосибирск; Новосибирск

Список литературы

  1. Joshua-Tor L., Frolow F., Appella E., et al. // J. Mol. Biol. 1992. V. 225. № 2. P. 397–431.
  2. Jiao Y., Stringfellow S., Yu H. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2002. V. 19. № 5. P. 929–934.
  3. Shi X., Beauchamp K.A., Harbury P.ЙB., Herschlag D. // Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 2014. V. 111. № 15. P. E1473–E1480.
  4. Kunkel T.A., Bebenek K. // Annu. Rev. Biochem. 2000. V. 69. P. 497–529.
  5. Talhaoui I., Matkarimov B.T., Tchenio T., et al. // Free Radic. Biol. Med. 2017. V. 107. P. 266–277.
  6. Fleming A.M., Burrows C.J. // DNA Repair. 2017. V. 56. P. 75–83.
  7. Moriya M., Ou C., Bodepudi V., et al. // Mutat. Res. 1991. V. 254. № 3. P. 281–288.
  8. Markkanen E., Castrec B., Villani G., Hübscher U. // Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 2012. V. 109. № 50. P. 20401–20406.
  9. Pande P., Haraguchi K., Jiang Y.-L., et al. // Biochemistry. 2015. V. 54. № 10. P. 1859–1862.
  10. Gilboa R., Zharkov D.O., Golan G., et al. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 22. P. 19811–19816.
  11. Kuznetsov N.A., Koval V. V., Zharkov D.O., et al. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. № 12. P. 3919–3931.
  12. Sidorenko V.S., Nevinsky G.A., Zharkov D. O. // DNA Repair. 2007. V. 6. № 3. P. 317–328.
  13. Endutkin A.V., Yudkina A.V ., Zharkov T.D., et al. // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. № 21. 13353.
  14. Tchou J., Bodepudi V., Shibutani S., et al. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. № 21. P. 15318–15324.
  15. Zharkov D.O., Rosenquist T.A., Gerchman S.E., Grollman A. P. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 37. P. 28607–28617.
  16. Bruner S.D., Norman D.P.G., Verdine G.L. // Nature. 2000. V. 403. № 6772. P. 859–866.
  17. Fromme J.C., Verdine G.L. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. № 51. P. 51543–51548.
  18. Lavrukhin O.V., Lloyd R.S. // Biochemistry. 2000. V. 39. № 49. P. 15266–15271.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема образования микроделеций при проскальзывании ДНК-полимеразы (а); схема строения использованных в работе ДНК-субстратов (б); графики зависимости начальной скорости реакции от исходной концентрации субстрата [S] для фермента Fpg (4.2 нМ) (условия реакции: 25 мМ Трис–HCl pH 7.5, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 37 °C) (в); кинетические кривые расщепления субстратов ферментом OGG1 в том же буфере при [E]0 = 5 мкМ, [S]0 = 20 нМ (г) и [E]0 = 10 нМ, [S]0 = 100 нМ (д). Для субстратов X.2.1 и X.2.2 расщепления в (д) не наблюдалось. После реакции с OGG1 смеси прогревали со 100 мМ NaOH (5 мин, 95°C). Во всех случаях продукты реакции разделяли электрофорезом в 20%-ном полиакриламидном геле в присутствии 7 М мочевины и анализировали с помощью установки радиолюминесцентного сканирования Typhoon 9500 (GE Healthcare). На графиках приведены средние значения и стандартные отклонения по трем независимым экспериментам.

Скачать (209KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Репрезентативные флуоресцентные снимки после электрофоретического разделения в денатурирующем 20%-ном полиакриламидном геле продуктов реакции в реконструированной системе репарации субстратов X.0 (а), X.1 (б), X.2.1 (в) и X.2.2 (г). Условия реакции: 50 мМ Трис–HCl (pH 7.5), 10 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ, 1 мМ ATP, 25 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 50 нМ ДНК-субстрат, 0.5 ед. акт./мкл ДНК-лигазы, 200 нМ прочие ферменты, 250 мкМ dNTP, 30 мин при 37 °C. Структуры расщепляемой цепи ДНК и интермедиатов репарации обозначены римскими цифрами: (i) исходная поврежденная цепь ДНК, (iia) продукт расщепления ферментом Fpg, (iib) продукт расщепления ферментом OGG1, (iii) продукт расщепления АП-эндонуклеазами, (iv) продукт включения одного нуклеотида ДНК-полимеразами. X – oxoG, Y – C или T, B – C, G или T, звездочка обозначает 5′-концевую флуоресцентную метку (Cy3).

Скачать (301KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».