Влияние хирургического вмешательства в полость носа крыс на условный рефлекс пассивного избегания и уровень моноаминов в гипоталамусе

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Одним из наиболее распространенных хирургических вмешательств в отоларингологии является септопластика – операция на носовой перегородке. Особенностью области, в которой проводится данная процедура, является ее анатомическая близость к головному мозгу и обширная иннервация черепно-мозговыми нервами. Эта особенность обусловила большой интерес исследователей. Большинство работ касается регенерации тканей в месте повреждения и поиска оптимального метода их иссечения. Исследования на людях и животных показали, что в результате операции формируются продолжительные морфологические изменения в области оперативного вмешательства [1], болевой синдром, гипоксия и гиперкапния [2]. Было показано также, что в течение недели после операции у крыс выявляются увеличение экспрессии белков апоптоза и морфологические изменения нейронов в различных отделах гиппокампа [3]. Кроме того, после операции развивались неспецифические адаптационные реакции на хирургический стресс в виде чрезмерной активации симпатических реакций организма [4].

Влияние септопластики на обучение и память до настоящего времени не изучалось. Целью нашей работы стал анализ влияния септопластики на выработку условного рефлекса пассивного избегания в трехкамерной установке, позволяющей исследовать процесс формирования памяти, включая ее пространственный компонент. Дополнительно исследовались изменения в метаболизме норадреналина в гипоталамусе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на 16 самцах крыс Вистар (питомник – Филиал “Столбовая” ФГБУН “Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства” России) массой 320–360 г, в возрасте 3.5 месяца. Животных содержали по 4 крысы в клетке в условиях 12-часового светового дня при свободном доступе к воде и корму. Эксперименты выполнены в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU.

Крысы контрольной группы (n = 8) подвергались общей анестезии посредством внутрибрюшинной инъекции комбинированного препарата “Золетил 100” (телетамин + золазепам в дозировке 30 мг/кг). Экспериментальным крысам (n = 8) под общей анестезией проводили септопластику.

Суть методики состоит в формировании морфологических изменений слизистой оболочки и подслизистого слоя перегородки носа, а также местных реакций иммунной системы, аналогичных тем, что возникают после операции септопластики на человеке.

Для унилатерального повреждения носовой перегородки крысе в ноздрю на глубину 20–25 мм вводили металлический зонд длинной 100 мм. После введения зонда зигзагообразными движениями проводилась скарификация слизисто-надхрящечного слоя носовой перегородки. Для предупреждения асфиксии кровь аспирировали электроаспиратором.

На 4-й послеоперационный день начинали выработку УРПИ [5]. Опыт проводили в установке (90 × 30 × 30 см), состоящей из центрального освещенного отсека (90 лк) с гладким полом и двух боковых темных отсеков с решетчатым электрифицированным полом из стальных прутьев. Отсеки были разделены перегородками с дверками. В первый день крысу сажали в центральный освещенный отсек и в течение 5 мин наблюдали за ее поведением. Через 24 ч начинали выработку УРПИ. Для этого крысу снова сажали в центральный отсек, и когда животное переходило в один из боковых темных отсеков, дверка за ней закрывалась, блокируя выход, и крыса получала удар током силой 0.7 мА в течение 5 с. Далее крысу возвращали в домашнюю клетку. Темный отсек, в котором крыса получила удар током, в протоколе отмечали как “опасный”, а противоположный темный отсек – как “безопасный”. На третий день, через 24 ч, тестировали след памяти об ударе током. Для этого крысу, как и в день выработки УРПИ, сажали на обычную стартовую позицию и в течение 5 мин регистрировали активность животного. В ходе опыта регистрировали латентный период перехода в темный отсек (ЛП, в секундах) и выбор отсека, время обследования входов в отсеки (продолжительность обнюхиваний входов и заглядывания в них, с), стойки (n) и замирания (с).

После тестирования УРПИ крыс декапитировали и извлекали головной мозг. На льду из мозга выделяли гипоталамус, помещали его в эппендорф, взвешивали и немедленно замораживали в жидком азоте. Содержание моноаминов и их метаболитов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ ЭД) на хроматографе LC-304T (ВАS, США) с аналитической колонкой ReproSil-Pur ODS (C18, 100 × 4 мм, 3 мкм) (Dr. Maisch, Германия). Скорость элюции подвижной фазы составляла 1.0 мл/мин, давление ~200 атм. Перед экспериментами по определению содержания нейротрансмиттеров пробы размельчали в гомогенизаторе Поттера (тефлон–стекло) в 1 мл 0.1 N HСlO4 с добавлением 3,4-диоксибензиламина (0.5 нмоль/мл) в качестве внутреннего стандарта. Пробы центрифугировали при 12 000 g в течение 10 мин. Мобильная фаза состояла из: 0.1 M цитратно-фосфатного буфера, содержащего 1.1 mM октансульфоновой кислоты, 0.1 mM ЭДТА и 9 %-го ацетонитрила (pH 3.0). Измерение проводили с помощью электрохимического детектора LC-4B (BAS, США) на двойном стеклоугольном электроде (+0.85 V) против электрода сравнения Ag/AgCl. Для регистрации образцов и обработки данных использовали программу “Мультихром” 1.5 (“Амперсенд”, Россия). Расчет концентрации моноаминов проводили методом “внутреннего стандарта”, который анализирует отношения площади пиков хроматограммы для образцов головного мозга и в стандартной смеси (для калибровки использовали смесь рабочих стандартов определяемых веществ в пикомолярных концентрациях) [6].

Оценку значимости межгрупповых различий и внутригрупповых различий проводили с использованием U-критерия Манна–Уитни и Т-критерия Вилкоксона в GraphPad Prism 8.0 (“GraphPad Software”, США). Значимость различий частоты заходов в опасный и безопасный отсеки рассчитывали с помощью критерия согласия частот [7] в STADIA 8.0 (Россия). На графиках данные представлены в виде медиан с межквартильным размахом (Q25–Q75).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Контрольные и опытные крысы, помещенные в центральный отсек до удара током, быстро переходили в один из темных отсеков, что отразилось в одинаково коротких ЛП соответствующей реакции (рис. 1). Удар током крыс контрольной и опытной групп привел к многократному росту ЛП ухода из центрального отсека, в среднем увеличившись в 100 и 60 раз соответственно. Согласно классическим представлениям [8], увеличение ЛП этой реакции свидетельствует о формировании следа памяти об ударе током в темном отсеке, позволяющем избегать захода в него при повторном помещении в установку и оставаться в освещенном отсеке.

 

Рис. 1. ЛП ухода в темный отсек до и после выработки УРПИ.

* – различие значимо (p < 0.05) по U-критерию Манна–Уитни при сравнении с контрольной группой; # – (p < 0.05) и ## (p < 0.01) по Т-критерию Вилкоксона.

 

Использованная нами модификации теста позволила получить данные о пространственном компоненте УРПИ. Результаты опыта показывают, что крысы заходят в опасный отсек не реже, чем выбирают безопасный отсек или остаются в центральном отсеке (табл. 1). Более того, контрольные крысы парадоксальным образом статистически значимо чаще заходят в опасный отсек, если не остаются в центральном отсеке. Эти результаты согласуются с полученными ранее [5]. Из результатов следует заключить, что след памяти отражает только электроболевое воздействие как таковое безотносительно к месту его нанесения. Таким образом, септопластика не повлияла на оба использованных показателя памяти. Это произошло, по нашему мнению, по следующим причинам. Септопластика не уменьшила выбор безопасного отсека из-за того, что этот показатель исходно находился на минимальном уровне; для выявления влияния на ЛП, как показывает экспериментальная практика, требуются большие выборки.

 

Таблица 1. Выбор крысами отсека в день тестирования УРПИ

Группа	Выбранный отсек
	Опасный		Центральный		Безопасный
	n	%	n	%	n	%	Z	р
Интактные	3	37.5	5	62.5	0	0	2.562	0.0104*
Септопластика	1	12.5	4	50	3	37.5	1.732	0.08327

* – величины критериев согласия частот и уровней значимости указаны относительно величины выбора “опасного” отсека (Опасный отсек vs, Безопасный отсек, p < 0.05).

 

Дополнительная информация об эффектах септопластики была получена из анализа 5-минутных наблюдений за поведением крыс. Было установлено, что до удара током время обследования входов и число стоек у опытных и контрольных крыс значимо не отличались (рис. 2, а–б).

 

Рис. 2. Влияние септопластики на а – время обследования входов и б – количество стоек до и после выработки УРПИ.

** – различие значимо (p < 0.01) по U-критерию Манна–Уитни при сравнении с контрольной группой; # – различие значимо (p < 0.05) по Т-критерию Вилкоксона при сравнении показателей до и после удара током.

 

При тестировании УРПИ у опытных крыс, как это следует из рис. 2, обнаружены уменьшение времени обследования входов в темные отсеки и числа стоек относительно как исходных, так и контрольных значений. Это свидетельствует об уменьшении исследовательской активности у крыс под влиянием септопластики. Кроме того, выявлены значимые различия (p = 0.004) во времени реакции замирания: у крыс опытной группы оно составило 19.1 (12.1–41.9) с, а контрольной 2.8 (0–8.2) с, что свидетельствует о повышенном уровне тревожности у опытных животных в условиях УРПИ.

Из литературы известно, что тревожность связана с повышением уровня глюкокортикоидов в крови [9]. Спустя несколько дней после септопластики наблюдается повышение уровня кортизола у человека [10] и кортикостерона у крыс [11], что свидетельствует о продолжительной активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси. Операция влияет на вариабельность сердечного ритма у крыс в результате усиления симпатического тонуса ЦНС [11]. На фоне физиологического стресса, предварительно вызванного социальной изоляцией [12], происходит изменение выработки УРПИ в виде уменьшения ЛП ухода в темный отсек.

Так как нейрогуморальные механизмы тревожности и стресса во многом зависят от активности гипоталамуса, мы исследовали изменения концентрации и метаболизма норадреналина в данной структуре. Обнаружено, что у опытных животных наблюдалось значимое увеличение относительно контроля метаболита норадреналина 3-метокси-4-гидроксифенилгликоля (МОФЕГ) и соотношение МОФЕГ/НА (табл. 2).

 

Таблица 2. Содержание моноаминов и их метаболитов (нмоль/г ткани) в гипоталамусе крыс

Группа	НА	МОФЕГ	МОФЕГ/НА
Интактные	9.5 ± 3.2	0.06 ± 0.04	0.006 ± 0.004
Септопластика	9.05 ± 3.4	0.10 ± 0.04*	0.011 ± 0.006*

*– различие значимо (p < 0.05) по U-критерию Манна-Уитни при сравнении с контрольной группой.

 

Из литературных данных известно, что воздействие различных стрессирующих факторов, в том числе тока при выработке рефлексов, приводит к усилению активности норадренергической системы и метаболизма данного нейромедиатора в гипоталамусе и миндалине [13]. Перечисленные изменения связаны с повышенной тревожностью и психоэмоциональным стрессом, а также выработкой и воспроизведением следа памяти [14]. Зафиксированный нами рост метаболизма НА согласуется с перечисленными фактами и высокой тревожностью крыс, перенесших септопластику.

Таким образом, на биологической модели септопластики было показано усиление тревожности, сопровождающееся ростом метаболизма норадреналина у крыс, перенесших операцию, в условиях УРПИ. Полученные результаты согласуются с имеющимися представлениями о механизмах развития физиологического стресса, в частности, активации гипоталамо-гипофизарной-надпочечниковой оси. Модель эффективно воспроизводит поведенческие и нейрохимические изменения после хирургического вмешательства в носовую полость. Полученные в ходе исследования результаты расширяют представления о возможных послеоперационных изменениях высших психических функций и когнитивной деятельности человека, вызванных хирургическим вмешательством в челюстно-лицевой области и затрагивающих периферический отдел обонятельного анализатора. Данные эксперимента могут быть использованы в доклинических исследованиях для оценки эффективности и поиска новых медикаментозных препаратов, используемых в восстановительном периоде после септопластики.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена при финансовой поддержке госзадания “Нейробиологические основы поведения животных” (номер гостемы 11-1-21, номер ЦИТИС 121032500080-8).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Исследования одобрены этическим комитетом Медицинского института Российского университета дружбы народов им. Патриса Лумумбы от 18.09.2020 (протокол № 1).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

А. Г. Королев

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; ФГАОУ ВО Российский университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы

Автор, ответственный за переписку.
Email: korolevpost@gmail.com

Кафедра высшей нервной деятельности, Биологический факультет, Медицинский институт 

Россия, Москва; Москва

И. В. Кастыро

ФГАОУ ВО Российский университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы

Email: korolevpost@gmail.com

Медицинский институт 

Россия, Москва

А. Н. Иноземцев

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: korolevpost@gmail.com

Кафедра высшей нервной деятельности, Биологический факультет

Россия, Москва

А. В. Латанов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: korolevpost@gmail.com

Кафедра высшей нервной деятельности, Биологический факультет

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы