Efficient editing of the CXCR4 locus using Cas9 ribonucleoprotein complexes stabilized with polyglutamic acid

全文:

Редактирование генома клеток человека с помощью системы CRISPR/Cas9 является перспективной технологией для создания препаратов, предназначенных для лечения вирусных инфекций (HIV, HPV), онкологических, аутоиммунных и метаболических заболеваний человека [1]. Успешное применение системы CRISPR/Cas9 в клинической практике требует высокой эффективности редактирования. Предложено большое количество различных подходов, направленных на повышение уровня редактирования, таких как модификации белка Cas9, гидовой РНК, донорной ДНК, оптимизация средств доставки геномных редакторов в клетки, а также воздействие на пути репарации ДНК [2, 3].

Одна из областей применения геномного редактирования – разработка генотерапевтических подходов для лечения ВИЧ-инфекции [4]. В мире насчитывается более 38 млн человек, зараженных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), которые вынуждены пожизненно принимать антиретровирусные препараты. Несмотря на высокую эффективность таких препаратов, их прием сопряжен с побочными эффектами и существует риск развития устойчивости вируса к ним [4]. Поэтому актуальной представляется разработка альтернативных методов лечения с помощью технологии геномного редактирования. Один из таких методов направлен на получение CD4⁺ Т-клеток человека, устойчивых к ВИЧ-инфекции. В частности, этого можно добиться с помощью нокаута генов корецепторов ВИЧ или нокина генетических конструкций, экспрессирующих противовирусные факторы [5]. Поэтому важной задачей является повышение эффективности геномного редактирования для получения как можно более обогащенной популяции редактированных клеток, что важно для их приживления в организме реципиента.

Целью данной работы было повышение уровня редактирования локуса CXCR4, кодирующего хемокиновый рецептор CXCR4, который является одним из корецепторов ВИЧ. Нокаут CXCR4 в зрелых CD4⁺ Т-клетках представляется возможной стратегией придания Т-клеткам устойчивости к ВИЧ, которая была успешно применена в нескольких работах [6, 7]. Кроме того, ранее нами была разработана платформа нокина в локус CXCR4 пептидных ингибиторов слияния ВИЧ с клеткой [8]. Таким образом, повышение уровней нокаута и нокина для локуса CXCR4 представляются актуальными задачами для разработки методов терапии ВИЧ-инфекции с помощью геномного редактирования.

Важно отметить, что для применения в клинической практике наиболее предпочтительной является доставка Cas9 в клетки в виде рибонуклеопротеиновых комплексов (ribonucleoprotein, RNP), так как RNP обладают меньшей токсичностью по сравнению с молекулами ДНК или РНК, позволяют снизить вероятность нецелевого редактирования, а отсутствие плазмидной ДНК устраняет риск ее интеграции в геном клеток-мишеней [9]. Для повышения уровня редактирования локуса CXCR4 с помощью RNP белок Cas9 модифицировали путем увеличения числа NLS, а комплексы RNP стабилизировали с помощью поли-L-глутаминовой кислоты (poly-L-glutamic acid, PGA) [10, 11]. В нескольких работах показано, что тип и количество сигналов NLS в белке Cas9 влияют на эффективность редактирования [10, 12]. Однако подобных данных, полученных для Т-клеточных линий или первичных Т-клеток, мало [13]. Поэтому решено было оценить эффект от увеличения числа NLS в белке Cas9 при редактировании Т-клеточной линии CEM/R5, полученной на основе линии CCRF-CEM (ATCC) и описанной ранее [8]. Для этого на основе плазмиды SP-Cas9 (Addgene #62731), в которой белок Cas9 имеет один сигнал NLS на С-конце, конструировали плазмиды, кодирующие Cas9 c 2x, 3x или 4хNLS (рис. 1, а). Для создания конструкции с 2хNLS амплифицировали фрагмент плазмиды SP-Cas9, кодирующий N-конец Cas9, с помощью праймеров 5’-Nco-NLS-Cas9 и 3’-Nde-Cas9 (нуклеотидные последовательности всех праймеров приведены в табл. 1).

 

Таблица 1. Олигонуклеотиды, использованные в работе

Название	Нуклеотидная последовательность, 5’ -> 3’
5’-Nco-NLS-Cas9	GCCCATGGCGAAACGTCCGGCGGCCACGAAGAAAGCCGGTCAGGCGAAGAAAAAGAAAGCAGCGGATAAAAAATACAGCATTGGTC
3’-Nde-Cas9	GATCATATGAGCCAGTGCC
5’-Cas9_Nhe	GGCTAGCCATTATGAAAAACTG
3’-Cas9_Afl	CCTTAAGCGAGCCACCGCCCACTTTG
5’-Afl-2xNLS	TTAAGCCGGCAGCTAAGAAAAAGAAAGGCAGCCCTAAGAAAAAGCGTAAAGTGGGCGGTGGCTCGCATCATCATCATCATCACTAAG
3’-Afl-2xNLS	GATCCTTAGTGATGATGATGATGATGCGAGCCACCGCCCACTTTACGCTTTTTCTTAGGGCTGCCTTTCTTTTTCTTAGCTGCCGGC

 

Продукт ПЦР клонировали в вектор pJET1.2 (Thermo Fisher Scientific, США). Далее, фрагмент NcoI-NdeI клонировали из pJET1.2 по этим же сайтам в плазмиду SP-Cas9, получая SP-Cas9–2xNLS. Для получения плазмид с 3х и 4xNLS сначала амплифицировали фрагмент плазмиды SP-Cas9 с праймерами 5’-Cas9_Nhe и 3’-Cas9_Afl, продукт ПЦР клонировали в вектор pCR-Blunt (Invitrogen, США), получая pCR-Cas9-NLS NA. Далее одноцепочечные олигонуклеотиды 5’-Afl-2xNLS и 3’-Afl-2xNLS гибридизовали и клонировали в плазмиду pCR-Cas9-NLS NA по сайтам AflII-BamHI, получая pCR-Cas9–3xNLS-6His, из которой далее клонировали фрагмент NheI-BamHI в плазмиды SP-Cas9 и SP-Cas9–2xNLS, получая соответственно SP-Cas9–3xNLS и SP-Cas9–4xNLS.

Было обнаружено, что белки с 2х и 4хNLS, несущие один из сигналов NLS на N-конце, неэффективно экспрессировались в клетках E. coli BL21(DE3) (рис. 1, б). Возможно, необходимо модифицировать N-конец Cas9, например, добавив к нему фрагмент мальтоза-связывающего белка (maltose-binding protein, MBP) для облегчения экспрессии в бактериях, как было сделано в работе Staahl et al. [14]. Поэтому далее были очищены белки Cas9 c 1х и 3хNLS на С-конце как описано в работе Maslennikova et al. [8]. Мишень для Cas9 в локусе CXCR4 (CACTTCAGATAACTACACCGAGG) была описана ранее [8]. Гидовую РНК получали с помощью транскрипции in vitro, как подробно описано в работе Maslennikova et al. [8].

 

Рис. 1. (а) Схемы плазмидных конструкций для экспрессии Cas9 с различным числом NLS в клетках E.coli. Показаны аминокислотные последовательности NLS вируса SV40, NLS из белка нуклеоплазмина и последовательность второго оснóвного мотива из NLS нуклеоплазмина (PAAKKKK) [20]. (б) Электрофореграмма лизатов клеток E.coli BL21 (DE3), трансформированных одной из четырех конструкций для продукции Cas9, до и после индукции экспрессии с помощью IPTG. Белки разделяли в 7.5 % акриламидном геле и окрашивали красителем Кумасси R‑250. М – маркеры молекулярного веса белков.

 

Для формирования RNP комплексов смешивали 200 пмоль белка Cas9 и 200 пмоль гидовой РНК в буфере R (Invitrogen, США) и инкубировали смесь 20 мин при комнатной температуре. Готовые RNP электропорировали в 1.5x10⁶ клеток CEM/R5 с помощью прибора Neon (Invitrogen, США) при параметрах 1230 В, 40 мс, 1 импульс. На 3 день оценивали уровень белка CXCR4 на поверхности клеток методом проточной цитофлуориметрии с помощью мышиных моноклональных антител против CXCR4 (клон 12G5, Santa Cruz Biotechnology, США) и козьих антител против иммуноглобулинов мыши, коньюгированных с Alexa488 (Thermo Scientific, США). Добавление двух дополнительных сигналов NLS к белку Cas9 увеличивало процент негативных по CXCR4 клеток в 1.8 раза (рис. 2, а).

 

Рис. 2. (а) Уровень нокаута CXCR4 в клетках CEM/R5, электропорированных RNP с Cas9–1xNLS или Cas9– 3xNLS. (б) Уровень нокаута CXCR4 в клетках CEM/R5, электропорированных комплексами RNP с добавлением PGA (+) или без добавления PGA (–). Экспрессию белка CXCR4 анализировали с помощью проточной цитометрии проводили на 3 день после электропорации. (в) Уровень нокина пептида МТ-С34 в локус CXCR4 в CD4+ Т-лимфоцитах, электропорированных RNP с Cas9-3xNLS вместе с донорной плазмидой pJet-X4ex2 в присутствии PGA (+) или без PGA (–).

 

В отсутствие gRNA белок Cas9 нестабилен и даже в комплексе с gRNA в составе RNP может формировать нефункциональные агрегаты [11]. Согласно работе Nguyen et al., предотвратить агрегацию и повысить стабильность RNP можно с помощью анионного полимера PGA [11]. Поэтому была оценена эффективность нокаута CXCR4 с помощью Cas9-3xNLS в присутствии PGA. Для этого использовали PGA с молекулярной массой 15–50 кДа, разведенную до концентрации 100 мг/мл в деионизованной воде. Для формирования RNP комплексов PGA использовали как описано в статье Nguyen et al [11]: на один образец смешивали 4 мкл PGA (100 мг/мл в воде) и 200 пмоль gRNA, затем данную смесь добавляли к 200 пмоль Cas9 в буфере R. Было обнаружено, что добавление PGA к RNP комплексам увеличивало уровень нокаута CXCR4 в 1.4 раза (рис. 2, б).

Данные, полученные на Т-клеточной линии CEM/R5, показали, что введение дополнительных сигналов NLS в белок Cas9 и добавление PGA к RNP комплексам приводят к повышению уровня нокаута CXCR4. После этого решено было перейти к клинически релевантной модели и провести эксперимент на первичных CD4⁺ Т-клетках. В этом случае проводили нокаут CXCR4 с одновременным нокином пептидного ингибитора слияния ВИЧ-1 МТ-С34 во второй экзон гена CXCR4. В результате корректного нокина клетки экспрессировали короткий GPI-заякоренный пептид МТ-С34 на мембране, который можно было детектировать с помощью полученных ранее антител [8]. Периферические мононуклеарные клетки выделяли из крови здоровых доноров, CD4⁺ Т-клетки выделяли с помощью магнитной сепарации (#130–096–533, Miltenyi Biotec, Германия) и активировали с помощью частиц с иммобилизованными антителами против CD2, CD3 и CD28 (#130–091–441, Miltenyi Biotec, Германия) в течение 2 суток. Для электропорации готовили RNP комплексы в присутствии PGA или без нее, которые смешивали с 5.4 мг донорной плазмиды pJet-X4ex2, описанной ранее [8], добавляли к 1.5×10⁶ клеток и проводили электропорацию при параметрах 1600 В, 10 мс, 3 импульса. На 3 сутки после электропорации анализировали уровень пептида MT-C34 на поверхности клеток методом проточной цитофлуориметрии с помощью мышиных моноклональных антител С24 [8] и козьих антител против иммуноглобулинов мыши, коньюгированных с Alexa488 (Thermo Scientific, США). Поскольку экспрессия CXCR4 на первичных CD4⁺ Т-лимфоцитах зависит от состояния активации клеток и постепенно снижается после стимуляции [15], значительная часть клеток в контрольном образце без добавления RNP оказывалась негативной по CXCR4 (данные не показаны). По этой причине было решено оценивать только уровень нокина, который в нашем случае является наиболее важным показателем. Именно клетки с нокином представляют собой целевую популяцию, которая потенциально может быть использована для переноса реципиенту. Было обнаружено, что уровень нокина при использовании RNP с тремя сигналами NLS составлял около 1.5 %, а при добавлении PGA к RNP комплексам достигал 3 % (рис. 2, в).

Известно, что большее число NLS в белке Cas9 увеличивает эффективность доставки Cas9 в ядро и тем самым повышает уровень редактирования [10, 12]. Мы показали влияние такой модификации Cas9 на уровень редактирования в Т-клеточной линии CEM/R5. Наши данные согласуются с результатами недавно опубликованной работы, в которой было показано, что при введении второго NLS SV40 в белок Cas9 происходило увеличение уровня редактирования локуса CCR5 в Т-клеточной линии Jurkat в 1.5–2 раза [13].

Дополнительная стабилизация RNP комплексов с помощью PGA, как впервые было показано в работе Nguyen et al. [11], приводила к повышению уровня нокаута CXCR4 в 1.4 раза. PGA была использована в нескольких работах, посвященных редактированию Т клеток [11, 16–19]. В одних работах при добавлении PGA к RNP комплексам авторы наблюдали повышение уровня нокина и повышение выживаемости клеток [11, 18], в других отмечалось или только небольшое повышение нокина [17], или положительное влияние на выживаемость [16]. Наконец, в одной работе не было обнаружено никакого эффекта от PGA [19]. В нашей модели в присутствии PGA удалось повысить уровень нокаута CXCR4 и уровень нокина пептидного ингибитора слияния ВИЧ-1 МТ-С34. Кроме того, мы заметили, что при использовании более жестких режимов электропорации (1700 В, 20 мс, 1 импульс), при которых удается добиться еще более высоких показателей нокаута, в присутствии PGA клетки выживают лучше и делятся быстрее, чем без добавления PGA (данные не показаны).

Таким образом, нами было показано, что введение дополнительных сигналов NLS и добавление PGA к RNP комплексам приводило к повышению уровня нокаута CXCR4 в Т-клеточной линии СЕМ/R5, а также к повышению уровня нокина пептида МТ-С34 в этот локус в первичных CD4⁺ Т-клетках. Полученные данные могут быть использованы при разработке методов редактирования Т-клеточных линий и первичных Т-клеток человека с целью создания генотерапевтических средств для лечения ВИЧ-инфекции.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарят А. Н. Бончука и О. В. Аркову за очистку рекомбинантного белка Cas9. Работа была выполнена с использованием инфраструктуры Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины Института биологии гена РАН.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-25-00310).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эксперименты с образцами крови доноров одобрены Комиссией по биоэтике Института биологии гена РАН (Москва, Россия), заключение № 5 от 15.04.2022. У доноров получено письменное информированное согласие.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

作者简介

D. Golubev

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine

编辑信件的主要联系方式.
Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Institute of Gene Biology Russioan Academy of Sciences

俄罗斯联邦, Moscow

D. Komkov

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine; Ben-Gurion University of the Negev

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Institute of Gene Biology Russioan Academy of Sciences, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences

俄罗斯联邦, Moscow; Be’erSheva, Israel

M. Shepelev

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Institute of Gene Biology Russioan Academy of Sciences

俄罗斯联邦, Moscow

D. Mazurov

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine; University of Minnesota

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Institute of Gene Biology Russioan Academy of Sciences, Division of Infectious Diseases and International Medicine, Department of Medicine

俄罗斯联邦, Moscow; Minneapolis, USA

N. Kruglova

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Institute of Gene Biology Russioan Academy of Sciences

俄罗斯联邦, Moscow

参考

补充文件