Малозатратное устройство для измерения TEER при культивировании эпителиальных/эндотелиальных клеток на вставках.

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Актуальность. Барьерные свойства эпителиальных и эндотелиальных клеток обычно изучают in vitro при культивировании клеток на сетчатых вставках в культуральных планшетах, при этом необходимо оценивать состояние монослоя клеток на мембране вставок перед проведением эксперимента. Обычно анализ плотности монослоя проводят по прохождению флуоресцентной метки через вставку с клетками или измеряя трансэндотелиальное сопротивление (TEER) клеточного слоя. Во многих исследованиях применяют параллельно оба метода оценки целостности монослоя в зависимости от цели исследования. Метод с применением TEER позволяет также регистрировать ранние изменения состояния монослоя при действии различных веществ.

Цель данной работы - продемонстрировать возможность измерений TEER с применением предлагаемого устройства (кондуктометра), изготовленного из доступных компонентов, на примере клеток эндотелиального/эпителиального происхождения.

Материалы и методы исследования. Представлено устройство (кондуктометр) для измерения TEER, созданное на основе легко доступных компонентов. Устройство было проверено при культивировании двух клеточных линий – гибридома эндотелиального происхождения Ea.hy926 и аденокарцинома ободочной кишки человека Caco-2.  Клетки линии Caco-2 культивировали в течение 22 суток, а клетки линии Ea.hy926 - в течение 7 суток. Целостность клеточного монослоя и плотность межклеточных контактов оценивали по величине TEER, определяемую с помощью предлагаемого кондуктометра, а также по проницаемости монослоя клеток для флуоресцеина/меченого флуоресцеином декстрана.

Результаты. Приведены результаты измерений TEER с помощью предлагаемого устройства и проницаемости монослоя клеток для Na флуоресцеина/меченого флуоресцеином декстрана при культивировании клеток Caco-2 и EA.hy926. Для клеток Caco-2  с момента начала измерений значение TEER постепенно увеличивалось, достигая максимальных значений к 20-21 суткам, после чего немного снижалось. Значения проницаемости снижались по мере культивирования клеток, что указывало на образование плотных контактов. Для клеток  EA.hy926 подъем значений TEER происходил на третьи сутки, на 7 сутки начиналось снижение. Полученные нами с помощью предложенного устройства результаты TEER  и проницаемости имеют сильную обратную корреляцию и хорошо согласуются.

Заключение.  Представленное устройство, выполненное на базе простых и доступных компонентов, аналогично коммерчески доступным приборам и может быть использовано для изучения целостности и плотности монослоя при культивировании эпителиальных/эндотелиальных клеток, изучения процессов транс/парацеллюлярного транспорта при действии различных веществ, а также при экспериментах с ко-культивированием различных клеточных линий.

Об авторах

Ирина Владимировна Воронкина

Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: voronirina@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-0078-4442
SPIN-код: 2336-4158

канд. биол. наук, старший научный сотрудник отдела биохимии

Россия, Санкт-Петербург

Лариса Владимировна Смагина

Институт экспериментальной медицины

Email: smagina.la.vl@gmail.com
SPIN-код: 8605-7671

научный сотрудник отдела биохимии

Россия, Санкт-Петербург

Анна Андреевна Иванова

Институт экспериментальной медицины

Email: anna.ivantcova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8673-9628
SPIN-код: 5306-1995

научный сотрудник отдела биохимии

Россия, Санкт-Петербург

Татьяна Сергеевна Салль

Институт экспериментальной медицины

Email: miss_taty@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5890-5641
SPIN-код: 4172-6277

научный сотрудник отдела биохимии

Россия, Санкт-Петербург

Юрий Эдуардович Адамьян

Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого

Email: wiradam@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-3410-1005
SPIN-код: 2739-8689

канд. техн. наук, доцент Высшей школы высоковольтной энергетики

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. EVOM™ MANUAL FOR TEER MEASUREMENT. [дата обращения: 3.03.2023] Доступ по ссылке: https://www.wpiinc.com/evm-mt-03-01-evomtm-manual-for-teer-measurement.html
  2. Raut, B. Chen, L.-J., Hori, T. et al.. An Open-Source Add-On EVOM® Device for Real-Time Transepithelial/Endothelial Electrical Resistance Measurements in Multiple Transwell Samples // Micromachines. 2021. Vol.12. P.282. doi.org/10.3390/mi12030282
  3. CELLZCOPE The Automatic Cell Monitoring System. [дата обращения: 20.04.2023] Доступ по ссылке:https://www.nanoanalytics.com/en/products/cellzscope.html
  4. REMS Autosampler [дата обращения: 08.07.2023] Доступ по ссылке: https://www.yumpu.com/en/document/view/34494981/rems-autosampler-instruction-manual-world-precision-instruments/48
  5. Theile, M., Wiora, L., Russ, D., Reuter, et al., A simple approach to perform TEER measurements using a self-made volt-amperemeter with programmable output frequency. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 2019: 152, e60087. doi: 10.3791/60087
  6. Rajabzadeh, M., Ungethum, J., Herkle, A., et al. A PCB-Based 24-Ch. MEA-EIS Allowing Fast Measurement of TEER. IEEE Sensors Journal. 2021. Vol. 21, N 12. P. 13048–13059. doi: 10.1109/jsen.2021.3067823
  7. D. Bouis, G.A. Hospers, C. Meijer, et al. Endothelium in vitro: a review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis. 2001.Vol.4 , N 2. P. 91-102.
  8. Lisec, B. , Bozic, T. , Santek, I. Characterization of two distinct immortalized endothelial cell lines, EA.hy926 and HMEC-1, for in vitro studies: exploring the impact of calcium electroporation, Ca2+ signaling and transcriptomic profiles. Cell Communication and Signaling . 2024. Vol. 22, N 1. P. 118. doi: 10.1186/s12964-024-01503-2
  9. Транова Ю. С., Слепнев А. А., Черных И. В., и др. Методика тестирования лекарственных средств на принадлежность к субстратам и ингибиторам белка-транспортера BCRP на клетках линии Caco-2. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2023. Т. 12, № 2. С. 87-94. doi.org/10.33380/2305-2066-2023-12-2-87-94.
  10. Yutaka Konishi, Keiko Hagiwara, Makoto Shimizu. Transepithelial Transport of Fluorescein in Caco-2 Cell Monolayers and Use of Such Transport in In Vitro Evaluation of Phenolic Acid Availability. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 2002. Vol. 66, N 11. P. 2449-2457. doi: 10.1271/bbb.66.2449.
  11. Prachi Shekhawat, Milind Bagul, Diptee Edwankar, et al. Enhanced dissolution/caco-2 permeability, pharmacokinetic and pharmacodynamic performance of re-dispersible eprosartan mesylate nanopowder. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 2019. Vol. 132, P. 72-85. doi.org/10.1016/j.ejps.2019.02.021.
  12. Щулькин АВ, Транова ЮС, Абаленихина ЮВ, и др. Клетки линии Сaco-2 как модель для изучения абсорбции лекарственных веществ. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2022. Т. 10. С. 63-69. doi.org/10.31146/1682-8658-ecg-206-10-63-69.
  13. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2007. Vol.2, N 9. P. 2111–2119. doi: 10.1038/nprot.2007.303.
  14. Poenar, D. P., Yang, G., Wan, W. K. & Feng, S.: Low-Cost Method and Biochip for Measuring the Trans-Epithelial Electrical Resistance (TEER) of Esophageal Epithelium. Materials (Basel). 2020. Vol. 13, N 10. P. 2354. doi: 10.3390/ma13102354
  15. Srinivasan, B. Kolli, A. R., Esch, M. B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 2015. Vol. 20, N 2. P. 107–126. doi: 10.1177/2211068214561025.
  16. Wuttimongkolchai, N., Kanlaya, R., Nanthawuttiphan, S., et al. Chlorogenic acid enhances endothelial barrier function and promotes endothelial tube formation: a proteomics approach and functional validation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2022. N 153, P. 113471. doi.org/10.1016/j.biopha.2022.113471
  17. Velandia-Romero, M. L., Calderón-Peláez, M. A., Balbás-Tepedino, A., et al. Extracellular vesicles of U937 macrophage cell line infected with DENV-2 induce activation in endothelial cells EA.hy926. PLoS One, 2020. Vol. 15, N 1. P. e0227030.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема измерительной системы (a) и осциллограммы сигналов с токового шунта Rsh (верхняя кривая) и с электродов (нижняя кривая) (b)

Скачать (183KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Пористая вставка с электродами. Крышка узла электродов фиксирует положение внутреннего электрода во вставке. Второй электрод находится между вставкой и стенкой лунки планшета

Скачать (179KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Распределение электрического потенциала во вставке с системой электродов: а — расчетное распределение электрического потенциала во вставке, заполненной 0,9 % раствором NaCl; b — электрод в наружной области имеет нулевой потенциал (обозначен черным), внутренний электрод — 1 В (серый)

Скачать (193KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Зависимость сопротивления между электродами от относительной площади отверстий в мембране

Скачать (78KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Частотная зависимость Z (f) для вставки с физиологическим раствором. Приведены результаты измерений для новой вставки

Скачать (91KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Динамика TEER (а) и проницаемость ФЛ-декстрана (b) для клеток Caco-2 в течение 3–22 сут культивирования. Представлены результаты репрезентативного эксперимента (n = 12). Приведены средние значения трех измерений и стандартная ошибка среднего. * p < 0,01, ** p < 0,05, *** p < 0,001. TEER — трансэпителиальное электрическое сопротивление; ФЛ-декстран — флуоресцеин декстрана

Скачать (183KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Динамика TEER относительно контроля без клеток (а) и проницаемости для ФЛ-Na в % от внесенного количества ФЛ-Na (b) при культивировании клеток EA.hy926 на вставках, покрытых коллагеном, в течение 7 сут. Клетки наносили по 20 тыс. на вставку. Представлены результаты репрезентативного эксперимента (n = 3). Приведены средние значения трех измерений и стандартная ошибка среднего. * p < 0,01, ** p < 0,05. TEER — трансэпителиальное электрическое сопротивление; ФЛ-Na — флуоресцеин-Na

Скачать (93KB)
Метаданные

© Эко-Вектор, 2024



Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».