Optimization of Calcium Phosphate Transfection Protocol

Cover Image


Cite item

Full Text

Abstract

Introduction. Despite the advancement of modern transfection methods, such as the use of polyethylenimine- and Lipofectamine-based reagents, their high cost limits their application in large-scale research and biotechnological processes. The classical calcium chloride–mediated transfection method remains a cost-effective alternative; however, its principal drawback is its relatively low efficiency compared to commercial counterparts. The aim of this study is to optimize the plasmid DNA-to-calcium chloride ratio in order to enhance the efficacy of calcium phosphate transfection.
Materials and methods. The efficacy of transfection was evaluated based on the fluorescence intensity of the green fluorescent protein, the nucleotide sequence of which is encoded within the plasmid employed – pCRISPaint-2A-TurboGFP-PEST. For plasmid amplification, competent Escherichia Coli cells were prepared, followed by transformation, plasmid propagation, and subsequent isolation for use in transfection experiments. A series of experiments were conducted to optimize the calcium phosphate transfection protocol for HEK 293T cells. The study examined the effects of varying both the quantity of DNA and the total reaction volume on transfection efficiency. The reference protocol utilized 40 μg of DNA in a total reaction volume of 1 ml.
Results. A consistent correlation was established: transfection efficiency was dependent upon both the quantity of introduced DNA and the volume of the reaction mixture. Optimal efficacy was achieved utilizing double- and quadruple-dose DNA concentrations relative to the reference protocol, conversely, reduction of DNA quantity resulted in a marked decrease in the number of transfected cells. A further observation was a precipitous decline in transfection efficiency upon reduction of the reaction mixture volume while maintaining a constant DNA amount.
Discussion and conclusion. It was determined that the critical factor for enhancing the efficiency of calcium-phosphate transfection is not the absolute quantity of DNA, but rather the balance between its concentration and the total volume of the reaction mixture. An optimal component ratio for 2–3∙105 cells/ml of HEK 293T cells was established at 80 μg of DNA per 1 ml of reaction mixture. This specific ratio ensures the formation of nanoscale precipitate particles suitable for efficient endocytosis. Any deviation from this balance – whether a reduction in DNA quantity or a critical increase in its concentration due to a decrease in volume – resulted in a marked decline in transfection efficiency. Consequently, the proposed modification of the protocol represents a cost-effective alternative to expensive commercial reagents (PEI 40K APExBIO, transfection efficiency 60–80%, cost from 22,000 RUB; Lipofectamine 3000, transfection efficiency >70%, cost from 28,000 RUB), as it enables comparable efficacy while maintaining the accessibility of the method for routine investigations.

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Трансфекция – ключевой метод молекулярной биологии и генной инженерии, позволяющий вводить экзогенную ДНК или РНК в эукариотические клетки для изучения функций генов, регуляции экспрессии, производства рекомбинантных белков и генной терапии [1; 2]. Этот процесс лежит в основе множества биотехнологических и медицинских исследований, включая разработку вакцин, создание генетически модифицированных клеточных линий, изучение механизмов заболеваний и специфического действия лекарственных препаратов [3].

Для успешной трансфекции необходимо преодолеть несколько барьеров: отрицательный заряд клеточной мембраны, который отталкивает нуклеиновые кислоты и защитные механизмы клетки, предотвращающие поглощение чужеродного генетического материала [4]. Для этого существуют различные подходы, которые можно разделить на три основные группы.

Физические методы, например, микроинъекция, при которой нуклеиновая кислота вводится непосредственно в цитоплазму или ядро клетки [1]. Также к ним относится электропорация – метод, при котором используется электрический импульс для создания пор в клеточной мембране и облегчения проникновения ДНК [5]. Кроме этого, применяется баллистическая трансфекция – использование «генной пушки» для доставки в клетки наночастиц, покрытых генетическим материалом [6].

Химические методы (применение липосомальных или полимерных реагентов), которые основаны на образовании комплексов ДНК с катионными веществами, нейтрализующими заряд и способствующими слиянию с мембраной [7]. Другим примером является кальций-фосфатная трансфекция, базирующаяся на формировании ДНК-кальций-фосфатного преципитата, в дальнейшем попадающего в клетку через эндоцитоз [8].

Используются также вирусные векторы (лентивирусы, аденовирусы), поскольку они имеют естественную способность проникать в клетки, однако данный способ трансфекции требует сложного производства и имеет ограничения по безопасности [1]. Системы на основе лентивирусов являются одним из наиболее действенных инструментов для стабильной трансфекции, превосходя по эффективности многие невирусные методы, хотя они и демонстрируют вариабельность в зависимости от типа клеточной линии [9; 10].

Наиболее часто применяются химические методы трансфекции. Так, кальциевая трансфекция (метод CaCl2) – один из первых и самых доступных способов, основанный на осаждении ДНК в виде нерастворимых комплексов с ионами кальция. Эти комплексы поглощаются клетками через эндоцитоз. Несмотря на простоту и экономичность, метод часто малоэффективен и требует оптимизации [11]. Полиэтиленимин (PEI) – синтетический катионный полимер, формирующий плотные комплексы с ДНК и обеспечивающий высокий уровень трансфекции, но он является потенциально токсичным для некоторых типов клеток [12; 13]. Также широко распространены липофектамин и другие липосомальные реагенты, формирующие везикулы вокруг ДНК, что облегчает ее доставку в цитоплазму. Они высокоэффективны, но требуют существенных финансовых вложений [4].

Несмотря на появление более действенных коммерческих реагентов, метод с использованием CaCl2 остается востребованным благодаря своей простоте и экономичности. Однако его основной недостаток – вариабельная и часто низкая эффективность, меняющаяся в пределах 0,5–10 %, что нередко ограничивает применение данного метода в рутинных исследованиях [14; 15]. Отмечается, что при оптимизации протокола можно достигнуть эффективности 50–60 % [16; 19]. Одним из основных факторов, влияющих на эффективность кальциевой трансфекции, является размер ДНК-кальциевого комплекса. Агрегация комплексов ведет к снижению эффективности поглощения частиц, а также сопровождается ростом цитотоксичности [16]. Так, в одной из работ показано, что максимальная эффективность трансфекции достигалась при использовании преципитата после 1 мин инкубации;  увеличение же времени инкубации до 5 и 40 мин приводило к снижению результативности, что обусловлено формированием более крупных комплексов, размер которых был сопоставим с размером клеток [19]. Еще одним фактором, влияющим на размер ДНК-кальциевого комплекса, является pH раствора для трансфекции: при pH меньше 6,95 формируются мелкие частицы преципитата, при pH больше 7,05 – крупные частицы1. В свою очередь, pH культуральной среды влияет на выживание клеток во время трансфекции [17]. Частичное перемешивание раствора ДНК, CaCl2 и HEPES/HBS-буфера также оказывает воздействие на формирование ДНК-кальций-фосфатного преципитата [16]. Чистота и концентрация ДНК влияют на формирование преципитата, при этом высокая концентрация ДНК может ингибировать процесс формирования преципитата, тем самым уменьшая эффективность трансфекции [16; 19]. В нескольких работах отмечено воздействие температуры на формирование ДНК-кальций-фосфатного комплекса и последующую эффективность трансфекции. Так, при температуре 37 °С происходила наибольшая ассоциация ДНК с преципитатом вне зависимости от времени инкубирования; при 20 °С этот показатель достигал 80 % только после 20 мин инкубирования [11; 19]. Наряду с вышеперечисленными факторами на эффективность трансфекции может воздействовать состояние и возраст культуры [16].

В связи с вышеизложенным актуальной проблемой является поиск оптимальных соотношений между количеством ДНК, клеток и концентрацией CaCl2, что позволит повысить эффективность трансфекции без использования дорогостоящих аналогов.

Цель исследования – подбор оптимальных условий проведения кальций-фосфатной трансфекции путем определения наиболее результативного соотношения ключевых компонентов реакции.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Оценку эффективности трансфекции проводили по интенсивности свечения зеленого флуоресцентного белка (GFP), нуклеотидная последовательность которого содержится в используемой плазмиде pCRISPaint-2A-TurboGFP-PEST (Plasmid #67180, Addgene, США). Для наработки плазмиды использовались методы приготовления компетентных клеток (E. Coli) с дальнейшей их трансформацией несущей белок плазмидой.

Последовательность выполнения эксперимента:

  1. Наработка плазмидного вектора

Трансформация клеток E. coli штамма XL1-Blue (Evrogen, Россия) проводилась по стандартному методу с использованием химической компетентности на основе CaCl2 [18].

  1. Культивирование клеток

Единичную колонию высевали в жидкую среду LB (Biocomma, Китай) и инкубировали 12–18 ч при + 37 °C на шейкере (240 об/мин). Затем 0,25 мл ночной культуры добавляли к 4,75 мл свежей среды LB и инкубировали 1,5 ч в тех же условиях для достижения логарифмической фазы роста.

  1. Приготовление компетентных клеток

Клетки осаждали центрифугированием, супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в охлажденном 0,1 М растворе CaCl2 (CDH, Индия). Процедуру промывки CaCl2 повторили. Конечный осадок ресуспендировали в 100 мкл 0,1 М CaCl2 и инкубировали на льду 1 ч.

  1. Трансформация

В 100 мкл аликвоты компетентных клеток добавляли 5 мкл раствора плазмидной ДНК (10–20 нг/мкл). Смесь инкубировали на льду 30 мин, подвергали тепловому шоку при + 42 °C в течение 2 мин и немедленно возвращали на лед на 1–2 мин. После шока добавляли 1 мл среды LB и инкубировали 1–2 ч при + 37 °C для экспрессии гена антибиотикорезистентности.

  1. Отбор трансформантов

Клетки высевали на чашки с агаризованной средой LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, и инкубировали 16–24 ч при + 37 °C. Для получения чистых культур колонии-трансформанты пересевали на среду с повышенной концентрацией ампициллина (100 мкг/мл).

  1. Выделение и очистка плазмидной ДНК

Плазмидную ДНК pCRISPaint-2A-TurboGFP-PEST (ранее трансформированную в штамм) выделяли из ночной культуры E. coli XL1-Blue, с использованием коммерческого набора для выделения плазмид Midiprep (Plasmid Midiprep 3.0, Evrogen, Россия) по методу щелочного лизиса. Клетки из 200 мл культуры, выращенной в среде LB с соответствующим антибиотиком, осаждали центрифугированием (6 000 g, 15 мин, 4 °C). Осадок ресуспендировали в буфере P1 (входит в состав набора) и лизировали добавлением буфера P2 (входит в состав набора). Нейтрализацию проводили охлажденным буфером P3 (входит в состав набора). После осаждения белков и клеточного дебриса центрифугированием (20 000 g, 30 мин, 4 °C) супернатант наносили на сорбционную колонку. Колонку промывали буфером для отмывки, после чего ДНК элюировали в стерильную воду или буфер TE. Концентрацию и чистоту препарата определяли спектрофотометрически на приборе Nano-500 (Allsheng, Китай) оценивая соотношения A260/280 и A260/230. Качество и конформацию плазмидной ДНК дополнительно контролировали электрофорезом в 0,7 % агарозном геле. Полученные препараты использовали для последующих молекулярно-биологических экспериментов.

  1. Анализ плазмидной ДНК электрофорезом в агарозном геле

Качество и количество плазмидной ДНК оценивали с помощью электрофореза в 0,7 % агарозном геле в 1 × TAE буфере с добавлением бромида этидия (0,5 мкг/мл). Образцы ДНК (5 мкл) смешивали с 6 × буфером для нанесения образцов ДНК на агарозный гель (Thermo Fisher Scientific, США) и вносили в лунки геля. В качестве маркера молекулярного веса использовали маркер длин ДНК (DNA Ladder 1 kb, Evrogen, Россия). Электрофорез проводили при 4 В/см в течение ~ 2 ч. После проведения гель визуализировали на трансиллюминаторе. Качественный препарат плазмидной ДНК характеризовался наличием двух основных полос: доминирующей суперскрученной (ковалентно-замкнутой кольцевой) формы и минорной релаксированной (открытой кольцевой) формы. Отсутствие примесей (геномной ДНК, РНК) свидетельствовало о высокой чистоте препарата. Полуколичественную оценку содержания ДНК проводили путем сравнения интенсивности флуоресценции полос ДНК с полосами маркера известной концентрации на системе гель-документирования (Gel Doc XR+, Bio-Rad, США) с использованием программы Image Lab.

  1. Трансфекция клеток HEK 293T кальций-фосфатным методом

Клетки HEK 293T (любезно предоставлены лабораторией нанобиотехнологий Московского физико-технического института) засевали в чашку Петри 10 мл полной среды и инкубировали 24 ч при + 37 °C, 5 % CO2 до достижения 75–80 % конфлюэнтности. Для трансфекции использовали 40 мкг плазмидной ДНК (вместо трех плазмид – только одну трансферную, взятую в количестве, равном суммарному количеству ДНК в стандартном протоколе). ДНК смешивали с 250 мкл 0,5 М CaCl2 и 250 мкл HEPES-буфера, доводя общий объем до 500 мкл. Смесь по каплям добавляли к 500 мкл 2 × буфера HeBS при постоянном перемешивании. Преципитат инкубировали 30–40 мин при комнатной температуре, затем медленно наносили на клетки. После ночной инкубации (+ 37 °C, 5 % CO2) среду удаляли, клетки однократно промывали фосфатным буфером и добавляли 10–15 мл свежей полной среды. Культуру инкубировали 72 ч при + 37 °C, 5 % CO2. Продукцию рекомбинантных лентивирусных частиц контролировали по образованию синцитиев.

  1. Оценка эффективности трансфекции клеток HEK 293T

Эффективность трансфекции предварительно оценивали через 24 ч после проведения процедуры с помощью флуоресцентного клеточного анализатора ZOE Fluorescent Cell Imager (Bio-Rad, США). Клетки визуализировали с использованием встроенных светодиодов и фильтров для детекции зеленого флуоресцентного белка (GFP). Для каждого образца регистрировали несколько полей зрения в каналах яркого поля и флуоресценции. Процент трансфицированных клеток оценивали по доле GFP-позитивных клеток в популяции с помощью программы ImageJ.

  1. Оценка жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток оценивали через 24 и 72 ч после трансфекции с помощью МТТ-теста. Клетки в 96-луночном планшете центрифугировали при 1 000 g в течение 5 мин, после чего удаляли культуральную среду и в каждую лунку вносили раствор МТТ (5 мг/мл). После инкубации в течение 3 ч и образования кристаллов формазана в лунки добавляли диметилсульфоксид. Оптическую плотность измеряли на планшетном спектрфотометре Varioscan Lux (Thermo Scientific, США) при длине волны 570/650 нм. Жизнеспособность оценивали как отношение оптической плотности образца к контрольным клеткам (без трансфекции).

 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для всесторонней оценки влияния ключевых параметров на эффективность кальций-фосфатной трансфекции клеток HEK 293T был проведен ряд систематических модификаций базового протокола2. Исходный (референсный) протокол предполагал использование 40 мкг плазмидной ДНК и формирование 1 мл общей реакционной смеси (преципитата) на стандартную чашку (100 мм) с клетками при 75–80 % конфлюэнтности.

Варианты модификаций протокола кальций-фосфатной трансфекции HEK 293T белком GFP представлены в таблице.

 

Таблица.  Варианты кальций-фосфатной трансфекции для клеточной линии HEK 293T

Table.  Variations of calcium phosphate transfection for HEK 293T cell line

Обозначение варианта / Designation of the variant

Количество ДНК на чашку Петри (100 мм), мкг /

Amount of DNA per Petri Dish (100 mm), µg

Общий объем реакционной смеси (преципитата), мл / Total volume of reaction mix (precipitate), ml

Описание модификации относительно референсного протокола /

Description of modification relative to the reference protocol

A

10

1

Количество ДНК уменьшено в 4 раза /

The amount of DNA was reduced four-fold

B

20

1

Количество ДНК уменьшено в 2 раза /

The amount of DNA was reduced two-fold

C

80

1

Количество ДНК увеличено в 2 раза /

The amount of DNA was increased two-fold

D

160

1

Количество ДНК увеличено в 4 раза /

The amount of DNA was increased four-fold

E (Контроль) / E (Control)

40

1

Референсный протокол / Reference protocol

F

40

0,5

Объем реакционной смеси уменьшен в 2 раза / The volume of reaction mix was reduced two-fold

G

40

0,25

Объем реакционной смеси уменьшен в 4 раза / The volume of reaction mix was reduced four-fold

H

40

0,125

Объем реакционной смеси уменьшен в 8 раз / The volume of reaction mix was reduced eight-fold

 

Источник: таблица составлена авторами.

Source: the table was compiled by the authors.

 

Для каждого варианта тщательно контролировались критически важные параметры формирования преципитата: время инкубации (30–40 мин), pH буферных растворов, а также температура и скорость смешивания компонентов. Визуальный контроль размера и гомогенности частиц преципитата проводился непосредственно перед его внесением в клеточную культуру. Жизнеспособность клеток и эффективность трансфекции оценивались через 24 и 72 ч после проведения процедуры (рис. 1).

 

 

Рис. 1.  Оценка жизнеспособности и количества трансфицированных клеток:

 a) оценка жизнеспособности; b) оценка количества трансфицированных клеток

Fig. 1.  Evaluation of cell viability and the number of transfected cells: a) viability analysis; b) assessment of GFP-positive cells

Примечание: A – количество ДНК уменьшено в 4 раза, B – количество ДНК уменьшено в 2 раза, C – количество ДНК увеличено в 2 раза, D – количество ДНК увеличено в 4 раза, E (контроль) –  референсный протокол, F – объем реакционной смеси уменьшен в 2 раза, G – объем реакционной смеси уменьшен в 4 раза, H – объем реакционной смеси уменьшен в 8 раз.

Note: A – the amount of DNA was reduced four-fold, B – the amount of DNA was reduced two-fold, C – the amount of DNA was increased two-fold, D – the amount of DNA was increased four-fold, E (control) – reference protocol, F – the volume of reaction mix was reduced two-fold, G – the volume of reaction mix was reduced four-fold, H – the volume of reaction mix was reduced eight-fold.

Источник: рисунок составлен авторами.

Source: the figure is prepared by the authors.

 

Микрофотографии трансфицированных HEK 293T GFP-белком в различных вариациях представлены на рисунке 2.

 

 

Рис. 2.  Микрофотографии клеточной линии HEK 293T с GFP-белком

Fig. 2.   Сell line HEK 293T expressing GFP

Источник: фото были получены на системе флуоресцентной визуализации ZOE Fluorescence Cell Imager (Bio-Rad, США), шкала – 100 мкм.

Source: images were acquired by using ZOE Fluorescent Cell Imaging System (Bio-Rad, USA), scale bar – 100 µm.

 

Проведенный скрининг параметров кальций-фосфатной трансфекции выявил четкую зависимость ее эффективности от количества вносимой ДНК и объема реакционной смеси. Ранжирование эффективности вариантов (C > D > E > B > A > F > G > H) позволяет сделать следующие выводы о ключевых факторах, определяющих успешность метода. Оптимизация количества ДНК: существует оптимальный избыток. Наибольшая эффективность трансфекции при использовании удвоенной (вариант C: 80 мкг) и учетверенной (вариант D: 160 мкг) дозы ДНК по сравнению с референсным протоколом (40 мкг) указывает на то, что исходное количество вектора являлось субоптимальным для используемой клеточной линии HEK 293T и условий проведения эксперимента. Подобную закономерность наблюдали китайские ученые в своей работе: при увеличении концентрации ДНК эффективность трансфекции в ДНК-кальций-фосфатных комплексах увеличивалась [11]. Однако стоит отметить, что это не приводит к пропорциональному увеличению эффективности трансфекции, а наоборот, ингибирует процесс образования преципитата, приводя к уменьшению количества ДНК, которая будет ассоциирована с ним [19]. Вариант C (2x ДНК), вероятно, представляет собой золотую середину. Увеличение количества ДНК приводит к формированию большего числа эффективных ДНК-кальций-фосфатных комплексов, при этом их концентрация не достигает критически токсичного уровня, а размер частиц остается в оптимальном для эндоцитоза диапазоне. Вариант D (4x ДНК): хотя эффективность высока, она ниже, чем в варианте C. Это может быть связано с начинающейся агрегацией комплексов в более крупные, менее эффективно поглощаемые частицы, а также с возрастающей цитотоксичностью, вызванной механическим стрессом при поглощении большого количества преципитата и/или чрезмерно высокой экспрессией трансфицированных генов. Снижение эффективности при уменьшении количества ДНК (варианты B, A) закономерно и связано с недостаточностью количества генетического материала для формирования критической массы трансфицирующих частиц на клетку, а также с тем, что в процессе внутриклеточной транслокации к ядру эти комплексы уязвимы к деградации, что дополнительно снижает эффективность [20].

Объем реакционной смеси является значимой составляющей трансфекции. Резкое падение эффективности трансфекции при уменьшении объема реакционной смеси (F, G, H) при сохранении постоянного количества ДНК (40 мкг) является ключевым наблюдением. Оно демонстрирует, что решающим фактором является концентрация ДНК в формирующемся преципитате, а не абсолютное количество вектора. Уменьшение объема смеси при том же количестве ДНК приводит к повышению концентрации кальций-фосфатных комплексов. Высокая концентрация провоцирует образование крупных, агрегированных частиц (варианты F, G, H). Такие частицы неэффективно захватываются клетками, физически повреждают монослой и демонстрируют низкую эффективность доставки ДНК в ядро. Референсный объем (1 мл, вариант E) обеспечивает формирование частиц оптимального размера. Увеличение же объема смеси сверх этого может привести к чрезмерному разбавлению и формированию слишком мелких, нестабильных частиц.

 

ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, после проведения серии экспериментов доказано, что эффективность кальций-фосфатной трансфекции не является линейной функцией от количества ДНК. Она определяется балансом между концентрацией ДНК в реакционной смеси и итоговым размером формирующихся частиц. Оптимальная эффективность достигается при умеренном избытке ДНК (80 мкг на чашку), который компенсирует возможные потери на этапах формирования и доставки комплекса. При этом необходимо строго придерживаться использования стандартного объема реакционной смеси (1 мл), гарантирующего формирование частиц наноразмерного диапазона, пригодных для эффективного эндоцитоза. Данная модификация протокола позволяет достичь эффективности, сопоставимой с коммерческими реагентами или превосходящей их, подчеркивая важность точной калибровки метода для каждой конкретной экспериментальной системы.

 

1 Гринев В.В., Посредник Д.В., Северин И.Н., Потапнев М.П. Генетическая модификация клеток человека с помощью лентивирусной трансдукции in vitro и ex vivo : метод. пособие для студентов, магистрантов и аспирантов биол. фак. Минск: БГУ; 2010. 82 с. URL: https://elib.bsu.by/handle/123456789/1629 (дата обращения 28.08.2025).

2 Гринев В.В., Посредник Д.В., Северин И.Н., Потапнев М.П. Генетическая модификация клеток человека с помощью лентивирусной трансдукции in vitro и ex vivo : метод. пособие для студентов, магистрантов и аспирантов биол. фак.

 

×

About the authors

Amina M. M. Al-Khadj Aioub

National Research Mordovia State University

Email: amina.aioub1@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2793-6760
SPIN-code: 8593-2867
Scopus Author ID: 58245472500

Research Associate, Laboratory of Cellular Technologies, Federal Center for Biotechnology and Medicine Advancement

68 Bolshevistskaya St, Saransk 430005, Russian Federation

Ekaterina P. Brodovskaya

National Research Mordovia State University

Author for correspondence.
Email: ekbrodovskaya@gmail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1060-9843
SPIN-code: 6936-6908
Scopus Author ID: 2057193339958

Cand.Sci. (Med.), Head of the Laboratory of Cellular Technologies, Federal Center for Biotechnology and Medicine Advancement

68 Bolshevistskaya St, Saransk 430005, Russian Federation

Dmitry O. Semikov

National Research Mordovia State University

Email: dimaj.semikov@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0000-7001-6954
SPIN-code: 3150-2198

Research Assistant, Laboratory of Preclinical and Clinical Trials of Targeted Forms of Pharmaceuticals, Federal Center for Biotechnology and Medicine Advancement

68 Bolshevistskaya St, Saransk 430005, Russian Federation

Nikolay A. Pyataev

National Research Mordovia State University

Email: pyataevna@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9688-7640
SPIN-code: 1140-6906
Scopus Author ID: 22958327300

Dr.Sci. (Med.), Associate Professor, Director of the Federal Center for Biotechnology and Medicine Advancement

68 Bolshevistskaya St, Saransk 430005, Russian Federation

References

  1. Kim T.K., Eberwine J.H. Mammalian Cell Transfection: The Present and the Future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2010;397(8):3173–3178. https://doi.org/10.1007/s00216-010-3821-6
  2. Shi B., Xue M., Wang Y., Wang Y., Li D., Zhao X., et al. An Improved Method for Increasing the Efficiency of Gene Transfection and Transduction. International Journal of Physiology, Pathophysiology and Pharmacology. 2018;10(2):95–104. URL: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC5943608 (accessed: 23.08.2025).
  3. Fus-Kujawa A., Prus P., Bajdak-Rusinek K., Teper P., Gawron K., Kowalczuk A., et al. An Overview of Methods and Tools for Transfection of Eukaryotic Cells in vitro. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2021;9:e701031. https://doi.org/10.3389/fbioe.2021.701031
  4. Pavlov R.V., Akimov S.A., Dashinimaev E.B., Bashkirov P.V. Boosting Lipofection Efficiency through Enhanced Membrane Fusion Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 2024;25(24):13540. https://doi.org/10.3390/ijms252413540
  5. Guo H., Hao R., Wei Y., Sun D., Sun S., Zhang Z. Optimization of Electrotransfection Conditions of Mammalian Cells with Different Biological Features. The Journal of Membrane Biology. 2012;245(12):789–795. https://doi.org/10.1007/s00232-012-9480-0
  6. O’Brien J., Lummis S. Nano-Biolistics: A Method of Biolistic Transfection of Cells and Tissues Using a Gene Gun with Novel Nanometer-Sized Projectiles. BMC Biotechnology. 2011;11(66):1–6. https://doi.org/10.1186/1472-6750-11-66
  7. Chong Z.X., Yeap S.K., Ho W.Y. Transfection Types, Methods and Strategies: A Technical Review. PeerJ. 2021;9:e11165. https://doi.org/10.7717/peerj.11165
  8. Arunachalam K., Sreeja P.S. Transfection in HEK293 Cells. In: Advanced Cell and Molecular Techniques. Springer Protocols Handbooks. New York: Humana; 2025. P. 325–329. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-4518-5_54
  9. Jamour P., Jamali A., Langeroudi A.G., Sharafabad B.E., Abdoli A. Comparing Chemical Transfection, Electroporation, and Lentiviral Vector Transduction to Achieve Optimal Transfection Conditions in the Vero Cell Line. BMC Molecular and Cell Biology. 2024;25(15):1–12. https://doi.org/10.1186/s12860-024-00511-x
  10. Kachkin D.V., Khorolskaya J.I., Ivanova J.S., Rubel A.A. An Efficient Method for Isolation of Plasmid DNA for Transfection of Mammalian Cell Cultures. Methods and Protocols. 2020;3(4):69–77. https://doi.org/10.3390/mps3040069
  11. Guo L., Wang L., Yang R., Feng R., Li Z., Zhou X., et al. Optimizing Conditions for Calcium Phosphate Mediated Transient Transfection. Saudi Journal of Biological Sciences. 2017;24(3):622–629. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2017.01.034
  12. Pandey A.P., Sawant K.K. Polyethylenimine: A Versatile, Multifunctional Non-Viral Vector for Nucleic Acid Delivery. Materials Science and Engineering. C, Materials for Biological Applications. 2016;68:904–918. https://doi.org/10.1016/j.msec.2016.07.066
  13. Boussif O., Lezoualc’h F., Zanta M.A., Mergny M.D., Scherman D., Demeneix B., et al. A Versatile Vector for Gene and Oligonucleotide Transfer into Cells in Culture and in vivo: Polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1995;92(16):7297–7301. https://doi.org/10.1073/pnas.92.16.7297
  14. Mostaghaci B., Loretz B., Lehr C.M. Calcium Phosphate System for Gene Delivery: Historical Background and Emerging Opportunities. Current Pharmaceutical Design. 2016;22(11):1529–1533. https://doi.org/10.2174/1381612822666151210123859
  15. Chernousova S., Epple M. Live-Cell Imaging to Compare the Transfection and Gene Silencing Efficiency of Calcium Phosphate Nanoparticles and a Liposomal Transfection Agent. Gene Therapy. 2017;24(5):282–289. https://doi.org/10.1038/gt.2017.13
  16. Sun M., Bernard L.P., Dibona V.L., Wu Q., Zhang H. Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. 2013;(81):e50808. https://doi.org/10.3791/50808
  17. Goetze B., Grunewald B., Baldassa S., Kiebler M. Chemically Controlled Formation of a DNA / Calcium Phosphate Coprecipitate: Application for Transfection of Mature Hippocampal Neurons. Journal of Neurobiology. 2004;60(4):517–525. https://doi.org/10.1002/neu.20073
  18. Arunachalam K., Sreeja P.S. Generation of Competent Bacteria. In: Advanced Cell and Molecular Techniques. Springer Protocols Handbooks. New York: Humana; 2025. P. 309–312. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-4518-5_51
  19. Jordan M., Schallhorn A., Wurm F.M. Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation. Nucleic Acids Research. 1996;24(4):596–601. https://doi.org/10.1093/nar/24.4.596
  20. Liu X., Wang Q., Shi Y., Zhan L., Xu L., Hui J., et al. Silica-Calcium Phosphate Nanoparticles Delivering Recombinant Influenza Hemagglutinin DNA Can Induce Long-Lasting T Cell Immune Cross-Protection in Mice. Frontiers in Immunology. 2025;16:e1572618. https://doi.org/10.3389/fimmu.2025.1572618

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. F i g. 1. Evaluation of cell viability and the number of transfected cells: a) viability analysis; b) assessment of GFP-positive cells

Download (2MB)
Indexing metadata
3. F i g. 2. Сell line HEK 293T expressing GFP

Download (674KB)
Indexing metadata

Note


Copyright (c) 2026 Al-Khadj Aioub A.M., Brodovskaya E.P., Semikov D.O., Pyataev N.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

✱ All the metadata of this work are dedicated to being read, copied, modified, distributed, and used for any purpose (even commercial), without asking permission.


We use cookies and Yandex.Metrica to improve the Site and for good user experience. By continuing to use this Site, you confirm that you have been informed about this and agree to our personal data processing rules.