The Reparative dna Polymerase eta (Polη) Plays a key Role in Mutagenesis at Low Doses of uv Radiation in Yeast Saccharomyces cerevisiae

Full Text

Клетка в ответ на повреждения ДНК использует сеть сигнальных переносчиков, возникающих при прохождении клеточного цикла (чекпойнт) и в течение репарационного процесса [1]. Согласно с этими сигналами чекпойнт формирует ответ клетки на повреждения ДНК [2]. Хотя хорошо известно, что чекпойнт имеет решающее значение для поддержания целостности генома, но как клетка балансирует между остановкой клеточного цикла и клеточной пролиферацией в условиях постоянных эндогенных и экзогенных источников повреждения ДНК остается загадкой. Например, для устранения небольших количеств повреждений ДНК (таких как спонтанные повреждения оснований) используются эксцизионная репарация и процесс толерантности к повреждениям ДНК. При этом существенной задержки клеточного цикла не происходит. Однако при ответе на более высокие уровни повреждений ДНК эти процессы становятся тесно интегрированными с задержкой клеточного цикла (глобальный чекпойнт) [1]. Для генотоксических агентов существует порог дозы, ниже которого активация чекпойнта минимальна, несмотря на низкую активность путей репарации ДНК. Этот порог может варьировать в зависимости от повреждающего агента, организма и типа клеток.

Доминирующую роль в толерантности к повреждениям ДНК играет безошибочная ветвь пострепликативной репарации (ПРР), которую часто называют рекомбинационной, так как оба типа репарации имеют общую стадию образования D-петли. Наибольший прогресс в изучении связи между мутагенезом, репарацией, динамикой хроматина и клеточным циклом достигнут на модельном одноклеточном эукариотическом организме – почкующихся дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Эксперименты с дрожжами показали, что безошибочные механизмы являются основными путями ПРР при любых репликативных стрессах [2–6]. Тем не менее в литературе есть примеры, когда ошибочный путь синтеза через повреждение (TLS) при малых количествах повреждений ДНК может быть также эффективным [1].

В дрожжах во время нормальной репликации ДНК канонический путь глобального чекпойнта, регулируемого киназами Mec1 и Rad53, не функционирует. Перед вступлением в S-фазу клетки не накапливают больших количеств дНТФ, а скорее входят в нее с субоптимальными уровнями дНТФ [7]. Невысокий уровень дезоксинуклеотидов при входе в S-фазу быстро истощается. При этом ДНК-полимеразы, вероятно, не способны эффективно использовать дНТФ в таких низких концентрациях и должны останавливаться и активировать путь, контролируемый Mec1 – Rad53. Активация синтеза дНТФ происходит в ответ на накопление многочисленных однонитевых брешей за остановленными вилками репликации. Временная активация Mec1-зависимого пути приводит к деградации репрессора Sml1 и активации экспрессии генов, кодирующих субъединицы комплекса рибонуклеотидредуктазы (RNR), и, как следствие, синтезу необходимых количеств дНТФ.

Изучение молекулярного механизма биологического действия сверхмалых количеств повреждений ДНК является актуальной задачей. Из литературы известно, что только мутанты с нарушением путей пострепликативной репарации проявляли какую-либо чувствительность к хроническому воздействию низких доз УФ-излучения [4, 8]. В настоящей работе мы показали, что при низких уровнях доз УФ-излучения решающую роль в мутагенезе играет высокая активность Polη, которая обходит подавляющее число повреждений ДНК, оказавшихся на пути репликативной машины. При этом частота УФ-индуцированного мутагенеза у мутанта rad30Δ зависит от уровня активации комплекса RNR. В отсутствие Polη ее роль в пострепликативной репарации выполняет склонная к ошибкам Polζ, которая создает ошибки в сайте повреждения и на неповрежденной нити в процессе репаративного синтеза ДНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы

Делеции генов получали путем ПЦР-опосредованного разрушения генов [9] с использованием специфических маркеров. Генотипы штаммов дрожжей, использованных в настоящем исследовании, представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Штаммы дрожжей, использованные в работе

Штамм	Генотип
LMG-3031	MATα ade2Δ-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1
4-EAA-3031	MATα ade2Δ-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 rad30Δ
TAE-152	MATα ade2∆-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 rad30Δ hsm3Δ
TAE-141	MATα ade2Δ-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 rad30Δ rad53+HA-F
TAE-142	MATα ade2Δ-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 rad30Δ sml1Δ
TAE-140	MATα ade2Δ-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 rad30Δ pms1Δ
5-EAA-3031	MATα ade2Δ-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 rad30Δ him1Δ
6-DVF-3031	MATα ade2Δ-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 sml1Δ
1-EAA-3031	MATα ade2Δ-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 him1Δ
10-DVF-3031	MATα ade2Δ-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 rad53+HA-F
9-DVF-3031	MATα ade2Δ-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 rad53+HA-F him1Δ
CAY-3	MAT a ade2∆-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 hif1Δ
5-LMG-3031	MATα ade2Δ-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 hsm3Δ
TAE-143	MATα ade2Δ-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 hif1Δ rad30Δ
2-IVF-312	MATα ade2Δ-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 pms1Δ

 

Получение штаммов

ПЦР-генерированный KanMX модуль был амплифицирован из плазмиды pFLA6A-kanMX6, полученной от В.Ф. Латыпова, с использованием праймеров: RAD30 DelL: 5’-ACTTGGAAGGAGTTGATTCAGCTTGGTTCCCCCAGTAAAGCATACGAGTCCTCCTTAGCATGTATCGCCCGCTTCGTACGCTGCAGGTCG-3’;

RAD30 DelR: 5’-CTTGTAAAAAATGATAAGATGTTTTTGGAAGATGTAACTTGTTTCTTCTGAGGTGTGGCAGTATGTTGTGGCATAGGCCACTAGTGGATC-3’.

10-DVF-3031, 6-DVF-3031, CAY-3 и 2-IVF-312 трансформировали фрагментом ДНК, содержащим маркер KanMX, с фланкирующими нуклеотидными последовательностями, гомологичными флангам гена RAD30. Трансформанты с делецией гена RAD30 отбирали по их устойчивости к канамицину (G418) с использованием полной среды, содержащей G418 в концентрации 200 мкг/мл. Разрушение гена RAD30 было подтверждено с помощью ПЦР. Таким образом получены двойные мутанты: TAE-141, TAE-142, TAE-143 и TAE-140 (табл. 1).

Питательные среды

Состав полной среды YPD для выращивания культур и учета выживаемости приведен в [9]. В качестве селективной среды для учета частоты УФ-индуцированных мутаций устойчивости к канаванину использовали минимальную среду, обогащенную полным набором аминокислот (за исключением аргинина) и азотистых оснований [10]. В зависимости от использованных штаммов концентрации канаванина достигали 100 мг/л.

Чувствительность к УФ-излучению

Тесты на выживаемость клеток проводили путем выращивания в течение ночи культуры соответствующего штамма в жидкой YPD при 30 °C. Клетки промывали и ресуспендировали в воде с плотностью 1 × 10⁷ клеток/мл. Суспензию клеток облучали УФ-лампой БУВ-30 (диапазон УФ-С) с мощностью дозы на верхнем уровне 1.4 Дж / м² × с. Аликвоты отбирали после различных доз облучения, разбавляли и помещали на чашки с YPD для определения количества выживших.

Мутационный тест

Мутационные тесты проводили путем выращивания в течение ночи клеток соответствующего штамма в жидкой YPD при 30 °C. Клетки промывали и ресуспендировали в воде с плотностью 1 × 10⁷ клеток/мл. Клетки облучали УФ-лампой БУВ-30. Аликвоты отбирали после различных доз облучения, разбавляли и помещали на чашки с YPD для определения количества выживших. Для определения частоты мутаций неразведенные аликвоты высевали на среду с канаванином.

ПЦР в реальном времени

Для проведения ПЦР в реальном времени была использована система детекции RT-PCR CFX96 (Bio-Rad, Великобритания). Реакции проводили в объеме 25 мкл, состоящем из 10 мкл 2.5-кратной реакционной смеси для ОТ-ПЦР в присутствии красителя SYBR Green I и эталонного красителя Rox (Syntol, Россия), 13.8 мкл воды, 1 мкл кДНК и 0.1 (2 мМ) соответствующих праймеров (праймеры для гена RNR3: For 5´-ACACCTTTCATGGTTTATAAG-3´ и Rev 5´-CGACGATTTCACAACATAA-3´; для гена ACT1: For 5´-GAAGGTCAAGATCATTGC-3 и Rev 5´- GTTGGAAGGTAGTCAAAG-3´).

Условия амплификации ПЦР были следующими: 1 цикл по 5 мин при 95°С, затем 39 циклов по 15 с при 95°С и 20 с при 52°С. Анализ кривой плавления показал 5-секундное увеличение на 1°C с 55 до 95°C.

Контрольные реакции с праймером и без матрицы реакционных смесей были включены. Два биологических и три технических повтора были выполнены для каждого образца. Результаты были обработаны с использованием программы CFX Manager.

Статистический анализ

Экспериментальные данные представлены как среднее по крайней мере по трем повторностям со стандартной ошибкой среднего (SEM), а статистические различия определялись с помощью t-критерия Стьюдента. Значимость определяли на уровне р < 0,05 [11].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Как отмечалось выше, путь TLS может эффективно использоваться при низких уровнях повреждений ДНК. Это подтверждается данными работы [12], из которой видно, что мутация rad30Δ десятикратно повышает репаративный спонтанный мутагенез. Одним из основных участников TLS-пути является Polη, кодируемая геном RAD30. На неповрежденной матрице Polη создает мутации со скоростью 10⁻² − 10⁻³, в то же время она способна обходить УФ-индуцированные cis-syn циклобутановые димеры с высокой точностью [13–15]. Уровень УФ-индуцированного мутагенеза у мутанта rad30Δ зависит в значительной степени от дозы облучения. При высоких уровнях УФ-доз (выше 40 Дж/м²) выживаемость мутанта rad30Δ практически не отличалась от выживаемости штамма дикого типа, частота индуцированного мутагенеза также не отличалась или даже была ниже, чем у клеток дикого типа [12]. При снижении дозы уровень мутагенеза начинает превышать уровень дикого типа [16].

УФ-индуцированный мутагенез у мутанта rad30Δ при низких дозах облучения

Показано, что УФ-облучение клеток дрожжей, находящихся в различных стадиях клеточного цикла, влияет на количество молекул Polη в большей степени, когда клетки облучались в начале S-фазы, чем в G₁- или в G₂-фазе. В S-фазе отмечены два противоположных эффекта. С одной стороны, с увеличением дозы УФ в начале этой фазы значительно задерживалось движение по циклу, как результат, происходило накопление Polη. С другой стороны, степень накопления полимеразы была обратно пропорциональна дозе УФ-лучей, так что при дозе 10 Дж/м² концентрация Polη была значительно больше, чем при 80 Дж/м² [17]. Возникает вопрос, зачем клетки после УФ-облучения накапливают большое количество полимеразы Polη в самом начале S-фазы? Для разрешения этого вопроса мы изучили УФ-индуцированный мутагенез у мутанта rad30Δ при низких дозах облучения в сравнении с клетками дикого типа. Мутант rad30Δ показал высокую чувствительность к мутагенному действию низких доз УФ-излучения. При дозе 7 Дж/м² частота мутагенеза у мутанта rad30Δ была примерно в 3 раза выше, чем у клеток штамма дикого типа (рис. 1). Таким образом, можно предположить, что высокая концентрация Polη в начале S-фазы необходима для эффективного и точного обхода относительно небольшого числа повреждений ДНК, которые остаются после репарационного процесса и попадают в вилки репликации, что может обеспечить нормальную скорость репликативного процесса.

 

Рис. 1. Чувствительность к УФ-свету и частота УФ-индуцированного мутагенеза в локусе CAN1 у штамма дикого типа и мутантных штаммов rad30Δ, pms1Δ и pms1Δ rad30Δ при обработке дозами 7, 14 и 21 Дж/м² ультрафиолетового излучения. На графиках показаны стандартные ошибки среднего значения (± SEM), полученные в результате пяти независимых экспериментов.

 

В клетках мутанта rad30Δ TLS происходит при участии Polζ [16]. Отсюда следует, что причиной rad30Δ-опосредованного УФ-индуцированного мутагенеза является замена Polδ на ошибочную Polζ при синтезе ДНК в репаративных брешах. Эта полимераза обладает высокой процессивностью и способна заполнить репаративную брешь. При этом она будет создавать мутации в сайте повреждения и из-за отсутствия у нее редакторской функции делать ошибки при репаративном синтезе неповрежденной ДНК. Последние являются субстратом для репарации ошибочно спаренных оснований (мисматч-репарация). Чтобы проверить это предположение, мы удалили ген PMS1, который является одним из ключевых участников мисматч-репарации, у мутанта rad30Δ. Одиночный мутант rad30Δ при низких уровнях доз УФ-излучения показал значимую чувствительность, в то время как одиночный pms1Δ не отличался от штамма дикого типа (рис. 1). Двойной мутант pms1Δ rad30Δ не отличался по этому показателю от штамма дикого типа и одиночного pms1Δ. Этот результат показывает, что УФ-чувствительность одиночного мутанта rad30Δ связана с работой мисматч-репарации. В двойном мутанте pms1Δ rad30Δ уровень индуцированного мутагенеза при низких дозах УФ был в 2 раза выше, чем у одиночного мутанта rad30Δ (рис. 1). На основании полученных результатов можно сделать вывод, что в отсутствие Polη в клетках дрожжей ее роль в пострепликативной репарации выполняет ошибочная Polζ, которая создает мутации в сайте повреждения и на неповрежденной нити в процессе репаративного синтеза ДНК. Репаративный синтез может происходить, когда Polζ обходит повреждение и продолжает синтез до заполнения бреши. При этом процесс обхода повреждения будет осуществлен без участия рекомбинационной ветви пострепликативной репарации. Второй путь обхода повреждения по механизму безошибочной ветви пострепликативной репарации может осуществляться при участии Polζ для заполнения участка бреши, образовавшегося при преждевременной терминации D-петли [11].

УФ-индуцированный мутагенез у мутанта him1Δ при низких дозах облучения

Ранее мы показывали, что гены, контролирующие репаративную сборку хроматина, задействованы в контроле локального чекпойнта через подавление экспрессии генов комплекса RNR [11, 18]. В связи с этим мы провели эпистатический анализ взаимодействия мутации rad30Δ с мутациями в генах, контролирующих репаративную сборку хроматина. Предполагается, что белок Him1 в клетках дрожжей выполняет функцию гистонового шаперона при репаративной сборке хроматина [18]. Мутация him1Δ имеет фенотип, подобный мутации hsm3Δ, но супрессирует УФ-индуцированную активность рибонуклеотидредуктазного комплекса RNR более эффективно, чем hsm3Δ [19]. Одиночный мутант him1Δ показал слабую чувствительность к летальному действию УФ по сравнению со штаммом дикого типа (рис. 2), как и при высоких дозах.

 

Рис. 2. Чувствительность к УФ-свету и частота УФ-индуцированного мутагенеза в локусе CAN1 у штамма дикого типа и мутантных штаммов rad30Δ, him1Δ и him1Δ rad30Δ при обработке дозами 7, 14 и 21 Дж/м² ультрафиолетового излучения. На графиках показаны стандартные ошибки среднего значения (± SEM), полученные в результате пяти независимых экспериментов.

 

Однако уровень индуцированного мутагенеза при всех использованных дозах у мутанта him1Δ был ниже, чем у штамма дикого типа, что кардинально отличается от этого показателя при высоких дозах УФ-излучения [19]. Этот результат можно объяснить тем, что у одиночного мутанта him1Δ после работы Polη остается мало повреждений ДНК, что снижает до минимума активацию киназы Rad53. При этом будет понижена роль рекомбинационной ветви репарации и, как следствие, понижен him1Δ -специфический мутагенез. У двойного мутанта him1Δ rad30Δ при низких дозах УФ мутация him1Δ подавляла чувствительность мутанта rad30Δ так, что двойной мутант не отличался по выживаемости от штамма дикого типа (рис. 2). В отношении УФ-индуцированного мутагенеза двойной мутант характеризовался слабо выраженным понижением уровня частоты мутагенеза, по сравнению с одиночным мутантом him1Δ и полной супрессией rad30Δ-специфического мутагенеза (рис. 2). Понижение частоты мутагенеза в двойном мутанте по сравнению с одиночным мутантом происходит вследствие увеличения количества выживших клеток при одинаковой дозе у двойного мутанта. Для подтверждения этого предположения мы провели эксперимент по измерению экспрессии гена RNR3 при низкой дозе УФ-лучей в мутанте him1Δ и штамме дикого типа. Из рис. 3 видно, что уровень экспрессии в обоих штаммах практически не отличался, что подтверждает наше предположение.

 

Рис. 3. Относительная нормализованная экспрессия гена RNR3 в штамме дикого типа и мутантных штаммах him1Δ и hif1Δ до и после облучения их ультрафиолетовым светом (после УФ-облучения клетки выдерживали в течение четырех часов при 30 °C в термостате для индукции), доза УФ-излучения составляла 14 Дж/м²; * р < 0,05, t-критерий Стьюдента.

 

Суммируя полученные результаты, можно заключить, что мутация him1Δ супрессирует УФ-чувствительность и резко подавляет УФ-индуцированный мутагенез мутанта rad30Δ. Таким образом, частота УФ-индуцированного мутагенеза у мутанта rad30Δ зависит от уровня активации комплекса RNR.

УФ-индуцированный мутагенез у мутантов по генам комплекса NuB4 при низких дозах УФ-излучения

Мутации hsm3Δ и hif1Δ инактивируют обе субъединицы ацетилазного комплекса NuB4, выполняющего функцию гистонового шаперона при репаративной сборке хроматина, и частично супрессируют УФ-индуцированную активность RNR. Белки, кодируемые этими генами, как и белок Him1, функционируют в контроле рекомбинационной ветви пострепликативной репарации [12, 18]. На рис. 4 приведены кривые зависимости выживаемости от дозы УФ-лучей для одиночных hsm3Δ, rad30Δ и двойного hsm3Δ rad30Δ мутантов.

 

Рис. 4. Чувствительность к УФ-свету и частота УФ-индуцированного мутагенеза в локусе CAN1 у штамма дикого типа и мутантных штаммов rad30Δ, hsm3Δ, hif1Δ, hsm3Δ rad30Δ и hif1Δ rad30Δ при обработке дозами 7, 14 и 21 Дж/м² ультрафиолетового излучения. На графиках показаны стандартные ошибки среднего значения (± SEM), полученные в результате пяти независимых экспериментов.

 

На рис. 4 можно видеть, что мутация hsm3Δ, возможно, имеет слабый супрессорный эффект на выживаемость мутанта rad30Δ. Мутация hsm3Δ при низких дозах УФ не влияет на мутагенез и полностью подавляет rad30Δ-специфический мутагенез. Как и в случае с мутантом him1Δ, в одиночном мутанте hsm3Δ после работы Polη будет снижена активация киназы Rad53, но в меньшей степени, чем у мутанта him1Δ. При этом мутация hsm3Δ супрессирует rad30Δ-специфический мутагенез до уровня штамма дикого типа.

Одиночный мутант hif1Δ при низких дозах УФ оказался немного чувствительнее штамма дикого типа и более устойчивым, чем мутант rad30Δ (рис. 4). У двойного мутанта мутация hif1Δ эпистатировала к мутации rad30Δ. Одиночный мутант hif1Δ показал уровень УФ-индуцированного мутагенеза, сравнимый с уровнем дикого типа. Уровень УФ-мутагенеза в штамме hif1Δ rad30Δ значимо не отличается от одиночного мутанта rad30Δ и значительно превышает уровень мутагенеза в штамме дикого типа. Это свидетельствует о том, что мутация hif1Δ в меньшей степени, чем hsm3Δ, супрессирует активность киназы Rad53, что подтверждается данными измерения экспрессии гена RNR3 в одиночном мутанте hif1Δ (рис. 3). В то же время при высоких дозах УФ-облучения, когда глобальный чекпойнт полностью активирован, уровень УФ-индуцированного мутагенеза у мутантов him1Δ, hsm3Δ и hif1Δ более выраженно превышает уровень штамма дикого типа [12]. Эти результаты подтверждают высказанное выше заключение, что частота УФ-индуцированного мутагенеза в мутанте rad30Δ зависит от уровня активации комплекса RNR.

УФ-индуцированный мутагенез у мутантов по генам, отвечающим за пул дНТФ в клетке, при низких дозах УФ-излучения

Для проверки этого заключения мы разрушили у мутанта rad30Δ ген SML1, который кодирует супрессор каталитической субъединицы Rnr1 комплекса RNR [20, 21]. Мутация sml1Δ увеличивает в клетке пул дНТФ в 2–2.5 раза. Одиночный мутант sml1Δ не отличался от штамма дикого типа ни по УФ-чувствительности, ни по уровню УФ-индуцированного мутагенеза (рис. 5). В двойном мутанте мутация sml1Δ супрессировала УФ-чувствительность и rad30Δ-специфический мутагенез до уровня штамма дикого типа.

 

Рис. 5. Чувствительность к УФ-свету и частота УФ-индуцированного мутагенеза в локусе CAN1 у штамма дикого типа и мутантных штаммов rad30Δ, sml1Δ, rad53 + HA-F, sml1Δ rad30Δ и rad53 + HA-F rad30Δ при обработке дозами 7, 14 и 21 Дж/м² ультрафиолетового излучения. На графиках показаны стандартные ошибки среднего значения (± SEM), полученные в результате пяти независимых экспериментов.

 

Мутация rad53 + HA-F блокирует увеличение экспрессии гена RNR3, кодирующего субъединицу комплекса RNR при нормальных условиях роста и после облучения высокими дозами УФ-лучей [12]. Мы использовали эту мутацию для подтверждения высказанного выше утверждения о зависимости частоты УФ-индуцированного мутагенеза у мутанта rad30Δ от степени активации комплекса RNR. Был сконструирован двойной мутант rad30Δ rad53 + HA-F и изучена эффективность низких доз УФ в индукции мутагенеза у двойного мутанта. На рис. 5 представлен полученный результат, из которого следует, что мутация rad53 + HA-F эпистатирует к мутации rad30Δ, снижая уровень мутагенеза у двойного мутанта до уровня одиночного мутанта rad53 + HA-F. Этот результат согласуется с высказанным выше выводом о том, что частота УФ-индуцированного мутагенеза у мутанта rad30Δ зависит от уровня активации экспрессии генов комплекса RNR, которая, в свою очередь, зависит от активности киназы Rad53.

Ген HAT1 кодирует каталитическую субъединицу комплекса NuB4. Мутация hat1Δ инактивирует функцию NuB4, но в отличие от вспомогательных субъединиц практически не влияет на частоту УФ-индуцированного мутагенеза при высоких дозах облучения и приводит к гиперактивации генов комплекса RNR даже в нормальных условиях роста [11].

 

Рис. 6. Чувствительность к УФ-свету и частота УФ-индуцированного мутагенеза в локусе CAN1 у штамма дикого типа и мутантного штамма hat1Δ при обработке дозами 7, 14 и 21 Дж/м² ультрафиолетового излучения. На графиках показаны стандартные ошибки среднего значения (± SEM), полученные в результате пяти независимых экспериментов.

 

При низких дозах УФ-облучения зависимость частоты мутаций от дозы была такая же, как при высоких уровнях доз (рис. 6). Этот результат неудивителен, так как гиперактивация генов комплекса RNR ограничивает уровень УФ-индуцированного мутагенеза. Суммируя полученные данные, можно заключить, что при низких и высоких дозах УФ-лучей дозовая зависимость мутагенеза у изученных мутантов по генам, контролирующим репаративную сборку хроматина, контролируется уровнем экспрессии генов комплекса RNR.

ОБСУЖДЕНИЕ

Считается, что Polη является первым из ферментов, осуществляющих TLS. Она быстро привлекается к остановленным репликативным вилкам и отвечает за безошибочный обход 8-оксогуаниновых повреждений ДНК и УФ-индуцированных пиримидиновых димеров [13, 22]. Мотив PIP1 Polη связывается с убиквитин-конъюгирующим комплексом Rad6–Rad18, необходимым для TLS, что способствует локализации Polη в очагах повреждения ДНК in vivo [23]. Предполагается, что Polη уже находится в комплексе, когда происходит реакция переноса убиквитина [24]. Эти наблюдения подтверждают модель, в которой Polη может быть задействована в остановленной вилке репликации, когда комплекс Rad6–Rad18–Polη связывается с PCNA [25].

Мутация rad30Δ приводит к тому, что после УФ-облучения низкими дозами клеток этого мутанта, остановленных на повреждениях вилок репликации остается кратно больше по сравнению с клетками дикого типа. Вследствие этого происходит резкое увеличение количества однонитевой ДНК в репарационных брешах. Однонитевая ДНК, покрытая белком Rpa, служит сигналом для активации киназы Rad53. В результате у мутанта rad30Δ произойдет избыточная активация киназы и увеличение концентрации дНТФ по сравнению с клетками дикого типа при одинаковой дозе УФ-лучей. Это увеличение и создает предпосылки для rad30Δ-специфического мутагенеза. Согласно результатам наших предыдущих работ [11, 18], условия для специфического повышенного мутагенеза возникают, когда активность киназы Rad53 снижается с максимальных значений или повышается с минимальных до промежуточного уровня.

Мутанты дрожжей по генам, кодирующим белки, участвующие в репаративной сборке хроматина, показали высокие уровни спонтанного репаративного мутагенеза, что может свидетельствовать о том, что эти гены могут играть позитивную роль в регуляции локального чекпойнта [12, 18]. Это предположение было подтверждено в экспериментах по изучению УФ-индуцированного мутагенеза у двойных мутантов him1 Δrad2Δ, hif1Δ rad2Δ, hsm3Δ rad2Δ и hat1Δ rad2Δ. Мутанты дрожжей с заблокированной эксцизионной репарацией нуклеотидов очень чувствительны к низким дозам УФ-излучения, которые не индуцируют глобальный чекпойнт. Для всех двойных мутантов мы наблюдали синергическое увеличение частоты индуцированных мутаций, хотя у последнего мутанта это увеличение было в пределах доверительного интервала только при минимальной дозе УФ [11, 12, 26]. Из этих экспериментов следует, что все использованные мутации ответственны за высокий уровень мутагенеза при низких дозах УФ-лучей.

Ранее мы показали, что индуцированный мутагенез у мутанта rad30Δ при высоких дозах УФ не отличается от штамма дикого типа, а при очень высоких дозах даже ниже, чем в диком типе [19]. Эти данные противоречили результатам, полученным в работе S. G. Kozmin и соавт. [16], в которой мутант rad30Δ показал уровень УФ-индуцированного мутагенеза выше, чем у клеток дикого типа. В настоящей работе мы разрешили это противоречие. Оказалось, что при низких дозах УФ уровень мутагенеза у штамма rad30Δ действительно значительно выше по сравнению со штаммом дикого типа (рис. 1). Авторы работы [16] объясняют высокий уровень мутагенеза при низких дозах УФ заменой Polη на Polζ, которая делает частые ошибки на повреждениях, которые в норме безошибочно обходятся Polη. Однако эксперименты с блокированием мисматч-репарации у мутанта rad30Δ ставят под сомнение это утверждение. После обхода повреждения с ошибочным либо безошибочным встраиванием нуклеотидов образуется структура, которая является субстратом для нуклеотид-эксцизионной, но не мисматч-репарации. В то же время мы наблюдаем уровень УФ-индуцированного мутагенеза в двойном мутанте rad30Δ pms1Δ в 2 раза выше, чем у одиночного мутанта rad30Δ (рис. 1). Этот результат можно объяснить, если субстраты для мисматч репарации возникают в результате ошибок Polζ в ходе репарационного синтеза на неповрежденной матрице. Это предположение вполне допустимо, так как Polζ лишена редакторской функции, что снижает точность синтеза ДНК на два порядка по сравнению с репликативными полимеразами. Polζ может осуществить репаративный синтез либо сразу после обхода повреждения, либо после преждевременной терминации D-петли в течение рекомбинационного обхода повреждения. Чтобы решить, какой из этих вариантов предпочтительней реализуется в клетке, мы осуществили ряд экспериментов. Если предпочтителен первый вариант, то уровень УФ-мутагенеза не должен заметно зависеть от уровня дНТФ в клетке, в то время как реализация второго варианта требует строго определенного повышения этого уровня [12]. Мы разрушили ген SML1 у мутанта rad30Δ, что привело к кратному повышению концентрации дНТФ и снижению уровня УФ-мутагенеза до уровня штамма дикого типа (рис. 5).

Этот результат свидетельствует в пользу второго варианта. В следующих экспериментах мы, наоборот, ограничили индукцию дНТФ, введя в клетки мутанта rad30Δ мутацию rad53+HA-F [12]. У мутанта rad53+HA-F rad30Δ уровень УФ-индуцированного мутагенеза также снизился до уровня штамма дикого типа (рис. 5). На основании полученных данных мы заключили, что rad30Δ-специфический мутагенез реализуется в течение рекомбинационной ветви пострепликативной репарации в результате заполнения репарационной бреши Polζ после преждевременной терминации D-петли, которое требует гипоактивации экспрессии генов комплекса RNR.

Комплекс RNR состоит из четырех субъединиц Rnr1, Rnr2, Rnr3 и Rnr4, которые кодируются генами RNR1, RNR2, RNR3 и RNR4 соответственно. Из этих генов нас больше всего интересовал RNR3, так как его экспрессия увеличивается в ответ на повреждения ДНК, в отличие от других генов данного комплекса, чья экспрессия не изменяется в ответ на повреждения ДНК. Поэтому мы рассматривали экспрессию гена RNR3 у наших мутантных штаммов как до, так и после облучения их УФ-светом.

Для подтверждения этого заключения мы разрушили у мутанта rad30Δ гены HSM3 и HIF1. Ранее мы показали, что делеции генов HSM3 и HIF1 приводят к частичному подавлению УФ-индуцированной экспрессии гена RNR3, кодирующего одну из каталитических субъединиц комплекса RNR, следствием чего было появление hsm3Δ- и hif1Δ-зависимого УФ-индуцированного мутагенеза. У двойного мутанта hsm3Δ hif1Δ происходило дальнейшее подавление экспрессии RNR3 и исчезновение повышенного УФ-индуцированного мутагенеза, характерного для одиночных мутантов [11]. Как можно видеть из рис. 4, УФ-индуцированный мутагенез у мутантов hsm3Δ rad30Δ и hif1Δ rad30Δ был ниже по сравнению с одиночным мутантом rad30Δ. Этот результат означает, что rad30Δ-специфический мутагенез действительно зависит от уровня экспрессии генов комплекса RNR. К такому же результату приводит разрушение гена HIM1 у мутанта rad30Δ (рис. 2).

При высоких дозах УФ-лучей уровень мутагенеза в одиночных мутантах him1Δ, hsm3Δ и hif1Δ кратно превышал уровень мутагенеза, характерного для штамма дикого типа. Однако при низких дозах УФ мутагенез у одиночных мутантов hsm3Δ и hif1Δ не имел значимых отличий от штамма дикого типа, а у мутанта him1Δ он был даже ниже этого уровня (рис. 2, 4). Это различие можно объяснить тем, что при низких дозах УФ-лучей активная работа нуклеотид-эксцизионной репарации оставляет нерепарированными относительно небольшое число повреждений, которые успешно обходятся Polη, в результате активация киназы Rad53 низкая, что приводит к низкой экспрессии генов комплекса RNR, а мутации him1Δ, hsm3Δ и hif1Δ дополнительно снижают уровень этой экспрессии.

В отличие от клеток дикого типа у мутанта rad30Δ остается значительно больше нерепарированных повреждений, которые будут увеличивать активность киназы Rad53. Эти повреждения будут субстратами пострепликативной репарации в G₂-фазе клеточного цикла.

Наши результаты показывают, что весь rad30Δ-специфический мутагенез происходит на рекомбинационной ветви репарации, так как он зависит от промежуточной активации киназы Rad53. Можно предположить, что Polδ вставляет напротив повреждения случайный нуклеотид и далее происходит перенос вновь синтезированной нити в сестринскую двунитевую ДНК с образованием D-петли. На конце внедрившейся нити образуется мисматч, который является субстратом исключительно Polζ, которая продолжит репаративный синтез в D-петле и после ее преждевременной терминации на материнской молекуле в бреши. Мисматч-репарация исправит ошибочно спаренные основания, возникшие из-за ошибок Polζ на неповрежденной матрице, но не затронет ошибку над повреждением.

Суммируя полученные данные, можно сделать вывод, что при низких уровнях доз УФ-излучения решающую роль играет высокая активность Polη, которая обходит подавляющее число оказавшихся на пути репликативной машины повреждений ДНК. Как в случае облучения высокими, так и низкими дозами УФ-лучей большую роль в индуцированном мутагенезе играет чекпойнт. Однако роли генов, участвующих в регуляции УФ-индуцированного мутагенеза, при низких и высоких дозах часто различаются. Например, инактивация гена RAD30 при низких дозах приводит к повышенному уровню индуцированного мутагенеза, а при высоких дозах практически не отличается от уровня штамма дикого типа. Инактивация генов HIM1, HSM3 и HIF1, наоборот, снижает высокий уровень мутагенеза, характерный для высоких доз, до уровня штамма дикого типа при низких дозах. Эти различия характеризуют локальный и глобальный чекпойнт.

 

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 23-24-00119.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

E. A. Alekseeva

Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of the National Research Centre “Kurchatov Institute”; Kurchatov Genome Center — Petersburg Nuclear Physics Institute

Author for correspondence.
Email: alekseeva_ea@pnpi.nrcki.ru
Russian Federation, Leningrad oblast, Gatchina, 188300; Leningrad oblast, Gatchina, 188300

T. A. Evstyukhina

Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of the National Research Centre “Kurchatov Institute”; Kurchatov Genome Center — Petersburg Nuclear Physics Institute

Email: alekseeva_ea@pnpi.nrcki.ru
Russian Federation, Leningrad oblast, Gatchina, 188300; Leningrad oblast, Gatchina, 188300

I. I. Skobeleva

Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of the National Research Centre “Kurchatov Institute”

Email: alekseeva_ea@pnpi.nrcki.ru
Russian Federation, Leningrad oblast, Gatchina, 188300

V. T. Peshekhonov

Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of the National Research Centre “Kurchatov Institute”; Kurchatov Genome Center — Petersburg Nuclear Physics Institute

Email: alekseeva_ea@pnpi.nrcki.ru
Russian Federation, Leningrad oblast, Gatchina, 188300; Leningrad oblast, Gatchina, 188300

V. G. Korolev

Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of the National Research Centre “Kurchatov Institute”; Kurchatov Genome Center — Petersburg Nuclear Physics Institute

Email: alekseeva_ea@pnpi.nrcki.ru
Russian Federation, Leningrad oblast, Gatchina, 188300; Leningrad oblast, Gatchina, 188300

References

Supplementary files