Cell membrane cholesterol and regulation of cellular processes: new and the same old thing

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Значительный прогресс в генной инженерии и биоинформатике в последние десятилетия продвинул биологическую науку в понимании молекулярной основы хранения, передачи и эволюции генетической информации, содержащейся в нуклеиновых кислотах. Эти знания, несомненно, очень важны, однако они не являются достаточными для понимания механизмов существования, функционирования и дифференцировки живых клеток, имеющих в пределах одного многоклеточного организма один и тот же геном. Работа белков – исполнителей генетических инструкций – зависит от их взаимодействия с другими молекулами, которые обеспечивают функционирование живой клетки, включая регуляцию активности белков. К таким молекулам, в частности, относятся мембранные липиды.

Биологические мембраны, которым посвящен наш журнал, окружают каждую живую клетку – как прокариотическую, так и эукариотическую – и одновременно обеспечивают диффузионный барьер и регуляцию входящих и выходящих потоков молекул через клеточную границу. Клеточные мембраны также играют решающую роль в модуляции межклеточных коммуникаций и участвуют в огромном количестве сложных клеточных процессов, таких как пролиферация, дифференциация, секреция, миграция, внутриклеточная сигнализация, эндо- и фагоцитоз и др. Биологические мембраны представляют собой гетерогенные, асимметричные бислои, состоящие в основном из липидов, разно- образие и организация которых играют важнейшую роль в поддержании структурной целостности, клеточного гомеостаза и функциональной активности клеток, и изменения в составе мембранных липидов сопровождаются изменениями активности сигнальных путей и регуляторных каскадов [1–5].

Основным компонентом (около 50% в молярном отношении) окружающих клетку плазматических мембран являются фосфолипиды, представляющие собой сложные эфиры многоатомных спиртов и высших жирных кислот. Важными фосфолипидами являются фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин, сфингомиелин и кардиолипин. Следующими за фосфолипидами по распространенности являются терпенопроизводные липоидов, стерины. В плазматической мембране позвоночных животных это холестерин, содержание которого составляет около 40%. Согласно классикам мембранологии Максфилду и ван Мееру [1], по своему значению холестерин является «центральным липидом клеток млекопитающих». Хотя в этом обзоре речь пойдет в основном о клеточных мембранах позвоночных, следует отметить, что в клетках беспозвоночных, растений и микроорганизмов также содержится либо холестерин, либо родственные ему стерины, например брассиностероиды, эргостерин, β-ситостерин, стигмастерин, гопаноиды [6–12]. Насекомые, хотя и не способны синтезировать стерины, без них не могут обойтись. Например, для дрозофил лишенная стеринов диета смертельна, для выживания достаточно стеринов, содержащихся в дрожжах; мутация гена, нарушающего холестериновый гомеостаз, снижает эффективность ольфакторного обучения (olfactory learning) у мутантных мушек w1118 [13]. Более того, многие патогенные микроорганизмы используют в своем жизненном цикле холестерин клетки-хозяина, что может быть одним из основных факторов патогенеза и клинических проявлений болезни ([14]; см. ниже).

Широко распространенное представление о холестерине как о «плохом» веществе, закупоривающем артерии и вызывающем сердечные заболевания, является ошибочным и несправедливым по отношению к этой во многом незаменимой молекуле. Для млекопитающих холестерин не только является жизненно важным компонентом клеточных мембран, без которого клетка не может функционировать, но и предшественником всех стероидных гормонов, желчных кислот и оксистеролов, которые сами по себе являются важными регуляторными молекулами во многих метаболических путях [15]. Борьбе с «высоким уровнем холестерина» обычно придается большое значение, в то время как разрушительные последствия дефицита холестерина, возникающего при различных метаболических, инфекционных и возраст-зависимых заболеваниях, могут быть недооценены. Активность многих белков зависит от холестерина, и нарушения в холестериновом гомеостазе на клеточном уровне и на уровне всего организма может быть важным фактором в патогенезе многих заболеваний, связанных с вирусными и бактериальными инфекциями, а также диабета II типа, сердечно-сосудистых нарушений, нейродегенеративных и возрастных заболеваний [14, 16]. Показательным примером в связи с этим являются работы, в которых было продемонстрировано, что при старении в синаптической фракции гиппокампальных нейронов у мышей происходит постепенная потеря холестерина, а также снижение синаптической пластичности, связанной с активацией глутаматных рецепторов [16, 17]. Доставка холестерина и повышение его содержания в мембране устраняло эти нарушения, а удаление холестерина из нейронов гиппокампа взрослых мышей имитировало нарушения, наблюдаемые у старых животных. Как предполагают авторы, изменения в липидном составе мембран нейронов в процессе старения могут являться причиной связанных с возрастом патологий мозга [16, 17].

Многие обширные обзоры посвящены холестерин-зависимым белкам и клеточным процессам (см., например, [18–24]). В данном обзоре роль «холестеринового» компонента клеточных мембран в функционировании клетки иллюстрируется на примерах некоторых холестерин-зависимых мембранных белков и соответствующих холестерин-зависимых клеточных процессов. Рассматривается участие холестерина и холестерин-зависимых процессов в патогенезе некоторых инфекционных и неинфекционных заболеваний; обсуждаются холестерин-связывающие мотивы в белках как возможный механизм белок-липидных взаимодействий. Главный вывод заключается в том, что без понимания механизмов холестерин-белковых взаимодействий и анализа роли холестерина в патогенезе некоторых заболеваний человека вряд ли возможно успешное лечение этих заболеваний. Эффективным направлением борьбы с холестерин-зависимыми патологиями может оказаться разработка новых лекарств, мишенью которых является белок-холестериновый интерфейс.

ХОЛЕСТЕРИН КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН

Холестерин в фосфолипидном бислое

Мембраны представляют собой асимметричные липидные бислои: в наружном листке плазматической мембраны преобладают незаряженные (цвиттер-ионные) фосфолипиды – фосфатидилхолин и сфингомиелин с небольшим количеством нейтральных и анионных гликосфинголипидов, а внутренний монослой сильно заряжен отрицательно из-за присутствия фосфатидилсерина, фосфатидной кислоты, фосфатидилинозита и его фосфорилированных производных. Как уже отмечалось, в эукариотических клетках второй по распространенности после фосфолипидов группой липидов являются стерины; у млекопитающих и большинства позвоночных это холестерин [1, 2, 4, 5, 20, 23–26]. Молекула холестерина содержит жесткую часть, состоящую из одного пятичленного и трех шестичленных колец, конформационно гибкую 8-углеродную цепь в положении С-17 и гидроксильную группу в положении 3β. Эта гидроксильная группа преимущественно располагается вблизи поверхности раздела липид–вода, а остальная часть молекулы холестерина находится между гидрофобными цепями липидов (рис. 1); хотя расположение молекул холестерина в плоскости между монослоями липидного бислоя также возможно [25, 26].

Рис. 1. Молекула холестерина (а) (PubChem CID5997) и его предполагаемое расположение в монослое мембранных фосфолипидов (б) и в бислойной липидной мембране, представляющей основу клеточной мембраны (в). На упрощенной схеме мембраны (в) липидный бислой содержит глицерофосфолипиды с ненасыщенными и насыщенными жирнокислотными остатками (нНФЛ и НФЛ соответственно), сфинголипиды и холестерин. В бислой встроены ассоциированные с мембраной цитоплазматические (ЦБ) и экстраклеточные (ЭБ) белки, а также трансмембранные белки (ТМБ). Бислой содержит липидные рафты (ЛР) – микродомены, обогащенные сфингомиелином и холестерином.

Внутри фосфолипидного бислоя распределение холестерина между липидными монослоями разнообразно и часто асимметрично, что может объясняться разным сродством холестерина к разным фосфолипидам. Наиболее сильное взаимодействие стеринов происходит со сфинголипидами (гликосфинголипидами и сфингомиелинами). Связи холестерина со сфингомиелином и фосфатидилхолином, обогащенными насыщенными цепями, способствуют его накоплению в наружном монослое. С другой стороны, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин могут обуславливать накопление холестерина во внутреннем (цитоплазматическом) липидном монослое. В целом, распределение холестерина зависит от фосфолипидов с анионными группами и насыщенными цепями. На это распределение и его стабильность также существенно влияют ненасыщенные жирные кислоты, повышенное содержание которых в биомембранах увеличивает вероятность перехода холестерина из одного монослоя в другой (флип-флопа ) [4]. Cогласно теоретическим расчетам, примерно 40% молекул холестерина плазматической мембраны находится в наружном монослое и 60% – во внутреннем [25–27].

Холестерин играет важную роль в определении физических свойств клеточных мембран млекопитающих [1–3, 5, 18, 19, 21, 23, 24, 28–31]. Заполняя промежутки между фосфолипидами в бислое мембраны, холестерин оказывает значительное влияние на такие параметры мембраны, как толщина, жесткость, термочувствительность (температура фазового перехода), и в значительной степени определяет ее латеральную организацию. Одним из параметров, используемых для оценки жесткости мембран, является соотношение фосфолипид/холестерин. Распределение липидов в монослое неравномерно: липиды организованы в рафты – микродомены, богатые холестерином и сфингомиелином [3, 32–36]. Размеры, стабильность и распределение рафтов, как и в случае трансбислойного распределения холестерина, регулируются другими компонентами мембраны, в частности ненасыщенными жирными кислотами, имеющими меньшее сродство к холестерину по сравнению с их насыщенными аналогами [4, 35, 36]. О многочисленных функциях рафтов, в которых кластеризуются определенные мембранные белки, написано много работ [3, 32–36]. Эти микродомены ограничивают латеральную подвижность мембраны и активно участвуют в различных клеточных событиях. Рафты играют сложную роль в транспортировке холестерина для поддержания клеточного гомеостаза, а также являются компонентами рецепторных и сигнальных систем клеток [15, 32, 33, 37].

Холестерин внутриклеточных мембран: распределение и источники

Эукариотические клетки, помимо наружной – плазматической мембраны (ПМ), имеют внутриклеточные мембраны в различных клеточных органеллах (эндоплазматический ретикулум (ЭР), эндо- и фагосомы, лизосомы, митохондрии, ядро и др.), где биомембраны обеспечивают согласованность различных функций внутри клетки и органелл, контролируют перемещение макро- и микромолекул, а также создают поверхности, на которых происходят важные биологические события. Распределение холестерина внутри клеток между разными клеточными мембранами очень неравномерно. Как уже отмечалось, содержание холестерина в плазматической мембране составляет 30–50% от общего количества липидов, и это самая высокая концентрация холестерина по сравнению с другими клеточными мембранами. ЭР беден холестерином и содержит менее 1% от общего количества холестерина в клетке (3–6% от общего количества липидов мембраны ЭР) [38–41]. Мембранные пути, сообщающиеся с ПМ, такие как сеть транс-Гольджи, и рециркулирующие эндосомальные компартменты, содержат промежуточные количества холестерина. В направлении к цис-Гольджи и ядру содержание холестерина еще снижается, хотя и в ядерной оболочке имеются «рафтовые» липиды сфингомиелин и холестерин, а также микродомены, обогащенные этими липидами [42–46]. Следует, кстати, отметить, что липиды ядра и сигнальные функции ядерных липидов, в частности холестерина, привлекают все большее внимание, поскольку исследования свидетельствуют о том, что холестерин и другие липиды, входящие в состав ядерной оболочки и хроматина, являются активными участниками внутриядерных процессов и играют активную роль в осуществлении и регуляции процессов деления и дифференцировки клеток и при апоптозе [42].

Низкое содержание холестерина во внутриклеточных мембранах делает их очень чувствительными к изменениям уровня холестерина. Благодаря поддержанию очень низкого исходного уровня холестерина в ЭР, даже небольшие изменения уровня холестерина в ПМ приводят к значительному (на порядок) скачку содержания холестерина в ЭР [26, 39]. Хотя в биосинтезе большинства классов мембранных липидов (включая холестерин, глицерофосфолипиды и сфинголипиды), кроме ЭР, участвуют митохондрии и аппарат Гольджи, большинство ферментов синтеза холестерина, а также основная часть молекулярного механизма, регулирующего его клеточный гомеостаз (система sterol regulatory element binding protein/SREBP cleavage activating protein, SREBP/SCAP), находится именно в мембране ЭР [4, 47–53]. Оттуда холестерин быстро переносится в другие клеточные мембраны.

Холестерин не только синтезируется в ЭР, но также поступает дополнительно из внеклеточной среды, где холестерин транспортируется в виде липопротеиновых частиц – липопротеидов низкой плотности (ЛПНП). ЛПНП связываются с рецепторами ЛПНП на поверхности ПМ и попадают внутрь клетки путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Затем ЛПНП доставляются в лизосомы, где холестерин высвобождается из ЛПНП и транспортируется в ПМ. После обогащения ПМ холестерином он экспортируется в ЭР. Когда содержание холестерина в ЭР превышает ∼5% от общей массы липидов ЭР, синтез холестерина и продукция рецепторов ЛПНП в ЭР подавляется (down-regulated). Кроме того, избыток холестерина в ЭР этерифицируется до эфиров холестерина для хранения в жировых каплях. Такая строгая регуляция гомеостаза холестерина существенна для нормальной жизнеспособности и роста клеток [53].

Межмембранный перенос холестерина

Механизмы межмембранного переноса холестерина (например, между ЭР и ПМ или между органеллами) еще недостаточно изучены. Холестерин в клетке редко транспортируется в одиночку и обычно сочетается с транспортом и метаболизмом других липидов, в частности фосфо-

инозитидов, фосфатидилсерина и сфинголипидов. В обзоре Ikonen и Zhou [38] описаны основные пути транспорта холестерина и основные точки их пересечения. Помимо экзо- и эндоцитозных механизмов, для переноса холестерина используются белки-переносчики липидов, гидрофобные полости которых защищают липид от воды и могут катализировать перенос липидов между органеллами. В работах [54–56] показано, что для транспорта холестерина из ПМ в ЭР у млекопитающих требуется анионный фосфолипид фосфатидилсерин, а также ЭР- и ПМ-связанные белки Aster. В процессах переноса холестерина участвуют внутриклеточные мембранные контакты (membrane contact sites, MCS) – области, где расстояние между мембранами составляет порядка 10 нм [57, 58]. Молекулярное устройство и роль таких контактов в клеточных процессах и метаболических перестройках клеток вызывает большой интерес и становится важной темой клеточной биологии. Хотя это сравнительно молодая область исследований, уже понятно, что MCS участвуют в переносе липидов и липидной сигнализации, а также играют важную роль в кальциевой сигнализации и в адаптации клеток к стрессу. Новые инструменты для визуализации и изучения MCS показали, что MCS повсеместно распространены и функционируют в качестве сигнальных, метаболических и логистических центров, координирующих работу органелл как в нормальных физиологических, так и в стрессовых условиях (см. обзор [57]). Межмембранный перенос холестерина, осуществляемый при участии MCS, по-видимому, является одним из существенных факторов этой координации.

Оперативные пулы холестерина

В зависимости от мобильности и доступности различным молекулярным зондам, различают три оперативных пула холестерина плазматических мембран [25, 33, 59]. Самым высокомобильным является пул холестерина («активный холестерин»), распознаваемый доменом D4 перфринголизина O (PFO) и антролизина O (ALOD4); он составляет примерно 10 моль% липидов ПМ и становится недоступным, когда холестерина в ПМ становится меньше 30 моль%; этот пул быстро перемещается в ЭР, где сигнал об избытке холестерина воспринимается механизмом SREBP2 [60, 61]. Второй пул холестерина, распознаваемый остреолизином A (OlyA) [62, 63], входит в состав комплексов сфингомиелин/холестерин. Этот пул составляет около 15 моль% липидов ПМ и формирует основу рафтов. Остальная часть холестерина (около 15 моль% липидов ПМ) секвестрируется другими мембранными факторами, является критической для жизнеспособности клеток; в настоящее время для этого пула холестерина зондов нет. Такое разделение холестерина на пулы обусловлено его сродством к фосфолипидам и другим компонентам мембраны.

В целом, распределение и поддержание физиологического уровня холестерина в клетках обеспечивается с помощью многообразных механизмов, что указывает на то, что для клетки это жизненно важная задача. Холестерин необходим клеткам животных, и его недостаток или избыток разрушителен для клеток. Поэтому для поддержания оптимального количества этого стерина развились сложные молекулярные механизмы, контролирующие и регулирующие уровень холестерина и других родственных стеринов, таких как оксистерины или промежуточные продукты синтеза холестерина, и реагирующие на изменение их уровня с помощью различных регуляторных механизмов обратной связи. Эта регуляция включает как прямое связывание стеринов компонентами гомеостатической системы, расположенной в ЭР, так и косвенные эффекты, вызванные холестерин-зависимыми изменениями физических свойств мембран [64].

ХОЛЕСТЕРИН-ЗАВИСИМЫЕ МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ И КЛЕТОЧНЫЕ ПРОЦЕССЫ

В липидную мембрану клетки встроено множество различных мембранных белков, занимающих до 30% площади мембраны, и эти мембранные компоненты постоянно взаимодействуют друг с другом: липиды влияют на встроенные белки, а белки влияют на распределение и поведение липидов [18, 19, 21–24]. Каждый встроенный в мембрану белок уникальным образом модулирует локальное липидное окружение, увеличивая или уменьшая количество определенных липидных компонентов, что создает градиенты толщины и кривизны. С другой стороны, липиды не просто служат матрицей, в которую встраиваются белки, но могут активно участвовать в регуляции активности белков, их перемещении и локализации. Белки могут либо специфически связывать липиды, когда можно выделить четкий сайт связывания для данного липида, либо неспецифически, когда липиды выступают в качестве среды, а физические свойства, такие как толщина, текучесть или кривизна, регулируют функцию белка.

Давно известно, что функционирование мембранных белков зависит от состава липидной мембраны в микроокружении этих белков. Такая липидная регуляция расширяет функциональный диапазон активности данного белка, которая существенно зависит от липидного состава мембраны [65–73]. Например, активность Na⁺, K⁺-ATP-азы модулируется неэтерифицированными жирными кислотами и лизофосфолипидами [66], на функционирование рецептора инсулина влияют диацилглицерины [67], а мембранные фосфоинозитиды регулируют многие ионные каналы [65]. Как пишет B. Hille в своем обзоре [65], такая липидная регуляция обеспечивает соответствующую активность канала и электрическую возбудимость в зависимости от липидного состава мембраны, окружающей канал-формирующий белок (the channel-forming protein). Такой механизм регуляции безусловно относится не только к ионным каналам, но и к другим белкам, а также и к другим липидам.

Холестерин-зависимые мембранные белки образуют отдельную большую группу липид-зависимых белков. К мембранным белкам, функции которых регулируются холестерином, относятся многие ионные каналы [72–75], в том числе каналы щелевых контактов, обеспечивающих межклеточную коммуникацию [76–79]. Мембранные рецепторы, участвующие в трансдукции гормональных сигналов и нейротрансмиссии, также регулируются холестерином, например, пуринергические P2X-рецепторы [80, 81], ГАМК-рецепторы [82, 83], рецепторы, сопряженные с G-белками, включая бета2-адренергические и серотониновые рецепторы [84–88], а также ацетилхолиновые рецепторы [89–91], NMDA-рецепторы [92], глициновые рецепторы [93]. Среди холестерин-зависимых рецепторов также имеются фагоцитозные рецепторы FcγRIIA41 [94], рецептор CD36 (scavenger receptor) [95–97], а также рецептор ЛПНП, отвечающий за транспорт холестерина и регуляцию уровня холестерина в крови [51]. Это далеко не полный список холестерин-зависимых мембранных белков (см. обзоры [1, 2, 14, 18, 85, 98]).

Клеточные процессы, в которых участвуют такие белки, также являются холестерин-зависимыми. Среди таких процессов – клеточная адгезия [99] и локомоция [100], эндоцитоз [101, 102] и многие другие. Холестерином регулируется синаптогенез – формирование синаптических микровезикул из плазматической мембраны: ограниченное снижение содержания холестерина в мембранах, слабо влияющее на общую эндоцитозную активность, блокирует биогенез синаптических микровезикул [103]. Частичное удаление холестерина из мембран макрофагов снижает их фагоцитозную активность [104–107]. Для холестерин-зависимых процессов характерна колоколообразная дозо-зависимость [106, 107]. Это означает, что холестерин-зависимые белки (а значит, и соответствующие процессы) требуют оптимальной концентрации холестерина для нормального функционирования, и поэтому вредным и разрушительным может быть как избыток, так и недостаток холестерина. Далее будет приведено несколько примеров холестерин-зависимых мембранных белков и связанных с ними процессов.

Холестерин-зависимые ионные каналы

Ионные каналы играют важнейшую роль в функционировании клеток, обеспечивая трансмембранный транспорт ионов и его регуляцию в ответ на химические или механические стимулы. Представители всех основных семейств ионных каналов регулируются изменением уровня мембранного холестерина; многие каналы локализуются в богатых холестерином мембранных микродоменах (рафтах) [72]. Описаны разные эффекты холестерина. Активность некоторых типов каналов (К⁺-каналов входящего выпрямления (inwardly-rectifying K⁺ channels), потенциал-зависимых К⁺-каналов, Ca²⁺-зависимых К⁺-каналов, потенциал-зависимых Na⁺-каналов, Ca²⁺-каналов N-типа и некоторых анионных каналов) подавляется при повышении содержания холестерина в мембране. Напротив, у таких каналов, как эпителиальные амилорид-чувствительные Na⁺- и TRP- (transient receptor potential) каналы, а также у некоторых типов потенциал-зависимых K⁺-каналов снижение содержания холестерина вызывают угнетение активности. Также показано, что холестерин изменяет кинетические свойства и вольт-амперные характеристики некоторых потенциал-зависимых каналов. Поддержание определенного уровня холестерина в мембране необходимо не только для прямого воздействия на каналообразующий белок (путем специфических взаимодействий между холестерином и белком канала или изменения физических свойств мембранного бислоя), но и для обеспечения связи ионных каналов с сигнальными каскадами, в частности, за счет белок-белковых взаимодействий в рафтах.

Депо-управляемые Са²⁺-каналы

Одним из интригующих примеров холестерин-зависимых мембранных белков является депо-управляемый Са²⁺-канал (store-operated Ca²⁺ channel, SOC-канал), или Ca²⁺-канал, активируемый высвобождением Ca²⁺ (Ca²⁺ release-activated Ca²⁺ channel, CRAC-канал). SOC-/CRAC-каналы – один из основных путей входа Ca²⁺ в клетку и важнейший участник в процессах кальциевой сигнализации [108]. Вход Са²⁺ через эти каналы вносит существенный вклад в Са²⁺-сигналы, инициированные агонистами различных клеточных рецепторов. Активность SOC-CRAC-каналов преимущественно обеспечивается двумя трансмембранными белками – STIM1 и Orai1. STIM1 функционирует в мембране ЭР и является молекулярным сенсором Ca²⁺ в люминальной части ЭР. Orai1 – это канальный белок, формирующий Ca²⁺-селективную пору SOC-канала и расположенный в плазматической мембране. Истощение запасов Ca²⁺ в ЭР (Са²⁺-депо) вызывает олигомеризацию белков STIM1, что приводит к изменению конформации их цитоплазматического домена и связыванию с каналами Orai1 в местах контакта ЭР и ПМ. Последнее приводит к активации каналов Orai1, входу внеклеточного Са²⁺ и локальному увеличению уровня Са²⁺ в цитозоле, что стимулирует активность Са²⁺-насоса в ЭР, и к восстановлению содержания Са²⁺ в Са²⁺-депо.

Хотя STIM1 и Orai1 являются необходимыми и достаточными элементами для функционирования SOC-каналов, их эффективная активация и деактивация регулируется различными липидами и липид- и/или ЭР-/ПМ-зависимыми вспомогательными белками. В ряде работ было показано, что холестерин модулирует функцию как STIM1, так и Orai1 и что удаление холестерина из мембран уменьшает депо-зависимый вход кальция (store-operated calcium entry, SOCE) [109–112]. Такая зависимость STIM1 и/или Orai1 от холестерина может проявляться при некоторых патологиях: высказывается предположение о взаимосвязи между гипохолестеринемией и усиленной дегрануляцией тучных клеток [108, 111]. Действительно, у пациентов, страдающих гипохолестеринемией, как правило, усиливается аллергическая реакция, что согласуется с данными о том, что истощение запасов холестерина в тучных клетках усиливает депо-управляемые токи Ca²⁺ и дегрануляцию [111].

В ходе исследований механизмов холестерин-зависимости CRAC-каналов было показано [112], что кальциевый сенсор в ЭР (STIM1) имеет холестерин-связывающую последовательность L/V–X_(1–5)-Y-X_(1–5)-R/K (где Х – любая аминокислота), расположенную внутри области SOAR (STIM1 Orai activating region, Orai-активирующая область STIM1), а также показана холестерин-зависимость STIM1 и SOAR и изменение взаимодействия SOAR с Orai при истощении холестерина. Холестерин-связывающая последовательность была предложена в работе Li и Papadopolous в 1998 году [113]; эта последовательность, сначала названная авторами «холестерин-распознающая/ взаимодействующая аминокислотная консенсусная последовательность» (cholesterol recognition/ interaction amino acid consensus sequence, CRAC), в форме аббревиатуры оказавшаяся «тезкой» CRAC-каналов, в дальнейшем была обнаружена во многих холестерин-зависимых белках [14, 18, 19, 106, 113–117]. И хотя это не исключает возможности других вариантов холестерин-связывающих мотивов, в ряде случаев присутствие такого мотива в белке указывает на высокую вероятность его взаимодействия с холестерином.

Как было показано в [112], влияние холестерина на SOC-/CRAC-каналы опосредуется холестерин-связывающим мотивом L/V–X_(1–5)-Y-X_(1–5)-R/K в С-конце белка STIM1. Мутация в этом мотиве связывания (I364A), расположенная в SOAR, приводила к усилению токов Orai1, сопоставимому с эффектом удаления холестерина, как в полноразмерном STIM1, так и в С-концевом фрагменте STIM1. Моделирование с помощью метода молекулярной динамики подтвердило, что холестерин влияет на сопряжение SOAR с мембраной. В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что холестерин-связывающий домен в Orai1 и STIM1 опосредует взаимодействия этих белков с холестерином [112].

Холестерин-зависимость кальциевой сигнализации представляется естественной хотя бы потому, что в ней участвуют ионные каналы, встроенные в мембрану. Интригующим является вопрос: влияет ли (и если да, то как?) кальциевая сигнализация на процессы синтеза, внутриклеточного транспорта и клеточного гомеостаза холестерина? Вряд ли случайно сосуществование этих двух жизненно важных систем на мембранах ЭР.

Ионные каналы наружных волосковых клеток слухового органа

Другим интересным примером холестерин-зависимого процесса, опосредуемого холестерин-зависимыми ионными каналами, может служить процесс механоэлектрического сопряжения в наружных волосковых клетках органа Корти мыши и ушной улитки цыплят [118, 119]. Основными ионными каналами, которые участвуют в процессе трансформации механического сигнала в электрический на ранних стадиях обработки звука, являются кальций-зависимые калиевые каналы высокой проводимости (“big potassium” channels, BK), которые открываются в зависимости от напряжения и концентрации кальция, а также потенциал-управляемые кальциевые каналы (VGCC), которые отвечают за кальций-зависимый экзоцитоз и синаптическую передачу в слуховом нерве. Авторы обнаружили, что снижение содержания холестерина влияет на механоэлектрическое сопряжение у наружных волосковых клеток и калиевые токи. В опытах с использованием метил-бета-циклодекстрина (mβCD) [120, 121], извлекающего холестерин из клеточной мембраны, было показано, что снижение содержания холестерина в наружных волосковых клетках уменьшает пиковый стабильный кальций-чувствительный калиевый ток BK-типа на 50%. В то же время обработка mβCD увеличивала пиковый входящий кальциевый ток (на ~30%), что исключает подавление экспрессии или функции кальциевых каналов как причину снижения кальций-чувствительного калиевого тока. В работе также показано, что BK экспрессируются в обогащенных холестерином микродоменах. Авторы заключают, что холестерин является ключевой детерминантой в физиологии слуха и что эффекты холестерина могут быть обусловлены как прямым его воздействием на биофизические свойства каналов, так и локализацией каналов в рафтах. Холестерин-зависимые изменения в кальциевых и кальций-зависимых калиевых каналах могут изменить форму рецепторного потенциала, постоянную времени мембраны и временную обработку сигнала и в целом изменить функциональную настройку клеток.

Следует отметить, что в ВК-каналах также показано присутствие холестерин-связывающих мотивов. В работе Singh и др. [122] исследовали структурные основы холестерин-зависимой регуляции (угнетения) Ca²⁺-зависимых калиевых каналов высокой проводимости (BK) с помощью комбинации методов молекулярной динамики, точечных мутаций в белке Cbv1 и электрофизиологии (регистрация активности одиночных каналов, встроенных в искусственные бислойные липидные мембраны разного состава). Исследования показали, что эффект холестерина опосредуется цитоплазматическим С-концевым доменом белка Cbv1, содержащим семь CRAC-мотивов. С помощью метода молекулярной динамики выявлены взаимодействия между холестерином и ионным каналом. На основании результатов сделан вывод, что чувствительность канала к холестерину определяется мотивом CRAC4, ближе всех расположенным к мембране; однако удаление других CRAC-мотивов или замены мотивообразующих аминокислот также (кумулятивно) угнетает чувствительность к холестерину, что указывает на участие нескольких CRAC-мотивов во взаимодействиях ВК-каналов с холестерином.

Холестерин-зависимость родопсина

И еще один пример участия холестерина в важнейшем биологическом процессе – фоторецепция и холестерин-зависимое поведение родопсина в мембранах зрительных палочек сетчатки [123–128]. Наружный сегмент палочки сетчатки (rod outer segment, ROS) содержит стопку мембранных дисков, физически отделенных от плазмалеммы. Именно в мембране диска локализован фотопигмент родопсин [129] и другие элементы каскада фототрансдукции. Мембрана диска содержит существенно меньше холестерина по сравнению с плазматической (не дисковой) мембраной палочки (соответственно, 8 моль% в дисках и 28 моль% в ПМ), причем в мембранах дисков существует свой градиент содержания холестерина: вновь образованные («молодые») мембраны дисков содержат в несколько раз больше холестерина, чем ранее образованные («старые») диски на апикальном конце ROS. Как показывают исследования, содержание холестерина в мембранах оказывает существенное влияние на состояние и активность родопсина: высокое содержание холестерина в мембране препятствует участию родопсина в каскаде зрительной трансдукции, но увеличивает стабильность родопсина [126–128]. В работе Niu и др. [126] уровень холестерина в мембранах дисков наружного сегмента палочек меняли с помощью метил-бета-циклодекстрина. Уменьшение количества холестерина в мембране диска приводило к тому, что большая доля фотоактивированного родопсина переходила в конформацию метародопсина II (MII), стимулирующую G-белки, в то время как обогащение холестерином снижало степень образования MII. Термическая стабильность родопсина увеличивалась с увеличением содержания холестерина в мембранах дисков. Таким образом, распределение и эффекты холестерина обеспечивают условия, при которых зрелые (апикальные) мембраны дисков запускают каскад зрительных сигналов более эффективно, чем вновь образованные базальные диски с более высоким содержанием холестерина. Препятствуя активации родопсина в базальных дисках, холестерин в то же время оказывает протекторное действие, стабилизируя белок и препятствуя его денатурации [126–128]. Для эффективной и надежной фоторецепции мембрана диска должна иметь оптимальное содержание холестерина – не слишком высокое, чтобы не ограничивать активацию рецептора, но и не слишком низкое, чтобы обеспечить стабильность фоторецепции. Помимо неспецифического влияния на состояние липидного окружения родопсина, холестерин может и напрямую взаимодействовать с родопсином. Это создает дополнительные способы тонкой настройки активности мембранного белка без модуляции его синтеза, оборота или модификации.

ГОМЕОСТАЗ КЛЕТОЧНОГО ХОЛЕСТЕРИНА И БОЛЕЗНИ

Поскольку от холестерина зависит нормальное функционирование клеток, то нарушение гомеостаза холестерина приводит к различным патологиям. Здесь будут приведены примеры инфекционных и неинфекционных заболеваний, в патогенезе которых выявлено участие холестерина.

Инфекционные заболевания и холестерин

Известно, что многие бактериальные, вирусные и другие патогены используют холестерин и холестерин-зависимые процессы для инфицирования клеток, и это отражается на патогенезе, симптоматике и лечении соответствующих болезней (см. обзоры [14, 130, 131]). Вопросы, касающиеся важности холестерина в мембране клетки-хозяина на разных этапах жизненного цикла вируса, а также влияния вирусов на клеточные липиды и, в частности, на холестерин, рассматривались во многих работах [132–138]. Например, взаимодействия некоторых оболочечных вирусов с клеткой во время проникновения, сборки, почкования и выхода из клетки зависят от наличия холестерина и липидных рафтов в мембранах клеток-хозяев. Это было показано для вирусов иммунодефицита (HIV), гриппа, герпеса, гепатита С (HCV), ротавирусов, вируса желтой лихорадки, вируса Зика, вируса Денге, вируса Западного Нила и многих других (см. обзор [131]). Взаимодействие вируса с клеткой приводит к значительным изменениям в липидном составе клеточных мембран. Например, в случае вируса гриппа формирование оболочки новых вирусных частиц происходит из плазматической мембраны инфицированной клетки, причем вирусная оболочка избирательно приобретает «рафтовые» липиды, холестерин и сфинголипиды. Это может сопровождаться значительными потерями этих липидов в мембране клетки-хозяина и привести к дисфункции и гибели инфицированной клетки. Эксперименты с пептидами вирусного происхождения, содержащими холестерин-связывающие мотивы, показали, что при определенной концентрации такие пептиды токсичны для клеток [106, 107]. Если считать (на основании экспериментов in vitro на клетках MDCK [139]), что один вирус может произвести в одной инфицированной клетке порядка 10⁴ новых вирусных частиц диаметром 100 нм, то суммарная площадь оболочек этих частиц будет 3 × 10⁸ нм², что составляет примерно 25% площади мембраны сферической клетки диаметром 20 мкм (12 × 10⁸ нм²). Поскольку вирусная оболочка обогащена холестерином, то для мембраны инфицированной клетки такая потеря означает существенное изменение липидного состава и соответствующие нарушения функционирования холестерин-зависимых белков. Это подтверждается наблюдениями Frensing и др. [139]: после массированной продукции вирусных частиц клетки MDCK теряли адгезионные контакты, и жизнеспособность клеток снижалась.

В случае коронавируса SARS-CoV-2 формирование вирусной оболочки (также обогащенной холестерином) происходит не из плазматических мембран, как в случае вируса гриппа, а из мембран ЭР, где содержание холестерина существенно ниже, чем в плазматической мембране. Это может быть одним из факторов, объясняющих тяжелое течение болезни при Covid-19, поскольку количество холестерина, удаляемого из мембран ЭР вновь образовавшимися вирусами, может превышать компенсаторные ресурсы клетки [131]. При недостаточном поступлении холестерина в клетки неизбежна дерегуляция холестерин-зависимых процессов, что может привести к массовой гибели клеток; это проявляется в клиническом течении заболевания и плохом прогнозе. В связи с этим следует отметить, что у пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, было зарегистрировано значительное снижение (в несколько раз) уровня общего холестерина и холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) [140, 141]. Такое снижение уровня холестерина ЛПНП у пациентов с Covid-19 может отражать усиленное привлечение циркулирующего холестерина клетками, чтобы компенсировать его потерю, связанную с размножением вируса. Возможно, клинический прогноз зависит от своевременной и успешной доставки холестерина, необходимого для восстановления клеточных мембран. Поэтому для пациентов, инфицированных SARS-CoV-2 или другими оболочечными вирусами, извлекающими холестерин из клеточных мембран, холестеринопонижающая терапия (например, статины) может быть нецелесообразной [140, 141]. В условиях пониженного уровня холестерина в клеточных мембранах любая инфекция оболочечным вирусом, поглощающим холестерин, может оказаться губительной, так как дальнейшее снижение уровня холестерина в клеточной мембране во время отпочковывания вируса может привести к повреждению клетки.

Для минимизации вероятности инфицирования клеток вирусом и последствий его массового размножения могут оказаться полезными такие подходы, как поиск и разработка агентов, которые бы селективно предотвращали взаимодействие вирусного белка с клеточным холестерином на уровне белок-липидных взаимодействий [14, 130, 131]. Показательным примером в этом отношении может быть антивирусный эффект пептида C5A, содержащего аминокислотные остатки 3–20 амфипатического α-спирального N-концевого домена белка вируса гепатита А NS5A [142, 143]. Интересно, что активный пептид C5A (SWLRDIWDWICEVLSDFK) явно содержит два варианта холестерин-связывающего мотива (RDIWDWI и/или RDIWDWICEV; шрифтом выделены мотивообразующие аминокислоты), хотя в работе Cheng и др. [143] тема холестерин-связывающих мотивов не затрагивается. Возможно, антивирусный эффект пептида C5A обусловлен тем, что благодаря наличию холестерин-связывающего мотива этот пептид конкурирует с вирусным белком за связывание холестерина клеточной мембраны и тем самым препятствует формированию оболочки вирусной частицы.

Помимо вирусных инфекций, с гомеостазом холестерина в клетке хозяина также связаны различные бактериальные инфекции. Например, грамотрицательная бактерия Helicobacter pylori, вызывающая хронический гастрит, не синтезирует холестерин самостоятельно, а извлекает его из плазматических мембран эпителиальных клеток желудка, что приводит к их разрушению и может быть важным компонентом патогенеза [144–146]. Микотические заболевания также часто связаны с изменениями в гомеостазе холестерина, поскольку патогенные грибы используют холестерин клеток хозяина [147, 148].

Еще одним классическим примером инфекции, связанной с истощением холестерина в клетках хозяина, является туберкулез. Mycobacterium tuberculosis проникает в клетку путем фагоцитоза и остается в фагосоме, используя холестерин клетки в качестве источника углерода и перестраивая холестериновый гомеостаз для своих нужд [149–153]. При хронической инфекции M. tuberculosis продолжает разрушать клетки, по крайней мере частично, из-за истощения запасов холестерина. Как и при вирусных инфекциях, своевременная и достаточная доставка холестерина необходима для поддержания целостности мембраны клетки-хозяина. Следует напомнить, что до появления антибиотиков туберкулез лечили главным образом с помощью диеты с высоким содержанием жиров и стеринов.

Малярийный плазмодий, вызывающий малярию, также является холестерин-зависимым организмом, серьезно нарушающим холестериновый гомеостаз в организме хозяина [154, 155]. Для инвазии и роста Plasmodium falciparum необходим холестерин из рафтов плазматической мембраны эритроцитов. P. falciparum не способен синтезировать de novo жирные кислоты и холестерин и получает их из инфицированных клеток. Метаболическая активность паразита приводит к изменению количества жирных кислот и холестерина в плазматической мембране эритроцитов и снижению соотношения холестерин/фосфолипиды, что приводит к изменениям проницаемости и хрупкости эритроцитов.

Как и в случае противовирусных препаратов, поиск антибактериальных, антимикотических и антималярийных лекарств, предотвращающих взаимодействие патогена с холестерином инфицированной клетки, может оказаться продуктивным и полезным. Помимо холестерин-связывающих пептидов, могут оказаться полезными другие вещества – такие, как например кверцетин, витамин Д, сапонин глицирризин и др., способные действовать на уровне холестерин-белкового интерфейса и обладающие антимикробной активностью [14, 131, 156, 157].

Холестерин и неинфекционные заболевания

Холестериновый компонент обнаруживается также во многих неинфекционных заболеваниях, таких как сердечно-сосудистые и нейродегенеративные заболевания [158], многие из которых связаны с возрастом, например болезни Альцгеймера [159, 160], Хантингтона [161] и Паркинсона [162], боковой амиотрофический склероз [163], диабет 2 типа [164] и многие другие. Эта тема заслуживает отдельного обзора и упоминается здесь лишь для того, чтобы проиллюстрировать повсеместную и многогранную роль холестерина в осуществлении нормальных клеточных функций. Роль холестерина при этих заболеваниях необязательно связана с повышением содержания «плохого» ЛПНП-холестерина в крови хотя бы потому, что метаболизм холестерина в мозге – самом богатом холестерином органе млекопитающих – независим от других тканей благодаря наличию гематоэнцефалического барьера [165], а также потому, что «высокий» ЛПНП-холестерин не означает, что в мембранах клеток содержание холестерина выше оптимального. Хотя препараты, снижающие уровень холестерина в крови, рассматривались в качестве потенциальных средств для профилактики болезни Альцгеймера (БА), экспериментальные и расчетные исследования позволили предположить защитную роль холестерина в отношении формирования фибрилл Aβ161, поскольку было показано, что холестерин препятствует выходу Aβ из мембранной среды в раствор [166, 167]. Кроме того, одной из основных особенностей БА является нарушение функционирования холинергической системы, а ацетилхолиновые рецепторы являются холестерин- и рафтозависимыми [89–91, 168, 169], поэтому истощение запасов холестерина может нарушать функционирование холинергической системы. Значение холестерина и рафтов также было показано при болезни Хантингтона, характеризующейся нейродегенерацией стриатума и коры головного мозга. Исследования постсинаптических мембран показали, что маркер болезни белок хантингтин (htt) связывается с липидными доменами [170].

Значительные изменения в метаболизме холестерина были описаны при боковом амиотрофическом склерозе [163]. Особый интерес в этом контексте представляют эксперименты Fukui и др. [164], которые показали, что у клеток нейронального происхождения истощение холестерина, имитирующее снижение клеточного холестерина при диабете, приводит к нарушению сигнализации инсулина/IGF-1 и нейротрофинов (neurotrophin) и вызывает дефекты в передаче сигналов и функционировании клеток. Авторы пришли к выводу, что снижение уровня холестерина в мозге, подобное тому, что наблюдается в мозге диабетика, может способствовать развитию осложнений диабета, связанных с ЦНС, включая повышенный риск развития нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера.

Следует напомнить, что постоянное истощение холестерина, вызванное микробными инфекциями, также может стать причиной неврологических проблем (часто наблюдаемых после ковида) и запустить процессы нейродегенерации. Показательным примером нейродегенерации, связанной с дефицитом холестерина, может быть болезнь Нимана–Пика [171, 172], при которой нарушена доставка холестерина к мембранам клеток. Этот дефект связан с инактивирующими мутациями в трансмембранном белке-транспортере холестерина NPC1, который расположен на лизосомальной мембране и экспортирует холестерин, высвобождающийся из ЛПНП, в акцепторные компартменты (эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, плазматическая мембрана). В клетках, лишенных функционального NPC1, холестерин накапливается в лизосомах и не транспортируется в эти компартменты, что приводит к дефициту холестерина в мембранах клетки и нарушению всех холестерин-зависимых функций клеток.

В целом, можно сказать, что в здоровом мозге содержание холестерина поддерживается на относительно постоянном уровне при строгой регуляции его синтеза, транспорта и оборота, а нейродегенеративные заболевания возникают при нарушении баланса между этими процессами и отклонении от оптимума содержания холестерина в клеточных мембранах. Простое угнетение синтеза холестерина с помощью статинов не всегда приводит к желаемым результатам, но часто сопровождается нежелательными явлениями (миастения, миотоническая дистрофия, когнитивные нарушения и др.) [165], и для решения этих проблем необходимы дальнейшие исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, холестерин является одним из важнейших липидов, входящих в состав клеточных мембран и участвующих в жизненно важных клеточных процессах, включая модуляцию экспрессии генов, передачу сигналов, коммуникацию между клетками и многое другое. Содержание холестерина в мембранах строго контролируется и поддерживается на оптимальном уровне. Нарушения метаболизма, логистики и гомеостаза холестерина, при которых его содержание отклоняется от этого оптимума, могут вызвать дисфункцию холестерин-зависимых и рафт-зависимых белков и стать причиной различных патологических процессов, в том числе нейродегенеративных. Холестериновый компонент присутствует также во многих инфекционных заболеваниях, и при некоторых из них снижение уровня холестерина ниже оптимального физиологического уровня может быть губительным для клеток и являться значимым фактором патогенеза, ухудшающим прогноз. В этом кроется сложность, и ее необходимо учитывать, чтобы борьба за снижение уровня «плохого холестерина» не обернулась ухудшением состояния. Одним из механизмов взаимодействия белка с холестерином является холестерин-связывающие аминокислотные мотивы, которые обнаружены во многих холестерин-зависимых белках. Пептиды, содержащие такие мотивы, могут оказаться полезными терапевтическими средствами, действующими на уровне интерфейса холестерин–белок. Развитие технологий, позволяющих исследовать механизмы белок-холестериновых взаимодействий и при необходимости проводить физиологическую коррекцию этих взаимодействий, будет способствовать разработке новых средств для лечения заболеваний, в патогенезе которых участвуют холестерин-зависимые процессы.

Источники финансирования: отсутствуют.

Конфликт интересов. Автор декларирует отсутствие конфликта интересов.

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследования.

About the authors

A. Y. Dunina-Barkovskaya

Author for correspondence.
Email: dunina.aya@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 117997

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Cholesterol molecule (a) (PubChem CID5997) and its putative location in the monolayer of membrane phospholipids (b) and in the bilayer lipid membrane, which is the basis of the cell membrane (c). In the simplified diagram of the membrane (c), the lipid bilayer contains glycerophospholipids with unsaturated and saturated fatty acid residues (uSFL and NFL, respectively), sphingolipids, and cholesterol. The bilayer contains membrane-associated cytoplasmic (CB) and extracellular (EC) proteins, as well as transmembrane proteins (TMP). The bilayer contains lipid rafts (LR) – microdomains enriched in sphingomyelin and cholesterol.

Download (807KB)

Indexing metadata