TROPONINS AND SKELETAL MUSCLE PATHOLOGIES

Full Text

Принятые сокращения: а.о. – аминокислотный остаток; бсТнИ – быстрый скелетный ТнИ; бсТнС – быстрый скелетный ТнС; бсТнТ – быстрый скелетный ТнТ; мсТнИ – медленный скелетный ТнИ; мс/сТнС – медленный скелетный/сердечный ТнС; мсТнТ – медленный скелетный ТнТ; сТнИ – сердечный ТнИ; сТнТ – сердечный ТнТ; ТнИ – тропонин И; ТнС – тропонин С; ТнТ – тропонин Т.

ВВЕДЕНИЕ

У млекопитающих поперечно-полосатая мускулатура представлена двумя типами ткани – скелетной и сердечной. Скелетные мышцы составляют около 30–40% от общей массы тела и выполняют важнейшие функции, обеспечивая в т.ч. движение, дыхание и производство тепла [1, 2]. На них приходится основная доля метаболизма глюкозы, липидов и белков. Повреждения и патологии скелетной мускулатуры могут оказывать значительное влияние на различные аспекты функционирования всего организма, приводить к ухудшению качества жизни и, в тяжёлых случаях, к летальному исходу.

Нарушения функционирования скелетных мышц могут быть вызваны механическими повреждениями, рабдомиолизом, миопатиями и другими заболеваниями, сопровождающимися мышечной атрофией. Наиболее частыми причинами механического повреждения скелетных мышц являются различные травмы, в т.ч. синдром длительного сдавления, хирургическое вмешательство, повышенная физическая нагрузка [3]. Термин «миопатия» описывает любые заболевания скелетной мускулатуры различной этиологии. Данные патологии зачастую сопровождаются повреждениями структуры скелетной мышцы и развитием метаболических нарушений в ткани [4]. Миопатии разделяют на врождённые (наследуемые) и приобретённые (вторичные). Наследуемые миопатии включают в себя мышечные дистрофии (связаны с мутациями в генах белков сократительного аппарата, например, мышечная дистрофия Дюшенна и мышечная дистрофия Беккера); конгенитальные миопатии (например, немалиновая и коровая миопатии); метаболические миопатии (связаны с мутациями в генах различных ферментов, участвующих в метаболизме углеводов и липидов); митохондриальные миопатии (связаны с мутациями белков окислительного фосфорилирования митохондрий) и каналопатии [5–8]. Мышечные дистрофии – одни из наиболее распространённых и тяжёлых видов наследуемых миопатий, для некоторых из которых, например, мышечной дистрофии Дюшенна, характерна прогрессирующая мышечная слабость и атрофия, приводящая в итоге к смерти от сердечно-лёгочной недостаточности [9]. Среди приобретённых миопатий выделяют воспалительные миопатии (чаще всего аутоиммунной природы, такие как дерматомиозит и полимиозит); миопатии, ассоциированные с различными инфекциями (вызываемые бактериями, грибами или вирусами); токсические миопатии (вызванные в т.ч. отравлением наркотическими веществами или алкоголем, приёмом миотоксичных лекарственных препаратов, таких как статины, фибраты и др.); миопатии, ассоциированные с различными патологиями (ревматические и эндокринные заболевания, злокачественные опухоли и др.); идиопатические и эндокринные миопатии [10–13].

Ещё одной опасной патологией скелетных мышц является рабдомиолиз – процесс разрушения скелетной мышцы с высвобождением в кровоток внутриклеточных компонентов, в тяжёлых случаях угрожающий жизни. При разрушении более 100 г мышечной ткани концентрация миоглобина в крови достигает критических значений, и значительное количество белка осаждается в почечных канальцах. Данный процесс может спровоцировать острую почечную недостаточность, которая является основной причиной летальных исходов при рабдомиолизе [12, 14]. У детей основными факторами, приводящими к развитию данной патологии, являются вирусные миозиты, травмы, ревматические заболевания, физические упражнения высокой интенсивности и приём лекарственных препаратов [12]. У взрослых возникновение рабдомиолиза наиболее часто обусловлено злоупотреблением алкоголем или наркотическими веществами, приёмом лекарственных препаратов, травмами, злокачественным нейролептическим синдромом или обездвиженностью [5, 12].

Миопатии сопровождаются мышечной атрофией – потерей мышечной массы и силы, при которой катаболизм мышечных белков преобладает над анаболизмом. Помимо миопатий, и другие заболевания и патологии могут приводить к развитию мышечной атрофии. К ним относят хроническую сердечную недостаточность, хроническую обструктивную болезнь лёгких, рак, хронические почечные заболевания, болезнь Альцгеймера, инфекционные заболевания [15, 16]. Также к мышечной атрофии приводит обездвиживание и неиспользование мускулатуры, связанное, например, с параличом или длительной госпитализацией [3].

Отдельно стоит отметить саркопению (от греческих слов «sarx» (плоть) и «penia» (нехватка)) – потерю мышечной массы, происходящую при старении. При саркопении происходит уменьшение поперечной площади и числа мышечных волокон и накопление жировой и соединительной ткани в скелетной мышце, это процесс прогрессирующей и генерализованной потери мышечной массы и силы, который влечёт за собой низкую физическую работоспособность и, при длительном развитии, гериатрическую слабость [17]. Для этого состояния характерны повышенный риск болезненности, падений, ограничений в повседневной активности, плохой прогноз после хирургического вмешательства и, в конечном счёте, высокая смертность [16]. Распространённость саркопении достигает 13% среди людей 60–70 лет и 50% среди людей ≥ 80 лет [17]. Наличие диабета повышает риск развития саркопении в 2 раза и дальнейшей гериатрической слабости – в 1,5–4 раза [18]. Таким образом, актуальность этих проблем возрастает в связи с увеличением продолжительности жизни. На сегодняшний день для снижения прогрессирования саркопении используют корректировку питания и физические упражнения, но при этом разрабатываются стратегии терапии, направленные на предотвращение мышечного повреждения [16–18].

Скелетная мускулатура – основной инсулинзависимый потребитель глюкозы, поэтому потеря мышечной массы при саркопении может приводить к развитию инсулинорезистентности и, в конечном счёте, сахарному диабету 2 типа. Кроме того, формированию данных заболеваний может способствовать адипоз скелетной мышцы, наблюдаемый при саркопении [17, 19]. При саркопении и при сахарном диабете 2 типа могут развиваться функциональные нарушения, для которых необходима диагностика и своевременное лечение. Таким образом, важным является мониторинг уменьшения массы скелетных мышц, особенно у людей с диабетом.

У человека выявлены три типа скелетных мышечных волокон: медленные, 1 типа, и быстрые (2А и 2Х типа; у других млекопитающих также есть волокна 2B типа) [20, 21]. Мышечные волокна 2А типа более устойчивы к утомлению, чем волокна 2Х типа, и содержат в своём составе больше ферментов окислительного метаболизма [22]. Состав мышцы зависит от выполняемой ею функции: мышцы, отвечающие за поддержание положения тела, в основном состоят из волокон медленного типа, в то время как мышцы, необходимые для движения, преимущественно состоят из волокон быстрого типа [21].

Развитие некоторых патологий может приводить к повреждению мышечных волокон только определённого типа. Так, при мышечной дистрофии Дюшенна повреждаются преимущественно быстрые мышечные волокна, наиболее сильно – волокна 2Х типа [23]. Мышечные повреждения, индуцированные приёмом статинов, затрагивают преимущественно волокна быстрого типа, в то время как приём фибратов – преимущественно волокна медленного типа [24, 25]. При интенсивных эксцентрических сокращениях также повреждаются волокна преимущественно быстрого типа [26]. Для многих патологических состояний, сопровождающихся мышечной атрофией, характерна не только атрофия определённого типа мышечных волокон, но и смена одних волокон на другие. Так, при денервации или обездвиженности конечности, при травме спинного мозга, при длительном постельном режиме обычно происходит смена медленных волокон на быстрые [27]. Обратный процесс, смена быстрых волокон на медленные, происходит при голодании, приёме глюкокортикоидов, кахексии и саркопении [27]. Помимо этого, для мышечных волокон быстрого и медленного типа показана разная способность к регенерации после повреждения. Так, на крысах было показано, что если мышцы, состоящие преимущественно из волокон быстрого типа (например, extensor digitorum, разгибатель пальцев), регенерируют эффективно, то мышцы, состоящие преимущественно из волокон медленного типа (например, soleus, камбаловидная мышца), не регенерируют полностью, и на месте мышечной ткани развивается фиброз [28].

Широко применяемыми способами диагностики повреждений скелетной мускулатуры являются различные инструментальные методы: магнитно-резонансная томография, компьютерная томография, двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия [29]. Данные подходы позволяют неинвазивно детектировать изменения в скелетных мышцах (отёк, замену на жировую и соединительную ткань, мышечную атрофию), определять конкретные участки повреждений и даже проводить количественную оценку изменений в структуре скелетной мускулатуры [30–34]. Однако недостатком инструментальных методов является необходимость наличия дорогостоящего оборудования и специализированных мест для проведения манипуляций. Альтернативой является определение концентрации в крови биомаркеров – белков скелетной мускулатуры, высвобождающихся в кровоток при повреждении мышечных волокон. Наиболее широко используемыми на данный момент маркерами повреждения скелетной мускулатуры, являются креатинкиназа, а также аспаратаминотрансфераза, лактатдегидрогеназа и миоглобин [35]. В то же время необходимо отметить, что все вышеперечисленные белки не обладают специфичностью: помимо скелетной мускулатуры, они экспрессируются и в других тканях, что может снижать точность проводимой диагностики. В исследованиях, направленных на поиск и анализ новых маркеров повреждения скелетных мышц, выделяют такие белки, как связывающий жирные кислоты белок 3, лёгкие цепи миозина 3, ММ-изоформа креатинкиназы, а также скелетные изоформы тропонина И (ТнИ) [36]. Несмотря на то что все вышеперечисленные белки сравнимы или превосходят по чувствительности маркеры, используемые на сегодняшний день, среди них лишь один белок – скелетные изоформы ТнИ – специфичен для скелетной мускулатуры [9, 36, 37]. ТнИ вместе с тропонином Т (ТнТ) и тропонином С (ТнС) образует тропониновый комплекс, который участвует в регуляции мышечного сокращения [38, 39]. Изоформы ТнТ также специфичны для скелетной мускулатуры, однако мы не нашли данных, подтверждающих их использование в качестве маркера повреждения мышц. Возможность его использования как маркера требует дальнейшего изучения.

На протяжении многих лет скелетные тропонины привлекали внимание исследователей с точки зрения изучения регуляции мышечного сокращения. В данном обзоре мы описываем роль этих белков в развитии некоторых заболеваний скелетных мышц и рассматриваем возможность их применения для диагностики и терапии повреждений скелетной мускулатуры.

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ТРОПОНИНОВ

Тропонин И. ТнИ представлен в организме человека тремя изоформами: сердечной (сТнИ) и двумя скелетными, быстрой (бсТнИ) и медленной (мсТнИ). бсТнИ и мсТнИ экспрессируются в мышечных волокнах быстрого и медленного типа соответственно (табл. 1) [23, 40]¹. мсТнИ также экспрессируется в сердечной мышце в ходе эмбрионального развития и заменяется сТнИ в постнатальном периоде [41]. сТнИ экспрессируется только в сердечной мускулатуре после рождения [42, 43].

 

Таблица 1. Некоторые свойства скелетных изоформ ТнИ человека

Изоформы	Быстрый скелетный ТнИ (Uniprot P48788)	Медленный скелетный ТнИ (Uniprot P19237)
Ген	TNNI2	TNNI1
Хромосомный локус	11p15.5	1q32.1
Число экзонов	8	9
Число а.о.	182	187
Молекулярная масса (кДа)	21,3	21,7
Изоэлектрическая точка	8,9	9,6
Тканевая специфичность	быстрые скелетные мышечные волокна	медленные скелетные мышечные волокна, эмбриональные кардиомиоциты

 

ТнИ препятствует взаимодействию миозина и актина в отсутствие Са2+. В присутствии Са2+ ингибиторный домен ТнИ диссоциирует с поверхности актина, что способствует образованию актомиозинового комплекса [44, 45]. Основным отличием скелетных изоформ ТнИ и сТнИ является наличие в сердечной изоформе белка уникальной N-концевой последовательности длиной в 31 аминокислотный остаток (а.о., 2–32) (рис. 1). Фосфорилирование а.о. Ser23 и Ser24 в составе этого участка считают одним из способов регуляции мышечного сокращения [48]. Среди скелетных изоформ ТнИ структура была расшифрована только для бсТнИ. Наиболее высокое разрешение было получено методом рентгеноструктурного анализа для бсТнИ курицы в комплексе с ТнС и фрагментом ТнТ как в насыщенном Са2+ состоянии (с разрешением в 3,00 Å), так и в отсутствие ионов Са2+ (с разрешением в 7,00 Å) [46]. Структура бсТнИ была расшифрована для всей молекулы белка, за исключением её С-концевого участка. В молекуле ТнИ можно выделить несколько функциональных участков: ИТ-рука, ингибиторный домен, регуляторный домен и C-концевой участок. Для медленной скелетной изоформы примерные границы участков определены исходя из сходства последовательности мсТнИ с бсТнИ и сТнИ [46, 47]. ИТ-рука (~2–106 (а.о.) для бсТнИ; ~2–107 для мсТнИ; мсТнИ человека; нумерация может отличаться у различных видов животных) выполняет структурную функцию: она состоит из N-концевого участка, связывающего С-концевой домен ТнС (~2–40 бсТнИ и мсТнИ), и ТнТ-связывающего участка (~50–106 бсТнИ и ~50–107 мсТнИ). ИТ-рука образована двумя противоположно направленными α-спиралями: H1 (~12–48 бсТнИ и мсТнИ) и H2 (~58–103 бсТнИ; ~59–104 мсТнИ), соединённых линкером (~49–57 бсТнИ; ~49–58 мсТнИ). Ингибиторный домен (~107–115 бсТнИ; ~108–116 мсТнИ) в отсутствие ионов Са2+ взаимодействует с актином, в то время как при повышении концентрации Са2+ он диссоциирует от тонкого филамента (при этом также происходит смещение тропомиозина), и актин становится доступным для связывания миозином. Регуляторный домен (~116–131 бсТнИ; ~117–132 мсТнИ), который включает в себя α-спираль H3 (~118–127 бсТнИ; ~119–128 мсТнИ, сТнИ), при повышении концентрации Са2+ связывается с N-концевым доменом ТнС, что приводит к диссоциации ингибиторного домена ТнИ от актина, смещению тропомиозина и взаимодействию миозина с актином.

 

Рис. 1. Выравнивание трёх изоформ ТнИ человека: бсТнИ, мсТнИ и сТнИ. Аминокислотные последовательности белков из базы данных Uniprot: бсТнИ (TNNI2_HUMAN, P48788), мсТнИ (TNNI1_HUMAN, P19237), сТнИ (TNNI3_HUMAN, P19429). Выравнивание произведено в программе Clustal Omega. Голубым цветом отмечены совпадающие а.о. Прямоугольники обозначают границы α-спиралей (нумерация а.о. указана для последовательности бсТнИ). Стрелками отмечены сайты связывания ТнС и ТнТ. Над последовательностями указаны возможные участки фосфорилирования бсТнИ и мсТнИ (p) и глутатионилирования бсТнИ (glut) [44–47]

 

С-Концевой участок бсТнИ не удалось закристаллизовать в связи с его подвижностью. Согласно некоторым данным, полученным с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для быстрого скелетного тропонинового комплекса курицы, С-концевой участок не имеет вторичной структуры и находится в неупорядоченном состоянии, причём как в отсутствие, так и в присутствии Са2+ [49, 50]. Согласно данным, полученным методом малоуглового нейтронного рассеяния, при низких концентрациях Са2+ С-концевой участок бсТнИ представляет из себя удлинённую структуру, которая предположительно может быть суперскрученной спиралью или β-слоями, в то время как в присутствии Са2+ участок приобретает компактную структуру [51]. Ещё одни результаты, полученные методом ЯМР, свидетельствуют о том, что С-концевой участок бсТнИ курицы имеет вторичную структуру, состоящую из α-спирали, двух β-слоёв и ещё двух α-спиралей [52–54]. Считается, что С-концевой участок взаимодействует с актином в отсутствии Са2+ и таким образом участвует в ингибировании связывания актина и миозина [52, 55, 56].

Тропонин Т. ТнТ, как и ТнИ, представлен в организме человека тремя изоформами: сердечной (сТнТ) и двумя скелетными, быстрой (бсТнТ) и медленной (мсТнТ) (табл. 2). бсТнТ и мсТнТ экспрессируются только в скелетных мышцах, в то время как сТнТ экспрессируется не только в сердце, но и в скелетной мускулатуре в ходе эмбрионального развития и в неонатальный период [57, 58].

 

Таблица 2. Некоторые свойства скелетных изоформ ТнТ человека

Изоформы	Быстрый скелетный ТнИ (Uniprot P45378)	Медленный скелетный ТнИ (Uniprot P13805)
Ген	TNNT3	TNNT1
Хромосомный локус	11p15.5	19q13.42
Число экзонов	19	14
Число а.о.	245–269	251–278
Молекулярная масса (кДа)	29,1–31,8	30–33
Изоэлектрическая точка	5,7–9	5,6–6,1
Тканевая специфичность	скелетные мышцы	скелетные мышцы

 

Функция ТнТ заключается в прикреплении тропонинового комплекса к актиновому филаменту и в регуляции взаимодействия тропонинового комплекса с белками тонкого филамента [59]. В состав молекулы ТнТ входит N-концевой вариабельный участок и консервативные центральный и С-концевой участки (рис. 2). N-Концевой домен ТнТ вариабелен не только по аминокислотному составу, но и по длине, и разнообразие форм является результатом альтернативного сплайсинга. В составе консервативной части расположены две α-спирали, H1 (~162–188 для бсТнТ) и H2 (~196–240 для бсТнТ). Н2 ТнТ образует суперскрученную спираль с Н2 ТнИ, а своим С-концом взаимодействует с ТнС [46, 47, 60–62]. В состав консервативной части также входят два участка взаимодействия с тропомиозином, Тм1 и Тм2. Расположение Тм1 определено с достаточной точностью (~61–99 для бсТнТ; ~65–103 для мсТнТ), в то время как данные о локализации Тм2 противоречивы. Jin и Chong [60] считают, что Тм2 располагается между а.о. ~161–200 бсТнТ и ~165–204 мсТнТ, при этом в других работах предполагается, что Тм2 сформирован самыми С-концевыми остатками молекулы ТнТ [63–66]. Данные, полученные при исследованиях структуры тонких филаментов сердца методами криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) и криоэлектронной томографии (крио-ЭТ), позволяют предполагать, что сТнТ связывается сразу с двумя цепями тропомиозина. Тм2 ТнТ связывается с той же цепью тропомиозина, что и ТнИ, в то время как Тм1 взаимодействует с соседней нитью белка [67, 68]. Исследования структуры тонких филаментов сердца и скелетных мышц методами крио-ЭМ и крио-ЭТ показали, что бсТнТ, вероятно, взаимодействует с белком скелетных мышц небулином, который, как и тропомиозин, связывается с актином по всей его длине. Структура ТнТ и небулина ещё не получена, однако предполагают, что участок R134–R179 бсТнТ мыши (соответствует R123–R169 бсТнТ человека) содержит в своём составе два сайта связывания с небулином [69].

 

Рис. 2. Выравнивание трёх изоформ ТнТ человека: бсТнТ, мсТнТ и сТнТ. Последовательности белков взяты из базы данных Uniprot: бсТнТ (TNNT3_HUMAN, P45378-3), мсТнT (TNNT1_HUMAN, P13805-1), сТнT (TNNT2_HUMAN, P45379-6). Выбраны наиболее длинные сплайсоформы, представленные в организме взрослого человека (для бсТнТ и сТнТ – не содержащие фетальных экзонов). Выравнивание произведено в программе Clustal Omega. Зелёным цветом выделены идентичные а.о. Экзонная структура бсТнТ и мсТнТ приведена над выравниванием. Прямоугольники обозначают границы α-спиралей (нумерация а.о. указана для последовательности бсТнТ), над Н2 отмечен участок взаимодействия с ТнИ и ТнС. Овалом со сплошной линией отмечен сайт взаимодействия с тропомиозином Тм1, овалами с пунктирной линией отмечены предполагаемые места связывания с тропомиозином Тм2 и возможный сайт связывания с небулином. Над последовательностями указаны возможные участки фосфорилирования бсТнТ [46, 47, 60, 63–66, 69, 70]

 

Ген TNNT3, кодирующий бсТнТ, содержит в своём составе 19 экзонов. Из них 8 экзонов – кодирующие N-концевые участки экзоны 4–8 и фетальный экзон, а также кодирующие С-концевой участок экзоны 16 и 17 (они же экзоны α и β) – могут подвергаться альтернативному сплайсингу [71]. Фетальный экзон, расположенный между экзонами 8 и 9, экспрессируется только в эмбриональных скелетных мышцах [70, 72]. Экспрессия экзонов 16 и 17 является взаимоисключающей, экзон 16 экспрессируется преимущественно во взрослом возрасте, в то время как экзон 17 – преимущественно в эмбриональных и неонатальных мышцах [73, 74]. В ходе эмбрионального развития и постнатальный период происходит смена экспрессии сплайсоформ бсТнТ: высокомолекулярные формы сменяются низкомолекулярными, формы с кислой изоэлектрической точкой сменяются щелочными формами [75].

Во взрослых мышцах кролика методом вестерн-блоттинга была показана экспрессия пяти сплайсоформ бсТнТ: доминирующих – TnT1f (самая длинная, содержит в своём составе все экзоны, кроме фетального), TnT2f, TnT3f – и, в меньшей степени, TnT2fa, TnT4f [72, 76, 77]. При этом важно отметить, что состав сплайсоформ отличался в разных типах мышц. У взрослых крыс методом масс-спектрометрии было идентифицировано шесть сплайсоформ бсТнТ, при этом их состав также отличался в разных мышцах [78]. Тем же методом были детектированы шесть сплайсоформ бсТнТ у макак-резусов [79]. У взрослого человека методом масс-спектрометрии было идентифицировано только три сплайсоформы бсТнТ (fsTnT III, VI и VII), однако в этом исследовании авторы брали только два типа мышц, tibialis anterior и vastus lateralis, первая из которых содержит в своём составе преимущественно волокна медленного типа, в связи с чем часть сплайсоформ бсТнТ могла быть не обнаружена [80].

Ген TNNT1, кодирующий мсТнТ, состоит из 14 экзонов. В отличие от бсТнТ, разнообразие форм, полученных в результате альтернативного сплайсинга мсТнТ, невелико. Методом вестерн-блоттинга для мышей и овец было показано наличие высокомолекулярной и низкомолекулярной форм мсТнТ [81]. Клонирование геномной кДНК мыши позволило определить, что низкомолекулярная форма получается в результате делеции 11 а.о., которая образуется в результате альтернативного сплайсинга N-концевого экзона 5. Также было показано, что существуют две высокомолекулярные формы, различающиеся делецией одного а.о. в экзоне 6 [81, 82]. Клонирование геномной кДНК человека также выявило три сплайсоформы мсТнТ: полноразмерную форму, форму с С-концевой делецией 16 а.о., образованной в результате альтернативного сплайсинга экзона 12, и форму с двумя делециями – вышеупомянутой С-концевой и N-концевой делецией 11 а.о. (экзон 5) [82–84]. На белковом уровне методом масс-спектрометрии в скелетных мышцах человека (vastus lateralis и tibialis anterior) были идентифицированы две сплайсоформы мсТнТ – с одной и с двумя делециями [80].

Тропонин С. В отличие от ТнИ и ТнТ, ТнС представлен в организме человека двумя изоформами: медленной скелетной/сердечной изоформой мс/сТнС и быстрой скелетной изоформой бсТнС, которые экспрессируются в сердечных/медленных скелетных и быстрых скелетных мышечных волокнах соответственно (табл. 3) [85].

 

Таблица 3. Некоторые свойства скелетных изоформ ТнС человека

Изоформы	Быстрый скелетный ТнС (Uniprot P02585)	Медленный скелетный/ сердечный ТнС (Uniprot P63316)
Ген	TNNC2	TNNC1
Хромосомный локус	20q13.12	3p21.1
Число экзонов	6	6
Число а.о.	160	161
Молекулярная масса (кДа)	18,1	18,4
Изоэлектрическая точка	4,1	4,0
Тканевая специфичность	быстрые скелетные мышечные волокна	медленные скелетные мышечные волокна, кардиомиоциты

 

ТнС – белок, обеспечивающий чувствительность тонкого филамента к концентрации ионов Са2+. При повышении концентрации внутриклеточного Са2+ в результате распространения нервного импульса по мышечному волокну ТнС связывает Са2+, что приводит к изменению конформации тропонинового комплекса, смещению молекулы тропомиозина и развитию мышечного сокращения. ТнС состоит из короткого N-концевого участка и четырёх EF-рук – Са2+-связывающих доменов (рис. 3). Четыре EF-руки объединены попарно и образуют N-концевой и С-концевой домены, соединённые линкером. N-Концевые EF-руки (I и II) обладают низким сродством к Са2+, а С-концевые (III и IV) – высоким сродством. С-Концевые EF-руки постоянно заполнены ионами Са2+ или Mg2+, в то время как N-концевые с высокой селективностью связывают Са2+ при повышении его концентрации во время распространения потенциала действия в мышечном волокне. В бсТнС все четыре EF-руки могут связывать Са2+, в то время как у с/мсTнC первая EF-рука утратила такую способность в результате инсерции одного а.о. и замен двух а.о. [47, 62, 86].

 

Рис. 3. Выравнивание двух изоформ ТнС человека: бсТнС и мс/сТнС. Последовательности взяты из базы данных Uniprot: бсТнС (TNNC2_HUMAN, P02585), мс/сТнС (TNNC1_HUMAN, P63316). Жёлтым цветом выделены идентичные а.о. Остатки, участвующие в связывании Ca2+ и Mg2+, выделены жирным шрифтом. Прямоугольниками отмечены границы α-спиралей (N, A–H). Стрелками указаны N-концевой и C-концевой домены, а также EF-руки. Серыми кружками отмечены сайты связывания Ca2+ и Mg2+; незакрашенный кружок со сплошной линией указывает на сайт, специфичный к Са2+ в обеих изоформах ТнС; кружком с пунктирной линией отмечен сайт, селективно связывающий Са2+ в бсТнС (I EF-рука в мс/сТнС не связывает ионы) [46, 47, 62, 86–89]

 

Структура бсТнС была расшифрована методом ренгеноструктурного анализа для белка кролика [87], белка цыплёнка [46] – как для свободного белка, так и для белка в составе тропонинового комплекса. Несмотря на то что мс/сТнС также экспрессируется в мышечных волокнах медленного типа, большая часть работ посвящена исследованию его структуры и роли в составе тропонинового комплекса сердца человека [47].

С-Концевой домен ТнС входит в состав ИТ-руки, взаимодействуя с другими тропонинами в области суперскрученной спирали (Н2 ТнИ и Н2 ТнТ) и Н1 ТнИ. N-Концевой и C-концевой глобулярные домены ТнС соединены центральным линкером [46, 47]. В то время как С-концевой домен всегда связывает ионы, N-концевой домен может переключаться между двумя состояниями: закрытой конформацией в отсутствие Ca2+ или открытой конформацией, которая формируется при связывании Ca2+ EF-рукой(ами). Связывание Ca2+ приводит к образованию гидрофобного кармана, который взаимодействует с регуляторным доменом ТнИ, что приводит к удалению ингибиторного домена ТнИ от молекулы актина и развитию мышечного сокращения [88, 89].

Функциональные различия изоформ тропонинов. Быстрые скелетные, медленные скелетные и сердечные волокна поперечно-полосатой мускулатуры по-разному реагируют на повышение концентрации Са2+. Медленные мышечные волокна обладают наибольшей чувствительностью к Са2+ (другими словами, пороговая концентрация Са2+, необходимая для их сокращения, меньше), быстрые – наименьшей чувствительностью [21, 90, 91]. При этом наибольшая кооперативность сокращения (коэффициент Хилла) наблюдается у мышечных волокон быстрого типа, а минимальная – у медленных. Есть данные, свидетельствующие о том, что эти различия могут быть обусловлены изоформами тропонинов, экспрессирующимися в разных типах волокон. Так, при замене мс/сТнС на бсТнС в сердечных волокнах чувствительность к Са2+ снижается, при этом замена бсТнС на мс/сТнС в быстрых скелетных волокнах приводила к повышению чувствительности к Са2+ [90]. При замене быстрого скелетного тропонинового комплекса на сердечный в волокнах быстрого типа наблюдалось увеличение чувствительности к Са2+ и снижение кооперативности сокращения [92].

Падение внутриклеточного рН (ацидоз) во всех типах поперечно-полосатой мускулатуры приводит к сократительной дисфункции, в том числе к уменьшению чувствительности к Са2+. В сердце опасное понижение внутриклеточного рН до значений 6,5 и ниже наблюдается при длительной ишемии и обусловлено накоплением продуктов метаболизма, в том числе лактата [93, 94]. В скелетных мышцах понижение рН было выявлено при интенсивных физических нагрузках, но, хотя понижение рН и влияет на мышцы, его эффект не столь существенный, как в сердце. У человека после физической нагрузки высокой интенсивности рН падает до ~6,5, при этом в среднем рН обычно снижается до ~6,8–6,9 [95–97]. Как и в случае чувствительности к Са2+, степень эффекта от понижения рН варьирует в зависимости от типа мышечных волокон: наиболее ярко он проявляется в сердечной мускулатуре и наименее – в скелетных волокнах медленного типа [98]. Эксперименты на выделенных мышечных волокнах показали, что при снижении рН с 7 до 6,5 наименьшее падение чувствительности к Са2+ наблюдается у медленных мышечных волокон (у быстрых и сердечных падение больше и примерно одинаково по амплитуде) [90]. При этом дальнейшее понижение рН до 6,2 оказывает наиболее сильное действие на сердечные волокна, но не на скелетные.

Чувствительность сократительного аппарата к ацидозу во многом обусловлена тропониновым комплексом, а величина этого эффекта определяется в том числе различными изоформами тропонинов [99]. Так, эксперименты, проведённые на выделенных мышечных волокнах, показали, что замена бсТнС на мс/сТнС в быстрых мышечных волокнах приводит к увеличению чувствительности к рН, и, наоборот, замена мс/сТнС на бсТнС в медленных мышечных волокнах приводит к небольшому уменьшению чувствительности к закислению [100]. Последний эффект ещё более выражен при замене мс/сТнС на бсТнС в сердечных волокнах [99]. Таким образом, мс/сТнС увеличивает зависимость от рН, а бсТнС – уменьшает её. Другие авторы показали, что на чувствительность к рН влияют комбинации ТнС и ТнИ. Авторы выделяли сердечные волокна и заменяли ТнИ и ТнС на другие изоформы белков, вместе или по отдельности. В волокнах, содержащих сТнИ или бсТнИ, мс/сТнС обусловливает повышенную чувствительность к pH в сравнении с бсТнС. При этом замена сТнИ на мсТнИ приводит к снижению чувствительности к рН независимо от того, какая изоформа ТнС присутствует. Это позволило авторам сделать вывод о том, что ТнС в большей степени обусловливает чувствительность к рН в быстрых скелетных или сердечных волокнах, а ТнИ – в медленных скелетных волокнах [90]. Последнее хорошо согласуется с тем, что неонатальные кардиомиоциты, в которых экспрессируется мсТнИ, менее чувствительны к ацидозу, чем взрослые кардиомиоциты, экспрессирующие сТнИ [101]. Этот эффект также воспроизводился в трансгенных мышах: при замене сТнИ на мсТнИ чувствительность к ацидозу снижалась [102]. Более поздние исследования показали, что данный эффект, вероятно, обусловлен наличием остатка His132 в составе мсТнИ (His131 у бсТнИ); в молекуле сТнИ на его месте расположен Ala163. Данный а.о. локализован в регуляторном домене ТнИ и участвует во взаимодействии с ТнС. Было показано, что при понижении рН электростатическое взаимодействие между остатком гистидина и остатками Glu15 и Glu19 в составе молекулы ТнС стабилизирует конформацию тропонинового комплекса, что приводит к сокращению мышцы [103–106].

Три изоформы ТнТ отличаются значениями своих изоэлектрических точек, при этом изоформа бсТнТ, экспрессирующаяся у взрослых, является наиболее щелочной. Помимо этого, в ходе развития наблюдается смена сплайсоформ бсТнТ от более кислых к более щелочным вариантам, что в конечном счёте приводит к экспрессии щелочных сплайсоформ во взрослом возрасте. Данные различия обусловлены вариабельностью N-концевого домена [107]. Однако существует уникальная кислая сплайсоформа бсТнТ, экспрессирующаяся в некоторых типах мышц у взрослых куриц [107]. Было показано, что эти мышцы обладают меньшей чувствительностью к Са2+, а также большей устойчивостью к ацидозу в сравнении с мышцами, которые экспрессируют щелочные сплайсоформы бсТнТ [108]. Полученные данные согласуются с тем фактом, что при экспрессии бсТнТ в сердце трансгенных мышей снижалась устойчивость сердечной мышцы к ацидозу [109].

СКЕЛЕТНЫЕ ТРОПОНИНЫ КАК МАРКЕРЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ СКЕЛЕТНОЙ МУСКУЛАТУРЫ

Одним из наиболее чувствительных и специфичных подходов для детекции и определения концентрации маркеров, в том числе скелетных изоформ ТнИ, является иммунный анализ типа «сэндвич» [110]. В большинстве случаев метод основан на использовании двух антител, распознающих различные эпитопы на поверхности антигена: антитело подложки и детекторное антитело, которое может быть конъюгировано с различными метками. Насколько нам известно, на сегодняшний день нет зарегистрированных для клинического применения тест-систем, детектирующих скелетные изоформы ТнИ, и во всех опубликованных работах использовались системы, предназначенные только для научно-исследовательских целей.

В ряде исследований были определены концентрации скелетных изоформ ТнИ у здоровых людей. Средние значения базальных концентраций варьировали от 1,74 ± 0,27 нг/мл до 2,5 ± 0,9 нг/мл при их определении одним и тем же методом в разных работах [111–114]. В ещё одном исследовании концентрация скелетных изоформ ТнИ у здоровых была ниже предела обнаружения (ПрО), равного 1,2 нг/мл [115]. В работе, где определяли концентрацию бсТнИ, его базальная концентрация оказалась ниже ПрО метода, который составлял 2,4 нг/мл [9, 116]. Необходимы дальнейшие исследования, однако имеющиеся данные позволяют предположить, что средний уровень скелетных изоформ ТнИ в здоровой популяции ниже 1–2 нг/мл.

При повреждении скелетной мускулатуры нарушается целостность мембраны мышечного волокна, и внутриклеточные белки попадают в кровоток. Показано, что уровень скелетных изоформ ТнИ растёт при повреждениях скелетной мускулатуры различной этиологии. Так, их концентрация повышена у больных с рабдомиолизом [117, 118]; после интенсивных физических нагрузок: например, после триатлона [113], бега [119], эксцентрических сокращений [26, 120–122]; при травмах опорно-двигательного аппарата и мягких тканей, в том числе после хирургического вмешательства [114, 119]. Также наблюдается рост концентрации скелетных изоформ ТнИ у больных с воспалительными миопатиями, например, полимиозитом и дерматомиозитом [115, 119, 123]. Концентрация скелетных изоформ ТнИ коррелирует с клинической картиной при мышечных дистрофиях (Дюшенна, Беккера и поясно-конечностной мышечной дистрофии), и поэтому возможно использование данного параметра для оценки степени тяжести заболевания и мониторинга ответа на терапию [9].

Одним из потенциальных приложений скелетных изоформ ТнИ как биомаркера является определение миотоксичности лекарственных препаратов, при использовании которых происходит разрушение мышечных волокон и высвобождение тропонина в кровоток [36, 37, 124, 125]. Возможность такого применения была показана на крысах, а также с использованием 3D мышечной ткани человека in vitro [126, 127].

Наличие изоформ, специфичных для различных типов скелетных волокон, предоставляет дополнительные возможности для диагностики. Как было описано в предыдущем разделе, при ряде повреждений/заболеваний скелетной мускулатуры может затрагиваться определённый тип мышечных волокон. Например, при эксцентрических сокращениях повреждаются волокна преимущественно быстрого типа, и при этом именно бсТнИ, а не мсТнИ высвобождается в кровоток [26, 121, 122]. Для некоторых мышечных дистрофий также показано повышение концентрации бсТнИ, но не мсТнИ [128].

Максимальные концентрации скелетных изоформ ТнИ достигали 500 нг/мл через 6 ч после прохождения триатлона (4 км плавания, 120 км езды на велосипеде, 30 км бега), при этом средняя концентрация составила 62,2 ± 139 нг/мл [113]. Также высокие концентрации детектировали через 6 ч после скоростного спуска: медиана составляла 27,3 нг/мл (интерквартильный размах 8,5–43 нг/мл), в то время как более низкие концентрации были выявлены через 6 ч после бега с увеличением скорости: 6,6 нг/мл (3,7–9 нг/мл), и после эксцентрических сокращений четырёхглавой мышцы бедра: 6,8 нг/мл (3,1–14,9 нг/мл) [26]. Средние концентрации скелетных изоформ ТнИ в пределах 24 ч после травмы составили: 15,3 ± 2,4 нг/мл после травмы опорно-двигательного аппарата и 10,4 ± 1,8 нг/мл после травмы мягких тканей [114]. Максимальная концентрация скелетных изоформ ТнИ у больных с воспалительными миопатиями составила 516 нг/мл, а медиана – 8,6 нг/мл (интерквартильный размах 3,2–33,5 нг/мл) [115].

Исследований, посвящённых использованию скелетных ТнТ в качестве возможных маркеров мышечного повреждения, пока не опубликовано, но мы предполагаем, что, по аналогии с сердечными тропонинами И и Т, которые являются маркерами повреждения сердечной мускулатуры, скелетные изоформы ТнТ также могут быть потенциальными удобными маркерами для диагностики повреждений скелетной мышцы.

Ряд авторов также предлагает использовать бсТнС в качестве маркера повреждения скелетной мускулатуры [129]. Однако детекция ТнС будет обладать меньшей специфичностью, чем детекция скелетных изоформ ТнИ или ТнТ, так как бсТнС экспрессируется только в мышечных волокнах быстрого типа, а с/мсТнС – в волокнах медленного типа и в сердечной ткани.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ИММУНОХИМИЧЕСКУЮ ДЕТЕКЦИЮ СКЕЛЕТНЫХ ТРОПОНИНОВ

На взаимодействие антител со скелетными изоформами тропонинов могут оказывать влияние различные факторы: гомология с другими изоформами тропонинов, присутствие сплайсоформ, посттрансляционные модификации, протеолиз, связывание аутоантител и экранирование белками тропонинового комплекса. Подобные воздействия могут значительно искажать результаты проводимых измерений и должны быть учтены как при исследовании свойств данных белков, так и при разработке иммунохимических систем.

Сходство изоформ. Степень сходства изоформ составляет ~60% и для ТнИ, и для ТнТ (при сравнении наиболее длинных сплайсоформ, экспрессирующихся у взрослых людей: P45378-3 для бсТнТ, P13805-1 для мсТнТ и P45379-6 для сТнТ) (рис. 1 и 2), поэтому одна из проблем, возникающая при иммунохимической детекции скелетных тропонинов – перекрёстное взаимодействие антител с сердечной изоформой белка или со второй скелетной изоформой (в случае дифференцированного определения медленной или быстрой скелетной изоформы тропонина), что может снижать специфичность определения целевого маркера. Высокая степень гомологии тропонинов значительно уменьшает количество эпитопов, к которым возможно получить антитела для специфического определения отдельных изоформ белка. Наиболее консервативными как для ТнИ, так и для ТнТ являются С-концевые участки молекул, наиболее вариабельными – N-концевые.

Альтернативный сплайсинг ТнТ. Как уже было описано выше, скелетные изоформы ТнТ, особенно бсТнТ, представлены в мышцах человека несколькими сплайсоформами. Для выявления наибольшего количества форм белка предпочтительнее использовать антитела, специфичные к участкам, кодируемым экзонами 1–3 и 9–15. Для бсТнТ следует избегать использования антител, взаимодействующих с N-концевыми а.о. 11–38, а также с С-концевым участком 232–244 а.о., который может отличаться у разных сплайсоформ (нумерация а.о. указана для последовательности P45378-3). В случае мсТнТ следует избегать использования антител, распознающих а.о. 25–35 и 205–220 (нумерация указана для самой длинной сплайсоформы P13805-1), которые имеют отличия в разных сплайсоформах.

Фосфорилирование ТнИ и ТнТ. Фосфорилирование меняет заряд белка и может оказывать значительное влияние на взаимодействие антител и антигена.

Фосфорилирование ТнИ. Показано, что бсТнИ кролика может быть фосфорилирован in vitro киназой фосфорилазы, 3′5′-cAMP-зависимой протеинкиназой, Са2+-фосфолипид-зависимой протеинкиназой, а бсТнИ человека – AMP-активируемой протеинкиназой (AMPK) [130–134]. Были определены остатки, которые подвергаются фосфорилированию: Thr12 и Ser118 для бсТнИ кролика и Ser118 для белка человека [131, 132, 134]. Так как в последовательности бсТнИ человека так же, как и в бсТнИ кролика, присутствует остаток Thr12, не исключена возможность фосфорилирования белка человека и по данному остатку. Также было показано, что фосфорилирование in vitro ингибируется при взаимодействии с ТнС, что согласуется с данными по структуре тропонинового комплекса: оба выявленных остатка расположены в участках взаимодействия с ТнС [46, 130]. Фосфорилирование мсТнИ in vitro не было описано, однако последовательность мсТнИ включает один а.о., гомологичный сайту фосфорилирования бсТнИ: Ser118 (мсТнИ) (рис. 1).

Было показано, что изолированный из скелетных мышц кролика бсТнИ присутствует в частично фосфорилированной форме, причём степень фосфорилирования может зависеть от метода выделения белка [130, 131, 135]. Методом масс-спектрометрии в экстракте мышц человека (vastus lateralis и tibialis anterior) и экстракте мышц крысы (7 видов мышц) бсТнИ был детектирован в нефосфорилированном виде, при этом мсТнИ присутствовал как в фосфорилированной, так и в нефосфорилированной формах [78, 80]. Методом масс-спектрометрии экстракта мышц макак-резусов фосфорилированных форм скелетных ТнИ обнаружено не было [79]. Учитывая приведённые выше данные, можно предположить, что доля фосфорилированных форм скелетных изоформ ТнИ в крови будет незначительной, и, следовательно, данная модификация не окажет значительного влияния на распознавание антигена при помощи антител.

Фосфорилирование ТнТ. In vitro было показано, что бсТнТ, выделенный из скелетных мышц кролика, является субстратом для различных киназ: киназы фосфорилазы, 3′5′-cAMP-зависимой протеинкиназы, казеинкиназы 2, Са2+-фосфолипид-зависимой протеинкиназы [59, 130, 132, 133, 136–140]. Для бсТнТ кролика были выявлены три участка фосфорилирования: Ser2, Ser152 и Ser159 (они указаны для P45372-3 Uniprot). Ser2 также присутствует в бсТнТ человека, а Ser152 и Ser159 входят в состав последовательности Ala-Leu-Ser-SerP-Met-Gly-Ala-Asn-Tyr-Ser-SerP-Tyr, которая у бсТнТ человека полностью соответствует белку кролика. Исходя из этого, можно предположить возможность фосфорилирования по данным остаткам и для бсТнТ человека [132].

In vivo было показано, что выделенный из скелетных мышц кролика бсТнТ присутствует в фосфорилированной форме [130, 132]. Более того, такой белок фосфорилирован лишь по одному из трёх сайтов, выявленных in vitro: Ser2. Эти результаты согласуются с данными масс-спектрометрии белков, экстрагированных из мышечной ткани человека и различных видов животных. Для бсТнТ человека, крысы, макаки-резуса, выделенных из нескольких типов мышц, идентифицировали нефосфорилированные и монофосфорилированные формы (различных сплайсоформ) бсТнТ [78–80], при этом Ser2 был единственным сайтом фосфорилирования, определённым in vivo.

Данные по фосфорилированию мсТнТ in vitro отсутствуют. Однако в составе мсТнТ есть остаток Ser2, гомологичный Ser2 в составе бсТнТ и сТнТ, для которых показано фосфорилирование как in vitro, так и in vivo [141, 142]. Высокая вероятность фосфорилирования Ser2 мсТнТ в мышечной ткани человека подтверждена методом масс-спектрометрии [80]. Аналогичным методом обнаружили, что в скелетных мышцах человека и крысы мсТнТ представлен в преимущественно фосфорилированной форме, а в мышцах макаки-резуса – в фосфорилированной и нефосфорилированной формах [78–80].

Таким образом, можно предположить, что бсТнТ и мсТнТ попадают в кровоток в частично фосфорилированной форме. Однако в связи с тем, что сайт фосфорилирования расположен в N-концевой части молекул, он, вероятно, не будет оказывать значительного влияния на распознавание скелетных изоформ ТнТ антителами.

Глутатионилирование ТнИ. Lamb et al. показали на выделенных мышечных волокнах крысы и человека, что бсТнИ, но не мсТнИ, может подвергаться глутатионилированию [143–145]. Данная модификация затрагивает один из остатков цистеина – Сys134. Это согласуется с результатами масс-спектрометрических исследований: для скелетной мускулатуры макаки-резуса и крысы было показано наличие двух протеоформ бсТнИ: с глутатионом и без, что подтверждает наличие базового уровня глутатионилирования именно для бсТнИ [78, 79].

Протеолиз ТнИ и ТнТ. сТнИ может подвергаться N- и С-концевому протеолизу: как в некротической ткани сердца, так и в крови детектируются различные протеолизированные формы сТнИ [146, 147]. Было обнаружено, что сТнИ может быть субстратом для ряда протеаз: металлопротеиназы-2, кальпаина 1 (µ-кальпаина) и кальпаина 2 (m-кальпаина) [148–151]. Исследования протеолиза сТнИ в крови больных с инфарктом миокарда показали наличие до 11 протеолитических фрагментов различной длины [147, 152]. Ввиду высокой гомологии возможен протеолиз и скелетных изоформ ТнИ. Протеолизированные бсТнИ и мсТнИ и их фрагменты были идентифицированы в крови больных, при этом было показано, что при разных типах повреждений/заболеваний количество этих фрагментов в крови варьирует [118]. На основании полученных результатов авторы предполагают, что протеолиз происходит непосредственно в ткани, а в кровоток белки высвобождаются уже в протеолизированной форме. Однако необходимы дальнейшие исследования протеолиза скелетных изоформ ТнИ и локализации участков молекулы, в которых происходит расщепление молекул белка.

сТнТ также подвержен протеолитическому расщеплению. В апоптотических кардиомиоцитах было показано щепление сТнТ по N-концу под действием каспазы-3 с формированием фрагмента размером 25 кДа [153]. Ограниченный N-концевой протеолиз сТнТ под воздействием кальпаина 1 (µ-кальпаина) также наблюдали в ходе ишемии-реперфузии миокарда [148, 154]. В крови больных с инфарктом миокарда обнаружены как минимум 23 фрагмента сТнТ различной длины, и несколько участков протеолиза выявлены в N-концевой, центральной и C-концевой частях молекулы [155]. Для скелетных изоформ ТнТ подобные исследования ещё не были опубликованы. Для бсТнТ есть только данные по протеолитическому щеплению в мышце после сильной физической нагрузки [156]. Необходимо дальнейшее изучение форм скелетных изоформ ТнТ, присутствующих в кровотоке, и определение сайтов протеолиза.

Экранирование эпитопов в составе тропонинового комплекса. сТнИ и сТнТ присутствуют в крови больных c инфарктом миокарда в составе тройного тропонинового комплекса (ТнИ–ТнТ–ТнС), двойного тропонинового комплекса (ТнИ–ТнС) и протеолитических фрагментов ТнТ [152, 157, 158]. Несмотря на то что пока не получено экспериментальных данных о том, в каком виде скелетные тропонины высвобождаются в кровоток, можно предположить, что они будут присутствовать в крови в том числе в виде комплексов. Для иммунохимической детекции важно использовать такие антитела, которые распознают эпитопы, доступные для взаимодействия с антителами в составе всех представленных в крови форм белков. При формировании тройного комплекса С-концевые области скелетных ТнТ, ограниченные примерно 197–241 а.о. для бсТнТ и 202–261 для мсТнТ, могут быть экранированы ТнИ и ТнС. В случае скелетных изоформ ТнИ молекулами ТнТ и ТнС для взаимодействия с антителами может быть блокирована значительная часть последовательности белка: области, ограниченные примерно 2–40, 50–106, 116–131 а.о. для бсТнИ и 2–40, 51–107, 117–132 а.о. для мсТнИ. Таким образом, доступными для антител остаются небольшие участки аминокислотных последовательностей в центральных и С-концевых частях молекул ТнИ. Альтернативным подходом, позволяющим использовать антитела, специфичные к заблокированным в комплексе участкам молекул ТнИ и ТнТ, является разрушение тропониновых комплексов, присутствующих в образце, под воздействием ЭДТА [115, 116, 157].

Связывание аутоантител. Одним из факторов, оказывающих влияние на иммунохимическую детекцию сердечных тропонинов, является наличие аутоантител, которые взаимодействуют с анализируемым белком в крови. Они могут интерферировать с антителами иммунохимических тест-систем и приводить к возникновению ложноотрицательных результатов. Показано, что примерно у 10% здоровых людей в крови присутствуют аутоантитела к сТнИ [159]. Также было выявлено, что такие аутоантитела обычно специфичны к конформационным эпитопам, которые формируются при связывании ТнИ и ТнТ [160]. Исследований о наличии аутоантител к скелетным изоформам ТнИ нет, однако, учитывая высокую степень гомологии, можно предположить, что подобные иммуноглобулины также могут присутствовать в крови некоторых больных.

Учитывая все описанные выше данные, можно заключить, что антитела, специфичные к С-концевым участкам ТнИ, могут демонстрировать перекрёстное взаимодействие с другими изоформами ТнИ, в то время как центральные участки молекул могут быть экранированы ТнС и ТнТ. Влияние посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование и глутатионилирование, можно считать незначительным, в то время как роль и степень протеолиза, а также влияния аутоантител требует дальнейшего изучения. Таким образом, наиболее перспективными сайтами для иммунохимической детекции скелетных изоформ ТнИ представляются центральные части молекулы, особенно те участки, которые не экранированы другими компонентами тропонинового комплекса.

В случае ТнТ N-концевая (11–38 а.о. для бсТнТ и 25–35 а.о. для мсТнТ) и С-концевая (231–244 а.о. для бсТнТ и 205–220 а.о. для мсТнТ) части молекулы подвергаются альтернативному сплайсингу, С-концевые части (а.о. ~197–241 для бсТнТ и мсТнТ) также могут быть экранированы ТнИ и ТнС. Влияние фосфорилирования можно считать незначительным, а роль и степень N- и C-концевого протеолиза требует дальнейшего изучения. Таким образом, наиболее перспективными для иммунохимического выявления можно считать центральные участки скелетных изоформ ТнТ.

МУТАЦИИ В СКЕЛЕТНЫХ ТРОПОНИНАХ КАК ИСТОЧНИКИ ПАТОЛОГИЙ СКЕЛЕТНОЙ МУСКУЛАТУРЫ

Тропониновый комплекс играет важную роль в регуляции мышечного сокращения. Мутации в тропонинах могут приводить к изменению структуры и функциональности белка. На сегодняшний день выявлен ряд мутаций, ассоциированных с развитием таких заболеваний скелетных мышц, как артрогрипоз и конгенитальные миопатии.

Мутации в генах скелетных изоформ ТнИ. Показано, что мутации в гене TNNI2 (бсТнИ) являются одной из причин дистального артрогрипоза. Это наследуемое по аутосомно-доминантному типу заболевание, при котором поражаются суставы и снижается подвижность дистальных отделов конечностей. Все выявленные до настоящего времени мутации TNNI2 затрагивают только С-концевой участок молекулы: R156X (приводящая к экспрессии укороченной формы бсТнИ (1–156)), R162G, R162K, I165F, E167Х, K168E, R174Q, R174W, K175N, К175Х, K176Х, F178C, F178L [161–172].

Для мсТнИ (TNNI1) в настоящий момент выявлены две патогенные мутации [170, 173]. Одна из них, K175Х, расположена в той же области, что и у бсТнИ, и приводит к образованию укороченной формы мсТнИ [170]. Данная делеция ассоциирована с развитием проксимального артрогрипоза – также наследуемого по аутосомно-доминантному типу заболевания, при котором затрагиваются проксимальные суставы. Мутация в другой области мсТнИ, R37C, приводит к экспрессии мсТнИ в сердце до двух лет после рождения [173] и увеличивает риск внезапной детской смерти.

Мутации в генах скелетных изоформ ТнТ. Мутации в гене TNNT3 (бсТнТ), так же как и в TNNI2 (бсТнИ), приводят к развитию дистального артрогрипоза. Для TNNT3 было обнаружено несколько замен, затрагивающих один и тот же а.о.: R66C, R66H, R66S [171, 174–177]². Стоит также выделить мутацию в гене TNNT3 (бсТнТ), которая вызывает сразу два заболевания: дистальный артрогрипоз и немалиновую миопатию, поражающую мышечные волокна быстрого типа [178]. Эта мутация в интроне, приводящая к нарушению сплайсинга и понижению экспрессии бсТнТ, сопровождается компенсаторной гипертрофией мышечных волокон медленного типа.

Делеции в гене TNNT1 (мсТнТ) ассоциированы с немалиновой миопатией, наследуемой по аутосомно-рецессивному типу. Она проявляется в раннем детстве в виде дыхательной недостаточности, атрофии мышечных волокон медленного типа и компенсаторной гипертрофии мышечных волокон быстрого типа. В конечном счёте немалиновая миопатия приводит к смерти в детском возрасте от дыхательной недостаточности. Были обнаружены делеции Е180Х (экспрессия укороченной формы мсТнТ 1–179) и S108X (экспрессия укороченной формы мсТнТ 1–107), делеция экзонов 8 и 14, а также экспрессия укороченной формы мсТнТ 1–203 [179–182]. Эти делеции затрагивают участки взаимодействия ТнТ с тропомиозином, а также сайты связывания с ТнИ и ТнС.

Было показано, что отсутствие участков связывания тропонинов с тропомиозином при делеции E180X препятствует формированию тропонинового комплекса и его встраиванию в тонкие филаменты [183]. Если мРНК мсТнТ (1–179) ещё детектируется в мышечных волокнах, то белковая молекула мсТнТ (1–179) быстро деградирует и уже не может быть обнаружена [184]. Данный факт объясняет рецессивность мутации: при наличии одной правильной копии гена полноразмерный мсТнТ экспрессируется и встраивается в тропониновый комплекс, а экспрессирующийся мутантный укороченный мсТнТ (1–179) не обладает цитотоксичностью, так как такой вариант мсТнТ сразу подвергается деградации [185].

Мутации в генах ТнС. Мутации в гене TNNC2 (бсТнС) ассоциированы с конгенитальной миопатией, наследуемой по аутосомно-доминантному типу. Это замены D34Y и M79Y, которые расположены в I EF-руке и рядом со II EF-рукой соответственно. Они влияют на связывание с Са2+ и регуляторным доменом ТнИ, поэтому при наличии данных мутаций происходит снижение чувствительности мышцы к Ca2+ [186, 187].

В связи с тем, что мс/сТнС экспрессируется не только в медленной скелетной, но и в сердечной мускулатуре, ряд мутаций в TNNC1 (мс/сТнС), включая A8V, L29Q, A31S, C84Y, E134D, D145E, Q122AfsX30 (мутация со сдвигом рамки считывания), ассоциирован с кардиомиопатиями и сердечной дисфункцией [188–191]. У некоторых больных с кардиомиопатиями, вызванными данными заменами, также наблюдались патологии скелетной мускулатуры, однако исследований, посвящённых тому, какие именно мутации и каким образом влияют на скелетную мускулатуру, пока недостаточно [187, 192]. В экспериментах in vitro было показано, что все вышеперечисленные замены, за исключением С84Y, не оказывают влияния на фенотип и функционирование мышечных волокон медленного типа. С84Y, в свою очередь, повышает чувствительность к Са2+ так же, как и в сердечных волокнах. Описанные различия во влиянии мутации на медленные и сердечные мышечные волокна могут быть обусловлены тем, что в составе медленных мышечных волокон мс/сТнС образует комплекс с другими, медленными скелетными изоформами ТнТ и ТнИ, а не сердечными белками [193].

ТРОПОНИНЫ КАК МИШЕНИ ДЛЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Помимо источника патологий, скелетные тропонины могут выступать и в роли мишеней для лекарств, применяемых при лечении заболеваний скелетной мускулатуры. К такого рода заболеваниям относят периферические моторные нейропатии – боковой амиотрофический склероз (БАС), спинальную мышечную атрофию, заболевание Шарко–Мари–Тута – в ходе которых повреждаются моторные нейроны и нарушается передача нервных импульсов, и миастению гравис, при которой разрушаются нервно-мышечные синапсы. Нарушение иннервации скелетных мышц в конечном счёте приводит к мышечной слабости, инвалидности и высокой смертности. Одним из вероятных терапевтических подходов может быть увеличение чувствительности мышечных волокон к Ca2+ таким образом, чтобы достаточная активация достигалась даже при меньших концентрациях Ca2+. Молекула из группы первых активаторов быстрого скелетного тропонина, CK-2017357 (тирасемтив), избирательно взаимодействует с быстрым скелетным тропониновым комплексом: связывание происходит в гидрофобном кармане, образованном N-концевым доменом бсТнС и регуляторным доменом бсТнИ [194]. Показано, что связывание тирасемтива увеличивает степень сродства низкоаффинных сайтов связывания бсТнС к Ca2+, тем самым повышая чувствительность мышцы к Ca2+ [195]. Тирасемтив проявил себя многообещающе у больных с БАС, больных с миастенией гравис, и исследования даже дошли до третьей фазы клинических испытаний, однако были приостановлены в связи с выявлением побочных эффектов [196–202]. Сейчас разрабатывают и другие лекарственные средства из группы активаторов быстрого скелетного тропонина: СК-2127107, СК-2066260 и релдесемтив [203–206]. Наиболее успешно проявил себя релдесемтив – молекула второго поколения, полученная путём химической оптимизации тирасемтива и обладающая схожим механизмом действия [207, 208]. Релдесемтив дошёл до второй фазы клинических испытаний при терапии спинальной мышечной атрофии и до третьей – при терапии БАС, однако испытания на пациентах с БАС были прекращены в связи с отсутствием терапевтического эффекта [206, 209, 210]. Несмотря на то что мс/сТнС экспрессируется не только в сердце, но и в мышечных волокнах медленного типа, исследования регуляторов чувствительности мс/сТнС к Са2+ изучались в основном в контексте изучения функций сердца. Эти лекарственные молекулы влияют на чувствительность мышечных волокон Са2+ путём изменения аффинности N-концевого домена мс/сТнС к Са2+. Один из наиболее широко изученных кальциевых сенсибилизаторов, левосимендан, связывается с гидрофобным карманом мс/сТнС и регуляторным доменом сТнИ – так же, как и тирасемтив [211]. Левосимендан (лицензирован в некоторых странах) и его аналоги предназначены для лечения тяжёлой хронической сердечной недостаточности.

В отличие от вышеперечисленных лекарственных молекул, ингибитор тропонина W7 уменьшает чувствительность к Са2+ и может быть использован для лечения метаболических кардиомиопатий, вызванных длительным алкалозом, или врождённых кардиомиопатий [212, 213]. W7 также связывается с гидрофобным карманом, образованным N-концевым доменом мс/сТнС и регуляторным доменом сТнИ, однако, в отличие от левосимендана, он сдвигает регуляторный домен сТнИ от его сайта связывания с мс/сТнС, тем самым снижая чувствительность мышцы к Са2+ [213, 214].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Патологии скелетной мускулатуры оказывают негативное влияние на функционирование всего организма. Они могут быть вызваны механическими повреждениями мышц, миопатиями и другими заболеваниями, сопровождающимися мышечной атрофией, а также рабдомиолизом. Определение концентрации белков-маркеров, которые высвобождаются в кровоток при повреждении мышечных волокон, является удобным методом диагностики и мониторинга таких патологий. Скелетные тропонины – потенциальные маркеры дисфункции скелетных мышц, включая различные миопатии, травмы, повреждения, вызванные интенсивной физической нагрузкой, а также могут служить для оценки степени тяжести мышечных дистрофий и определения миотоксичности лекарств.

Структура и свойства тропонинов могут оказывать влияние на их детекцию в крови человека с использованием антител. К основным факторам, способным воздействовать на иммунохимическую детекцию данных белков в клинических образцах, можно отнести сходство аминокислотных последовательностей скелетных и сердечной изоформ ТнИ и ТнТ, альтернативный сплайсинг ТнТ, посттрансляционные модификации (фосфорилирование и глутатионилирование), протеолиз, экранирование эпитопов на поверхности ТнИ и ТнТ в составе тропонинового комплекса, а также связывание аутоантител. В связи с этим необходим тщательный отбор моноклональных антител для разработки иммунных анализов для достоверного количественного измерения уровней скелетных тропонинов.

Определённые мутации в скелетных тропонинах связаны с развитием артрогрипоза и конгенитальных миопатий. Кроме того, данные белки могут быть использованы в качестве мишеней для лечения таких заболеваний, как моторные нейропатии и миастения гравис.

Вклад авторов. А.П. Богомолова, И.А. Катруха – сбор и анализ данных, подготовка иллюстраций, написание основного текста рукописи, редактирование рукописи; И.А. Катруха – разработка концепции и руководство работой.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо проведённых авторами исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

 

¹ Для всех белков в этом обзоре нумерация начинается с N-концевого метионина.

² Стоит отметить, что при указании этой мутации авторы исследований используют последовательность бсТнТ, соответствующую P45378-2, которая на 3 а.о. короче используемой в этом обзоре последовательности P45378-3. Поэтому в статьях данная замена фигурирует как R63.

About the authors

A. P. Bogomolova

Lomonosov Moscow State University; Hytest Ltd.

Author for correspondence.
Email: bogomolova.agnessa@yandex.ru

Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University

Russian Federation, 119234 Moscow; Turku, Finland

I. A. Katrukha

Lomonosov Moscow State University; Hytest Ltd.

Email: bogomolova.agnessa@yandex.ru

Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University

Russian Federation, 119234 Moscow; Turku, Finland

References

Supplementary files