RNA-binding protein Sam68 effects poly(ADP-ribose) polymerase 1 activity

Full Text

Принятые сокращения: ТМАО – триметиламиноксид; PAR – поли(ADP-рибоза); PAR-илирование – поли(ADP-рибозил)ирование; PARP1 – поли(ADP-рибоза)-полимераза 1; Sam68 – РНК-связывающий белок 1, содержащий домен KH и ассоциированный с сигнальной трансдукцией; YB-1 – Y-бокс-связывающий белок 1.

ВВЕДЕНИЕ

Поддержание стабильности генетической информации живых организмов во многом обусловлено эффективностью функционирования систем репарации ДНК [1]. Одной из немедленных реакций в клетке в ответ на генотоксический стресс, приводящий к повреждению ДНК, является синтез поли(ADP-рибозы) (PAR) в ядре [2]. Данная реакция катализируется поли(ADP-рибоза)-полимеразами (PARP1 и PARP2), использующими в качестве субстрата никотинамидадениндинуклеотид (NAD+). Полимер PAR ковалентно присоединяется к белкам, в том числе к PARP1, PARP2 и гистонам [3]. Такая модификация играет важную роль в структурной организации хроматина и в регуляции функциональной активности белков, участвующих в репарации ДНК и других процессах. Поли(ADP-рибозил)ирование (PAR-илирование) приводит к эффективной диссоциации PAR-илированных белков из их комплексов с ДНК в хроматине. Кроме того, синтез PAR можно рассматривать как сигнал, привлекающий белки-партнеры к месту повреждения ДНК. PARP1 является наиболее изученным ферментом семейства поли(ADP-рибоза)-полимераз. PARP1 синтезирует до 90% всей клеточной поли(ADP-рибозы) в ответ на повреждение ДНК и считается одним из ключевых регуляторов процесса репарации ДНК, а также других процессов, определяющих стабильность генома [4]. Изучение белков, участвующих в модуляции активности PARP1, является важным направлением молекулярной биологии, поскольку установление детального механизма регуляции активности поли(ADP-рибоза)-полимераз и процессов репарации ДНК является важным для понимания причин развития онкологических и нейродегенеративных заболеваний [5].

В настоящее время РНК-связывающие белки рассматриваются как участники процессов поддержания стабильности генома. Было показано, что многие РНК-связывающие белки могут быть PAR-илированы или взаимодействовать с PAR в условиях генотоксического стресса [6]. Ключевую роль в распознавании PAR играют внутренне неупорядоченные области (IDR; Intrinsically Disordered Region) РНК-связывающих белков, содержащие в своем составе повторы аргинина/серина (R/S-box), аргинина/глицина (RGG-box), а также участки, богатые остатками аргинина/лизина (R/K-богатые домены), глицина (G-богатые домены), глутамина/глицина/серина/тирозина (QGSY-богатые домены) [7]. В системе in vitro было показано, что многие РНК-связывающие белки, содержащие неупорядоченные области, склонны к самоассоциации и агрегации. Эксперименты с использованием культур клеток показали, что локализация отдельных РНК-связывающих белков в сайтах геномных повреждений индуцируется синтезом PAR [8]. Высокая локальная концентрация РНК-связывающих белков в местах повреждения ДНК приводит к организации немембранных компартментов. Предполагается, что компартментализация поврежденной ДНК способствует привлечению ферментов репарации к месту повреждения и более эффективному протеканию процесса репарации [9]. В большинстве современных работ описывается компартментализация процесса репарации ДНК с участием РНК-связывающих белков, индуцируемая синтезом PAR в месте повреждения ДНК [10]. Кроме того, РНК-связывающие белки способны регулировать активность PARP1, как это было установлено для Y-бокс-связывающего белка 1 (YB-1). Было обнаружено, что YB-1 способен регулировать активность PARP1 посредством формирования тройного комплекса YB-1•PARP1•ДНК или через взаимодействие YB-1 с авто-PAR-илированной формой PARP1. Выступая в качестве эффективного акцептора в реакции PAR-илирования, YB-1 повышает число оборотов реакции, катализируемой PARP1, и увеличивает общий выход реакции PAR-илирования. Неструктурированный C-концевой домен YB-1 определяет сродство YB-1 к поврежденной ДНК и PAR и играет ключевую роль в регуляции активности PARP1 [11–14]. Механизмы стимуляции PARP1, обнаруженные для YB-1, могут иметь место и в случае других РНК-связывающих белков, для которых уже установлена возможность их PAR-илирования и/или взаимодействия с PAR.

В недавних исследованиях было показано, что внутренне неупорядоченный РНК-связывающий белок Sam68, содержащий домен KH и ассоциированный с сигнальной трансдукцией (Src-associated substrate during mitosis of 68 kDa) способен регулировать синтез PAR ферментом PARP1, модулируя уровень синтеза этого полимера как в системе in vitro, так и в системе ex vivo [15]. Было показано, что в клетках, нокаутных по гену Sam68, наблюдался более низкий уровень синтеза PAR после повреждения клеток γ-облучением [15]. Масс-спектрометрическими методами Sam68 был идентифицирован как мишень PAR-илирования в клетке [16]. Однако, несмотря на то что для Sam68 была показана важная роль в регуляции активности PARP1 при генотоксическом стрессе, детальный механизм влияния Sam68 на синтез PAR не был установлен.

В данной работе был сконструирован вектор для наработки белка Sam68 в системе экспрессии Escherichia coli. С использованием полученной плазмидной конструкции была проведена наработка рекомбинантного Sam68 в препаративных количествах и подобраны оптимальные концентрации хаотропных агентов (мочевины) и осмолитов (аргинина) для повышения растворимости этого белка в водных растворах. В системе in vitro впервые показано, что Sam68 является мишенью PAR-илирования и стимулирует автомодификацию PARP1. Впервые оценена эффективность комплексообразования Sam68 с поврежденной ДНК и PAR и предложен механизм стимуляции активности PARP1 РНК-связывающим белком Sam68.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы следующие материалы и реактивы: N,N′-метиленбисакриламид, трис(гидроксиметил)аминометан (Tris) («Amresco», США); акриламид, бисакриламид («AppliChem», Германия); мочевина, персульфат аммония (ПСА) («PanReac», Испания); додецилсульфат натрия (Ds-Na) («Fluka», Швейцария); смесь фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25/24/1), никотинамидадениндинуклеотид (NAD+), среда LB Broth («Sigma-Aldrich», США); наборы для проведения ПЦР («Биолабмикс», Россия); эндонуклеазы рестрикции KpnI, SalI, SfoI («Сибэнзим», Россия); клетки E. coli штаммов BL21(DE3), BL21(DE3)GeneX, BL21(DE3)pLysS, Rosetta(DE3), Rosetta(DE3)pLysS («Merck», США); ДНКаза I («New England Biolabs», США); [α32P]ATP с удельной активностью 1000 Ки/ммоль (Лаборатория биотехнологии ИХБФМ СО РАН, Россия). Остальные использованные реактивы и компоненты буферов были отечественного производства и имели квалификацию о.с.ч. и ч.д.а.

В работе были использованы синтетические олигодезоксирибонуклеотиды (табл. 1) производства Лаборатории медицинской химии (ИХБФМ СО РАН, Россия) или «Биоссет» (Россия).

 

Таблица 1. Последовательности олигодезоксирибонуклеотидов, использованных в работе

Обозначение	Последовательность (5′→3′)
An1*	GGAAGACCCTGACGTTTCCCAACTTTATCGCCF
An2	GGCGATAAAGTTGGG
An3**	pAAACGTCAGGGTCTTCC
pQE30-Sam68-KpnI	AGATCTGGTACCATGCAGCGCCGGGACGACCC
pQE30-Sam68-SalI	AGATCTGTCGACATAACGTCCATATGGGTGC
pBADM41-Sam68-For	ATGCAGCGCCGGGACGACCC
pBADM41-Sam68-Rev	ATAACGTCCATATGGGTGCTCTCTG

Примечание. * F – 5(6)-карбоксифлуоресцеин (FAM); ** p – фосфат.

 

Обратная транскриптаза вируса лейкемии мышей Молони (ОТ-MMLV) и ДНК-лигаза фага Т4 были любезно предоставлены д.б.н. Ходыревой С.Н. (ИХБФМ СО РАН). Плазмиды pQE30 и pBADM41 были любезно предоставлены к.б.н. Оскорбиным И.П. (ИХБФМ СО РАН). Никотинамидмононуклеотид-аденилилтрансфераза (NMNAT) была любезно предоставлена к.х.н. С.И. Шрамм (Институт молекулярной генетики РАН).

Секвенирование плазмидных ДНК по методу Сэнгера проводили в ЦКП Геномика ИХБФМ СО РАН, Россия.

Получение ДНК-субстратов. ДНК-дуплекс (FAM-Nick) получали гибридизацией олигонуклеотида An1, содержащего остаток 5(6)-карбоксифлуоресцеин (FAM) c олигонуклеотидами An2, An3 в молярном соотношении 1,5/1/1. Реакционную смесь инкубировали в течение 5 мин при 95 °С, а затем медленно охлаждали до комнатной температуры.

Выделение суммарной РНК из клеток HeLa. Культуру клеток HeLa вели на чашке диаметром 10 см до состояния монослоя в среде DMEM («Thermo Fisher Scientific», США). Полученную культуру клеток промывали 5 мл PBS («Thermo Fisher Scientific»), ресуспендировали в 1 мл TriZol («Thermo Fisher Scientific»), добавляли 200 мкл хлороформа, инкубировали 5 мин при комнатной температуре и центрифугировали 15 мин (16 000 g при 4 °C). После центрифугирования отбирали верхнюю водную фазу и переосаждали РНК изопропиловым спиртом. Осажденную РНК растворяли в 200 мкл воды и добавляли равный объем смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25/24/1). После центрифугирования отбирали водную фазу и переосаждали РНК этанолом.

Получение кДНК Sam68 из суммарной РНК клеток HeLa. Реакционную смесь объемом 10 мкл, содержащую 4 мкг суммарной РНК из клеток HeLa и 100 нмоль oligo dT, инкубировали 2 мин при 70 °C. Затем, к данной смеси добавляли буфер для обратной транскипции («Биолабмикс») и 1 мкл ОТ-MMLV (100 ед. активности/мкл). Реакцию проводили в течение 1 ч при 42 °C. Полученный препарат суммарной кДНК клеток HeLa был использован для наработки препаративного количества кДНК белка Sam68 методом ПЦР.

Получение плазмид pQE30-Sam68 и pBADM41-Sam68. Целевую плазмиду получали лигированием в 10 мкл смеси, содержащей 5 ед. акт. ДНК-лигазы фага Т4 и лигазный буфер (50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 10 мМ MgCl₂, 10 мМ DTT, 1 мМ ATP), 50 нг вектора pQE30, гидролизованного эндонуклеазами рестрикции KpnI и SalI, или pBADM41, гидролизованного SfoI (эндонуклеазы, генерирующей фрагменты ДНК с тупыми концами), и 75 нг ПЦР-продукта Sam68, полученного с праймерами pQE30-Sam68-KpnI/pQE30-Sam68-SalI или pBADM41-Sam68-For/pBADM41-Sam68-Rev. ПЦР-продукт Sam68, полученный с праймерами pQE30-Sam68-KpnI/pQE30-Sam68-SalI, предварительно гидролизовали эндонуклеазами рестрикции KpnI и SalI. Смесь инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Методом секвенирования по Сэнгеру анализировали полученные плазмидные ДНК на наличие ошибок. Проверка последовательностей целевой вставки не выявила ошибок в нуклеотидной последовательности.

Культивирование клеток в системе автоиндукции по Штудиеру. В питательную среду, содержащую 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 50 мМ Na₂HPO₄, 50 мМ KH₂PO₄, 25 мМ (NH₄)₂SO₄, 2 мМ MgSO₄, 0,5% глицерина, 0,05% глюкозы, 0,2% лактозы и селектирующий антибиотик, добавляли трансформированные плазмидой pQE30-Sam68 клетки E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)GeneX, BL21(DE3)pLysS, Rosetta(DE3), Rosetta(DE3)pLysS с последующим наращиванием (18 ч, 37 °C) при перемешивании (200 об./мин) до стационарной плотности клеточной культуры [17].

Вестерн-блот анализ. Анализируемые образцы, полученные после лизиса клеток E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)GeneX, BL21(DE3)pLysS, Rosetta(DE3), Rosetta(DE3)pLysS, в буфере Laemmli, содержащем 50 мМ Tris-HCl (pH 6,8), 100 мМ 2-меркаптоэтанола, 1% Ds-Na, 10% глицерина, 0,01% бромфенолового синего, разделяли с помощью электрофореза в 10%-ном Ds-Na-ПААГ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США) в системе TurboBlot («Thermo Fisher Scientific») в течение 20 мин при силе тока 1,3 мА/см2 геля и напряжении 25 В. После этого нитроцеллюлозную мембрану выдерживали в 5%-ном обезжиренном сухом молоке, растворенном в буфере TBS, содержащем 50 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 150 мМ NaCl, в течение 1 ч и затем инкубировали в течение ночи при 4 °С со специфичными антителами против гексагистидиновой (His₆) последовательности («Abcam», США), разбавленными до титра 1 : 1000 в буфере TBS. Мембрану отмывали 3 раза по 5 мин буфером TBST, содержащим 50 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 150 мМ NaCl, 0,1% (v/v) Tween 20, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с конъюгатами антител против IgG мыши с пероксидазой хрена («Abcam») (разбавленными в TBS до титра 1 : 50 000). Мембрану отмывали 3 раза по 5 мин буфером TBST, затем – 3 раза по 5 мин в буфере TBS и инкубировали с хемолюминесцентным субстратом пероксидазы хрена SuperSignal West Pico Substrate («Thermo Fisher Scientific»). Положение анализируемых полос определяли экспозицией нитроцеллюлозной мембраны с использованием системы гель-документирования Amersham Imager 600 («GE», США).

Выделение белка Sam68. Клетки E. coli, трансформированные плазмидой pQE30-Sam68, ресуспендировали в 50 мл буферного раствора, содержащего 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 10% глицерина, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ PMSF, 1 мМ бензамидина. После инкубации на льду в течение 20 мин к смеси добавляли 50 мл буферного раствора для лизиса клеток, содержащего 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 2 М NaCl, 2% NP-40, 10% глицерина, 7 мМ 2-меркаптоэтанола. Полученную суспензию обрабатывали в ультразвуковом дезинтеграторе («Bandelin», Германия) при 40 кГц в течение 30 мин с циклом работы: пауза – 45 с; обработка – 15 с, с охлаждением до 4 °C. Полученный лизат центрифугировали 30 мин при 30 000 g и 4 °C («Beckman Coulter Inc.», США). Осадок ресуспендировали в 50 мл буфера, содержащего 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 1 М мочевины, 0,2 М NaCl, 10% глицерина, 0,1% NP-40, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, и инкубировали в течение 1 ч при 4 °C при постоянном перемешивании. После инкубации полученный раствор центрифугировали (30 мин, 30 000 g при 4 °C). Осадок растворяли в 50 мл буфера, содержащего 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 8 М мочевины, 0,2 М NaCl, 10% глицерина, 0,1% NP-40, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, добавляли протамин сульфат до конечной концентрации 1 г/литр и инкубировали в течение 30 мин при 4 °C при постоянном перемешивании. Полученный раствор центрифугировали (30 мин, 30 000 g при 4 °C). Супернатант наносили на колонку (1 мл), содержащую в качестве сорбента Ni-NTA («Bio toolomics», Великобритания).

Колонку уравновешивали буфером А, содержащим 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 8 М мочевины, 0,2 М NaCl, 10% глицерина, 0,1% NP-40, 2 мМ 2-меркаптоэтанола, 20 мМ имидазола. Элюцию белка проводили градиентом 20–500 мМ имидазола в буфере А. Полученные фракции анализировали с помощью электрофореза в 10%-ном Ds-Na-ПААГ.

Фракции целевого белка, содержащие наименьшее количество примесей, концентрировали с использованием фильтров Vivaspin 10K MWCO («Sartorius», Германия). Проводили частичную замену буфера в получившемся препарате путем разбавления белка буфером, содержащим 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 8 М мочевины, 0,5 М NaCl, 0,1% NP-40, 1 мМ ДТТ, с последующей ультрафильтрацией.

Полученный препарат белка Sam68 последовательно диализовали против буферных растворов, содержащих 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 М NaCl, 0,1% NP-40, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 4 или 2, или 1, или 0,5 М мочевины, в течение 4 ч при 4 °С при постоянном перемешивании.

Синтез радиоактивного NAD⁺ и полимера ADP-рибозы. Синтез [32Р]-меченого NAD+ проводили в реакционной смеси, содержащей 25 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 20 мМ MgCl₂, 2 мМ β-никотинамидмононуклеотида, 1 мМ ATP, 0,5 мКи [α-32P]ATP и 5 мг/мл никотинамидмононуклеотид-аденилилтрансферазы (NMNAT), в течение 1 ч при 37 °С. Фермент NMNAT инактивировали в течение 10 мин при 65 °С, денатурированный фермент осаждали центрифугированием (12 000 g, 10 мин при 4 °С). Синтез [32P]-меченой поли(ADP-рибозы) ([32P]PAR) проводили в реакционной смеси, содержащей 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 40 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 5 мМ MgCl₂, 100 нМ ДНК (FAM-Nick), 200 нМ PARP1 и 10 мкМ NAD+ (0,4 мкКи [32Р]-меченого NAD+). Реакционную смесь инкубировали в течение 30 мин при 37 °С. Далее, реакционную смесь обрабатывали ДНКазой I (0,1 ед./мкл) в течение 10 мин при 37 °С. Реакцию щелочного гидролиза PAR, ковалентно связанной с PARP1, инициировали добавлением NaOH до концентрации 0,1 М с последующей инкубацией смеси при 37 °C в течение 40 мин. Реакцию останавливали добавлением равного объема 0,1 М HCl.

Белки удаляли фенольной экстракцией, используя смесь фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25/24/1), PAR осаждали добавлением этанола с последующей инкубацией в течение 1 ч при −20 °C. Осадок растворяли в воде. Препарат радиоактивно меченной PAR анализировали гель-электрофорезом в денатурирующем 20%-ном ПААГ с последующей радиоавтографией. Концентрацию [32P]-меченого PAR оценивали по количеству включенной [32P]ADP-рибозы с учетом интенсивности сигнала и концентрации [32P]NAD+.

Анализ активности PARP1. Начальную скорость синтеза PAR в реакции, катализируемой PARP1 в присутствии или при отсутствии Sam68, определяли, исходя из кинетики включения [32P]NAD+ в синтезируемый полимер ADP-рибозы. Реакционные смеси содержали 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 40 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 100 мкг/мл БСА, 0,5 М мочевины, 10 мМ ЭДТА, 100 нМ PARP1, 0,5–3 мкМ Sam68 и 0,5 OD₂₆₀/мл активированной ДНКазой I ДНК тимуса теленка (ДНК_акт) («Sigma-Aldrich»). Реакцию синтеза PAR инициировали добавлением NAD+ до конечной концентрации 20 мкМ (0,4 мкКи [32Р]-меченого NAD+) и проводили в течение 20 мин при температуре 30 °С, отбирая аликвоты через 1, 5, 10 и 20 мин. Реакцию останавливали перенесением аликвот реакционной смеси на бумажный фильтр Whatman (1 см × 1 см), пропитанный 10%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Неизрасходованный NAD+ удаляли путем промывки фильтров 3 раза по 5 мин в 5%-ной ТХУ, затем – однократно в 90%-ном этаноле для удаления остатков ТХУ. Перед определением радиоактивности образцов фильтры высушивали на воздухе.

Количественную оценку интенсивности синтеза PAR определяли по суммарной радиоактивности продуктов реакции радиоавтографией с последующим анализом в программе Quantity One. На основании полученных данных строили график зависимости времени реакции PAR-илирования (t) от количества синтезированной поли(ADP-рибозы) в программе Origin с использованием уравнений (1)–(3):

[P] = [Pmax] × (1 − e−kt), (1)

V = d[P] / dt = k × [Pmax] × e−kt, (2)

V₀ = d[P] / dt = k × [Pmax]; t = 0, (3)

где Pmax – максимальная концентрация продукта синтеза при t∞, t – время, k – константа скорости первого порядка. Рассчитанные кинетические параметры [Pmax] и k были использованы для определения начальной скорости реакции (уравнение (3)).

Анализ уровня модификации PARP1 и Sam68 проводили с помощью гель-электрофореза в 10%-ном Ds-Na-ПААГ по Laemmli [18].

Исследование взаимодействия Sam68 с ДНК и PAR. Связывание белков с поврежденной ДНК детектировали по изменению анизотропии флуоресценции FAM-меченой ДНК (FAM-Nick), содержащей одноцепочечный разрыв [19]. Реакционные смеси, содержащие 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 40 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 100 мкг/мл БСА, 0,5 М мочевины, 0–5 мкМ Sam68, 100 нМ PARP1 и 10 нМ ДНК (FAM-Nick), инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Измерения интенсивности флуоресценции образцов проводили в 384-луночном планшете («Corning», США) с использованием микропланшетного флуориметра CLARIOstar («GMBLabtech GmbH», Германия). Количественную обработку экспериментальных данных выполняли в программе MARS Data analysis («GMB LabtechGmbH», Германия) [19]. Зависимость изменения анизотропии флуоресценции от концентрации белка была обработана с использованием уравнения (4):

F = F₀ + (F_∞ − F₀) / [1 + (EC₅₀ / C)n], (4)

где F₀, F и F_∞ – интенсивность флуоресценции раствора ДНК (FAM-Nick) при отсутствии белка, в присутствии белка в данной (С) и насыщающей концентрации соответственно; EC₅₀ – концентрация белка, при которой F − F₀ = (F_∞ − F₀) / 2; n – коэффициент Хилла.

Связывание Sam68 с PAR анализировали методом задержки в геле. Реакционные смеси, содержащие 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 40 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 100 мкг/мл БСА, 500 мМ мочевины, 10 нМ [32P]-меченой PAR, 0–5 мкМ Sam68, инкубировали при 37 °С в течение 5 мин. Затем в реакционные смеси добавляли буфер нанесения, содержащий 20 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 25% глицерина, 0,01% бромфенолового синего, и проводили электрофорез в неденатурирующих условиях в 5%-ном ПААГ при 4 °С с последующей радиоавтографией.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение рекомбинантного белка Sam68. Последовательность Sam68 была клонирована в вектор pQE30 для прокариотической системы экспрессии. Выбранная конструкция содержит в своем составе гексагистидиновую последовательность (His-tag), расположенную в N-концевой части относительно клонируемой белковой последовательности, и кодирует рекомбинантный His-tag-Sam68 [20]. Для анализа уровня экспрессии использовали несколько штаммов E. coli: BL21(DE3) (базовый штамм для наработки белка), BL21(DE3)GeneX (штамм со сниженной наработкой фоновых белков), BL21(DE3)plysS (штамм с контролем экспрессии целевого гена), Rosetta(DE3) (штамм, содержащий плазмиду c генами некоторых тРНК человека), Rosetta(DE3)plysS (штамм, содержащий плазмиду c генами некоторых тРНК человека и контролем экспрессии целевого гена), Rosseta(DE3)GamiB (штамм, содержащий плазмиду c геном тиоредуктазы), и проводили подбор условий экспрессии Sam68. Экспрессия целевого белка в клетках была визуально обнаружена при использовании штамма Rosetta(DE3)pLysS. Дополнительно был проведен анализ присутствия белка Sam68 в бактериальных лизатах методом вестерн-блот-анализа с использованием антител, специфичных к последовательности His-tag (рис. 1).

 

Рис. 1. Анализ экспрессии His-tag-Sam68 в лизате различных штаммов-продуцентов методом денатурирующего гель-электрофореза в 10%-ном Ds-Na-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси R-250 (а) или методом вестерн-блота (б). Дорожки: 1 и 14 – маркер молекулярных масс («Bio-Rad», США); 2 и 3 – штамм BL21(DE3) до и после индукции; 4 и 5 – штамм BL21(DE3)GeneX до и после индукции; 6 и 7 – штамм BL21(DE3)pLysS до и после индукции; 8 и 9 – штамм Rosetta(DE3) до и после индукции; 10 и 11 – штамм Rosetta(DE3)pLysS до и после индукции; 12 и 13 – штамм Rosetta(DE3)GamiB до и после индукции

 

Штамм E. coli Rosetta(DE3)pLysS и условия культивирования, оптимизированные в ходе выполнения предыдущего эксперимента, были использованы для наработки препаративного количества биомассы и последующего выделения рекомбинантного белка (рис. 2). Однако данный белок при экспрессии накапливался в клетках в форме телец включения. Включение в состав белка аффинных меток, таких как глутатион S-трансфераза (GST), мальтоза-связывающий белок (MBP) или малый убиквитин-подобный белок (SUMO), часто способствует повышению растворимости рекомбинантных белков в водных растворах [20]. Поэтому последовательность гена Sam68 клонировали в вектор pBADM, кодирующий GST-Sam68. Согласно анализу количества белка GST-Sam68, содержащегося в растворимой и нерастворимой фракциях после лизиса клеток Rosetta(DE3)pLysS (рис. П1 в Приложении), основная масса белка GST-Sam68, так же как и в случае с His-tag-Sam68, находилась в тельцах включения. Поэтому для дальнейшего исследования был выбран His-tag-Sam68.

 

Рис. 2. При экспрессии в клетках E. coli Sam68 накапливается в виде телец включения. а – Анализ содержания His-tag-Sam68 в растворимой и нерастворимой фракциях методом денатурирующего гель-электрофореза в 10%-ном Ds-Na-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси R-250. Дорожки: 1 и 8 – маркер молекулярных масс («Bio-Rad»); 2 – растворимая фракция после центрифугирования лизированных клеток; 3 – лизат штамма продуцента Rosetta(DE3)pLysS; 4 – растворимая фракция в 1 М мочевине после центрифугирования лизированных клеток; 5 – нерастворимая фракция; 6 – растворимая фракция в 8 М мочевине; 7 – нерастворимая фракция после обработки лизата клеток 8 М мочевиной. б – Анализ содержания белка после хроматографии на колонке с Ni-NTA. Дорожки: 1 – маркер молекулярных масс; 2 – 0,1 мкг; 3 – 0,2 мкг; 4 – 0,3 мкг; 5 – 0,4 мкг; 6 – 0,5 мкг; 7 – 1 мкг белка, полученные после элюции с Ni-NTA

 

Оценка растворимости белка Sam68. Для изучения функциональной активности Sam68, в частности, его взаимодействие с PAR, ДНК или влияние на активность PARP1, необходимо было подобрать условия рефолдинга, то есть перевод Sam68 из нерастворимой в растворимую форму. В состав белка Sam68 входит структурированный домен STAR и многочисленные неструктурированные области, состоящие из повторяющихся мотивов, богатых пролином (P0–P5), аргинином/глицином (ди-RGG, ди-RG и три-RG) [21], поэтому Sam68, как и многие РНК-связывающие белки, содержащие неупорядоченные домены, склонен к агрегации [22]. Для поддержания неструктурированных белков в растворимом состоянии используются соединения, которые препятствуют агрегации белков. Эти соединения можно объединить в следующие классы: хаотропные агенты (мочевина, NaI), космотропы (NaCl, KCl, MgSO₄) и осмолиты (глицерин, триметиламиноксид (ТМАО), аргинин) [23]. Наиболее часто использующимся реагентом для работы с внутренне неупорядоченными белками является мочевина, которая препятствует образованию межмолекулярных водородных связей [23]. Была проведена оценка растворимости Sam68 в зависимости от концентрации мочевины в растворе. Видно, что Sam68 слабо растворим в буферных растворах с концентрацией мочевины ниже 2 М (рис. 3).

 

Рис. 3. Анализ растворимости Sam68 в мочевине методом денатурирующего гель-электрофореза в 10%-ном Ds-Na-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси R-250. Реакционные смеси содержали 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 200 мМ NaCl, 0,1% NP-40, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мкМ Sam68 и мочевину в соответствующей концентрации (125 мМ–8 М)

 

Другими соединениями, которые широко используются для ингибирования агрегации белков, являются аминокислота аргинин и ТМАО, относящиеся к классу осмолитов [23]. Аргинин взаимодействует с ароматическими и заряженными аминокислотными остатками в составе неупорядоченных участков белка за счет π-катионных взаимодействий и образования солевых мостиков соответственно. Взаимодействия между молекулами аргинина приводят к образованию кластеров, которые стерически ингибируют белок-белковые взаимодействия [24]. ТМАО применяется при исследованиях фолдинга белков для уменьшения денатурирующего эффекта мочевины. ТМАО образует комплекс с мочевиной за счет гидрофобных взаимодействий и множественные ионные взаимодействия между пептидным остовом и боковыми аминокислотными радикалами белка, тем самым исключая молекулы мочевины из взаимодействия с белком [25].

Оценка совместного влияния мочевины и аргинина или мочевины и ТМАО на растворимость белка Sam68 показала, что присутствие аргинина в концентрации больше 100 мМ в реакционной смеси значительно увеличивает растворимость Sam68, а при концентрации аргинина 300 мМ практически полностью восстанавливается растворимость Sam68 в водных растворах с низкой концентрацией мочевины (150 мМ) (рис. 4).

 

Рис. 4. Анализ растворимости Sam68 при низкой концентрации мочевины (150 мМ) в присутствии аргинина (а) или TMAO (б) методом денатурирующего гель-электрофореза в 10%-ном Ds-Na-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси R-250. Реакционная смесь содержала 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 0,1% NP-40, 1 мМ ДТТ, 150 мМ мочевины, 1 мкМ Sam68 и аргинин/ТМАО в указанной концентрации. Анализировали растворимую фракцию (↑) и осадок (↓)

 

Влияние мочевины и аргинина на каталитическую активность PARP1. Для исследования влияния Sam68 на активность PARP1 необходимо подобрать подходящие условия реакции. В аналогичных работах, посвященных РНК-связывающему белку FUS, реакцию PAR-илирования проводили в присутствии 300 мМ мочевины. Такая концентрация мочевины обеспечивала растворимость FUS в растворе и не ингибировала активность PARP1 [9, 26]. Аргинин увеличивает растворимость белков в водных растворах и, кроме того, не является денатурирующим агентом [27]. Поскольку Sam68 хорошо растворяется в водных растворах, содержащих мочевину и аргинин (рис. 3 и 4), необходимо было проанализировать влияние этих соединений на активность PARP1 (рис. 5).

 

Рис. 5. Влияние мочевины (а и б) и аргинина (в и г) на каталитическую активность PARP1. а – Радиоавтограф 10%-ного Ds-Na-ПААГ, в котором проводили разделение продуктов реакции PAR-илирования в присутствии мочевины. б – Диаграмма, построенная после анализа распределения радиоактивности в геле, представленном на панели (а). Активность PARP1 при отсутствии мочевины принята за 100%. в – Радиоавтограф 10%-ного Ds-Na-ПААГ, в котором проводили разделение продуктов реакции PAR-илирования в присутствии аргинина. г – Диаграмма, построенная после анализа распределения радиоактивности в геле, представленном на панели (в). Активность PARP1 при отсутствии аргинина принята за 100%

 

Было установлено, что последовательное увеличение концентрации мочевины от 250 до 1600 мМ в реакционной смеси приводит к ингибированию реакции PAR-илирования. В случае использования концентрации мочевины в диапазоне 100–400 мМ наблюдалось незначительное снижение активности PARP1, тогда как при концентрации мочевины выше 800 мМ активность PARP1 была практически полностью подавлена. При концентрации аргинина больше 50 мМ в реакционной смеси наблюдается значительное ингибирование активности PARP1, тогда как эффект аргинина на растворимость Sam68 наблюдался при концентрации больше 100 мМ. Таким образом, аргинин оказывает сильное ингибирующее действие на активность PARP1 в условиях поддержания Sam68 в растворимом состоянии. Поэтому для дальнейшего изучения влияния Sam68 на реакцию PAR-илирования были выбраны условия проведения реакции только в присутствии 500 мМ мочевины. При такой концентрации мочевины наблюдается лишь слабое ингибирование активности PARP1 при сохранении Sam68 в растворимой форме (рис. 3 и 5).

Влияние белка Sam68 на реакцию поли(ADP-рибозил)ирования. Ранее было показано, что Sam68 способен регулировать синтез PAR в клетке в ответ на повреждение ДНК, индуцируемое лазерной микрорадиацией, и способен стимулировать активность PARP1 in vitro [15]. В данной работе было проведено сравнение продуктов PAR-илирования белков, которые накапливаются в реакционной смеси при отсутствии и в присутствии Sam68. Влияние Sam68 на активность PARP1 было исследовано в кинетическом режиме реакции при различных соотношениях концентраций этих белков. Была оценена скорость реакции PAR-илирования в зависимости от концентрации Sam68. Из рис. 6, а видно, что в присутствии Sam68 происходит повышение уровня синтеза PAR. При отсутствии Sam68 реакция выходит на плато через 10 мин, а в присутствии Sam68 накопление PAR происходит и после 10 мин реакции. Кроме того, Sam68 подвергается PAR-илированию и стимулирует авто-модификацию PARP1 (рис. 6, б). Стоит отметить, что при увеличении концентрации Sam68 не наблюдалось значительного увеличения транс-PAR-илирования Sam68 (рис. 6, б). Кроме того, Sam68 не оказывает заметного влияния на начальную скорость синтеза PAR (табл. 2).

 

Рис. 6. Sam68 стимулирует активность PARP1. а – Кинетика уровня синтеза PAR в присутствии различных концентраций Sam68. Pеакцию синтеза PAR проводили с использованием [32P]NAD+ и останавливали перенесением аликвот реакционной смеси на бумажный фильтр Whatman, пропитанный ТХУ. На графиках приведены средние значения ± стандартные отклонения для трех независимых экспериментов. б – Анализ авто-PAR-илирования PARP1 и транс-PAR-илирования Sam68 методом денатурирующего гель-электрофореза. Радиоавтограф 10%-ного Ds-Na-ПААГ, в котором проводили разделение продуктов реакции PAR-илирования белков

 

Таблица 2. Начальные скорости реакции (фмоль/мин)* синтеза PAR в присутствии различных концентраций Sam68

PARP1 (без Sam68)	500 нМ Sam68	1000 нМ Sam68	2000 нМ Sam68	3000 нМ Sam68
45 ± 5	60 ± 10	100 ± 15	60 ± 10	50 ± 10

Приложение. * – Начальные скорости реакции синтеза PAR (фмоль/мин) были получены в результате обработки индивидуальных кривых (рис. 6, а), описываемых уравнением (3), и представлены как средние значения ± стандартное отклонение для трех независимых экспериментов.

 

Таким образом, Sam68, подобно другим РНК-связывающим белкам, таким как YB-1 и FUS, PAR-илируется и увеличивает суммарный выход синтеза PAR.

Определение сродства Sam68 к нуклеиновым кислотам. Взаимодействие Sam68 с ДНК или PAR, формирующейся в процессе автомодификации PARP1, может играть ключевую роль в Sam68-зависимой регуляции активности PARP1 [28]. Эксперименты по анализу взаимодействия Sam68 с PAR проводили методом задержки в геле (рис. 7, а).

 

Рис. 7. Связывание PAR белком Sam68. а – Радиоавтограф нативного 5%-ного ПААГ, в котором проводилось разделение комплексов Sam68•PAR. б – Относительный уровень связывания Sam68 с PAR, оцененный по данным анализа электрофореграммы, представленной на панели (а). Сродство (EC₅₀) Sam68 к PAR определяли как концентрацию Sam68, при которой 50% PAR находится в комплексе. Реакционные смеси содержали 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 500 мМ мочевины, 100 мкг/мл БСА, 10 нМ [32P]-меченой PAR и Sam68 в указанных концентрациях (75 нМ–5 мкМ)

 

Согласно полученным данным, величина EC₅₀, кажущаяся константа диссоциации комплекса Sam68•PAR, составила 300 нМ. Методом анизотропии флуоресценции также была проведена оценка сродства Sam68 к ДНК (FAM-Nick), содержащей одноцепочечный разрыв, и величина EC₅₀ для комплекса Sam68•ДНК составила 500 нМ (рис. 8). Таким образом, Sam68 проявляет специфическое сродство к PAR и поврежденной ДНК.

 

Рис. 8. Сродство Sam68 к поврежденной ДНК. Изменение анизотропии флуоресценции ДНК (FAМ-Nick) в присутствии различных концентраций Sam68. Реакционные смеси содержали 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 100 мкг/мл БСА, 500 мМ мочевины, 10 нМ ДНК (FAM-Nick) и Sam68 в указанных концентрациях

 

Таким образом, способность Sam68 стимулировать активность PARP1 может зависеть от эффективности его взаимодействия с поврежденной ДНК и/или PAR.

Методом флуоресцентного титрования была изучена возможность формирования комплекса Sam68•PARP1 на поврежденной ДНК (FAM-Nick) (рис. 9).

 

Рис. 9. Исследование комплексообразования PARP1 и Sam68 с ДНК (FAM-Nick) методом анизотропии флуоресценции. Реакционные смеси объемом 10 мкл содержали 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 500 мМ мочевины, 10 нМ ДНК (FAM-Nick), 0–10 мкМ Sam68 и 100 нМ PARP1

 

При последовательном увеличении концентрации Sam68 при отсутствии PARP1 наблюдается увеличение уровня анизотропии флуоресценции (рис. 9, красная линия), что свидетельствует о том, что происходит формирование комплекса Sam68 с поврежденной ДНК. При добавлении Sam68 к предварительно сформированному комплексу PARP1•ДНК не наблюдалось значительного увеличения уровня анизотропии флуоресценции (рис. 9, синяя линия), что указывает на то, что формирования тройного комплекса Sam68•PARP1•ДНК не происходит.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящее время поиск ингибиторов ключевых ферментов и факторов репарации ДНК является одним из перспективных направлений в создании эффективной терапии для лечения онкологических заболеваний. Фермент PARP1 является ключевым регулятором процессов репарации ДНК в клетке. Накапливается все больше данных о том, что в репарацию ДНК могут быть вовлечены РНК-связывающие белки, необходимые для ее регуляции [8]. Sam68 – это мультифункциональный белок, участвующий во многих клеточных процессах, как например, транспорт мРНК из ядра в цитоплазму, стабилизация мРНК, альтернативный сплайсинг [29, 30]. Sam68 является регулятором экспрессии генов и взаимодействует со многими транскрипционными факторами [29]. Кроме того, в недавнем исследовании [15] была описана роль Sam68 как возможного регулятора синтеза PAR в клетке. Однако, несмотря на установленную функцию Sam68 как кофактора PARP1, детального механизма влияния этого белка на реакцию PAR-илирования не было предложено.

В данной работе был разработан простой и эффективный метод получения и очистки рекомбинантного белка Sam68 из биомассы клеток E. coli, что предполагает выделение Sam68 из телец включения с последующей хроматографией на Ni-NTA.

Sam68 обладает мультидоменной организацией из N- и C-концевых неупорядоченных участков и центрального упорядоченного РНК-связывающего домена. Благодаря своей конформационной лабильности неупорядоченные участки образуют множественные обратимые взаимодействия с белками-партнерами, обеспечивая вовлеченность Sam68 практически во все клеточные процессы [21]. Однако вследствие такой доменной организации Sam68 склонен к агрегации в водных растворах, что затрудняет изучение его биохимических свойств. Для изучения роли Sam68 в регуляции активности PARP1 в качестве соединений, которые могли бы повлиять на растворимость Sam68 в водных растворах, были проанализированы мочевина, аргинин и ТМАО. Для дальнейшей работы в качестве вспомогательного соединения для улучшения растворимости Sam68 была выбрана мочевина в концентрации 500 мМ. С использованием подобранных условий для растворимости Sam68 была изучена его роль как белка-регулятора реакции PAR-илирования.

Было оценено влияние рекомбинантного Sam68 на каталитическую активность PARP1 при различных соотношениях концентраций этих белков. Впервые показано, что Sam68 является мишенью PAR-илирования in vitro. Sam68 стимулирует активность PARP1, увеличивая суммарный уровень синтеза PAR, но оказывает слабое влияние на начальную скорость реакции PAR-илирования. Возможно, что стимуляция активности PARP1 РНК-связывающими белками происходит в тройном комплексе на поврежденной ДНК или на PAR, как было нами показано для YB-1 [13, 14]. Несмотря на то что Sam68 подробно охарактеризован как РНК-связывающий белок [29, 31], информация о взаимодействии Sam68 с ДНК или PAR в литературе отсутствует. Впервые была проведена количественная оценка комплексообразования Sam68 с поврежденной ДНК и с PAR. Методом анизотропии флуоресценции было показано, что Sam68 не образует тройной комплекс с PARP1 на поврежденной ДНК (Sam68•PARP1•ДНК). Поэтому наиболее вероятным является предположение о том, что регуляция активности PARP1 осуществляется за счет взаимодействия Sam68 с полимером ADP-рибозы, ковалентно присоединенным к PARP1 в процессе активации. Sam68, образуя комплекс с синтезируемым полимером ADP-рибозы, способен стабилизировать комплекс PAR-илированной PARP1 с ДНК, продлевая время пребывания PARP1 в активном состоянии и тем самым стимулируя синтез PAR (рис. 10).

 

Рис. 10. Гипотетический механизм регуляции активности PARP1 белком Sam68. а – Образование комплекса PARP1 с поврежденной ДНК. б – Авто-поли(ADP-рибозил)ирование PARP1. в – Образование комплекса Sam68 с PAR, ковалентно присоединенной к PARP1. Связываясь с PAR, ковалентно присоединенной к PARP1, Sam68 экранирует отрицательный заряд этого полимера, стабилизируя комплекс PARP1 с поврежденной ДНК, и тем самым стимулирует синтез поли(ADP-рибозы)

 

Вклад авторов. О.И. Лаврик, М.В. Суханова – концепция и руководство работой; Е.А. Бережнев, К.Н. Науменко, Т.А. Кургина – проведение экспериментов; К.Н. Науменко, Е.А. Бережнев, М.В. Суханова, О.И. Лаврик – обсуждение результатов исследования; К.Н. Науменко, Е.А. Бережнев, М.В. Суханова, О.И. Лаврик – написание текста; М.В. Суханова, О.И. Лаврик – редактирование текста статьи.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-14-00112) и в рамках государственного задания ИХБФМ СО РАН № 121031300041-4 (использование оборудования и инфраструктуры).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Дополнительные материалы. Приложение к статье опубликовано на сайте журнала «Биохимия» (https://biochemistrymoscow.com).

About the authors

K. N. Naumenko

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Russian Federation, 630090 Novosibirsk

E. A. Berezhnev

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Russian Federation, 630090 Novosibirsk

T. A. Kurgina

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Russian Federation, 630090 Novosibirsk

M. V. Sukhanova

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Russian Federation, 630090 Novosibirsk

O. I. Lavrik

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Russian Federation, 630090 Novosibirsk

References

Supplementary files