Combination of carbonic anhydrase isoform IX inhibitors and gefitinib suppresses on the invasive potential of non-small cell lung cancer cells

Full Text

Принятые сокращения: КИ – клеточный индекс; НМРЛ – немелкоклеточный рак легких; CI – комбинационный индекс; DAPI – дигидрохлорид 4′,6-диамидино-2-фенилиндол; EGFR – рецептор эпидермального фактора роста; HIF1α – транскрипционный фактор-1α, индуцируемый гипоксией.

ВВЕДЕНИЕ

Рак легких по-прежнему остается одной из основных причин смертности от онкологических заболеваний во всем мире; при этом большинство пациентов имеют запущенную форму заболевания и неблагоприятный долгосрочный прогноз [1]. Немелкоклеточный рак легких (НМРЛ) составляет примерно 85% случаев рака легких [1]. Гефитиниб – селективный ингибитор тирозинкиназного домена рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), вызывает снижение пролиферации и усиление апоптоза клеток, а также повышает противоопухолевую активность химиотерапевтических препаратов и лучевой терапии. Гефитиниб показал эффективность при лечении пациентов с немелкоклеточной аденокарциномой легкого с мутациями в гене EGFR в экзоне 21 (L858R) и делециями в экзоне 19 [2]. Однако в большинстве случаев успех терапии гефитинибом носит временный характер. Опухолевые клетки приобретают резистентность к гефитинибу, и после года терапии заболевание может прогрессировать [3]. Применение гефитиниба как адъювантного агента в комбинированной химиотерапии продлевает выживаемость пациентов с НМЛР без прогрессирования заболевания [4]. Было также установлено, что резистентности клеток аденокарциномы легкого к химиопрепаратам способствует фермент карбоангидраза IX изоформа (КАЧ IX), трансмембранный металлофермент, содержащий в активном центре ион цинка. КАЧ IX нейтрализует ацидоз в опухолевых клетках [5]. Повышенная экспрессия КАЧ IX является маркером неблагоприятного прогноза для пациентов с НМРЛ [6]; фермент синтезируется в условиях гипоксии под контролем транскрипционного фактора-1α, индуцируемого гипоксией (HIF1α) [5].

Каталитическая активность КАЧ IX в значительной степени обеспечивает адаптацию опухолевых клеток к неблагоприятным условиям дефицита кислорода и энергосубстратов. В частности, каталитическая функция внеклеточного домена фермента играет ключевую роль в работе ряда транспортных белков и позволяет избежать внутриклеточного ацидоза (поддерживается слабощелочной внутриклеточный pH) [7]. В то же время ацидификация внеклеточной среды (в среднем в микроокружении гипоксической опухоли pH составляет 6,5–6,8) [8] нарушает клеточную адгезию в здоровых тканях, облегчая пролиферацию и инвазию опухолевых клеток, а также их метастазирование [9]. Более того, КАЧ IX-зависимый межклеточный ацидоз [8] может способствовать нарушению межклеточных адгезионных контактов за счет подавления экспрессии белка адгезии E-кадгерина, а также трансформации злокачественных клеток в менее дифференцированное состояние [10]. При этом опухолевые клетки приобретают так называемый фенотип «стволовости» (увеличение доли опухолевых стволовых клеток в опухоли), что делает опухолевый фенотип более агрессивным и устойчивым ко многим химиотерапевтическим препаратам [11]. Последние данные указывают на то, что роль КАЧ IX в гипоксических опухолях выходит далеко за рамки регуляции pH-гомеостаза.

Комбинированная терапия онкологических заболеваний основывается на феноменах синергетического действия различных химиотерапевтических препаратов [12]. При комбинировании препаратов с различным механизмом действия можно создать условия для их применения в оптимальной дозе, что снижает побочные эффекты и повышает в целом переносимость химиотерапии [13]. Примечательно, что препараты, механизм действия которых различается, способны совместно эффективно подавлять рост опухолей, что, помимо прочего, позволяет уменьшить вероятность развития резистентности опухолевых клеток к химиотерапии. Более того, в случае уже сформировавшейся резистентности использование адъювантных агентов в комбинации с классическими химиотерапевтическими препаратами в ряде случаев позволяет преодолеть лекарственную устойчивость агрессивных фенотипов [14]. Таким образом, разработка эффективных ингибиторов КАЧ IX для их комбинированного использования в сочетании с клинически одобренными противоопухолевыми препаратами может оказаться успешной стратегией преодоления резистентности опухолей к химиотерапии. В ряде научных работ было показано, что существует взаимосвязь между транскрипцией генов HIF1A и CAIX (кодирует трансмембранный белок семейства карбоангидраз, который участвует в регуляции клеточного pH) и экспрессией EGFR в гипоксических клетках, в том числе НМРЛ [15, 16], и установлено, что активация сигнального каскада через EGFR усиливает клеточный ответ на гипоксию и действует как фактор выживания опухолевых клеток [17]. Ингибирование транскрипции генов, регулируемых гипоксией, может быть одной из стратегий лечения химиорезистентных опухолей с использованием ингибиторов тирозинкиназного домена EGFR. Совокупность вышеуказанных экспериментальных фактов определила выбор комбинации новых ингибиторов КАЧ IX и ингибитора тирозинкиназного домена EGFR – гефитиниба – для проведения исследований, результаты которых представлены в статье. Таким образом, на данном этапе исследования была поставлена задача изучить эффективность совместного действия четырех новых ингибиторов КАЧ IX с цитостатическим препаратом гефитинибом на клеточную линию аденокарциномы легкого человека А549 в условиях физиологической гипоксии. Клетки линии А549 известны устойчивостью к гефитинибу (IC₅₀ = 21 мкМ в условиях нормоксии) [18] и не имеют мутаций в гене EGFR (wild-type EGFR) [19]. Изучен комбинированный цитотоксический эффект гефитиниба и ингибиторов КАЧ IX на цитотоксичность, а также их влияние на пролиферацию, активацию каспаз 3/7 и клеточный цикл на примере клеточной линии аденокарциномы легкого человека А549 в условиях физиологической гипоксии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реагенты. В исследовании использовались следующие соединения: диметилсульфоксид (ДМСО; «Панэко», Россия), гефитиниб («Sigma-Aldrich», США), CoCl₂ («Sigma-Aldrich») и ингибиторы КАЧ IX: 4-(3-фенил-1,2,4-оксадиазол- 5-ил)тиофен-2-сульфонамид (1), 4-(5-(тиофен-3-ил)-1,2,4-оксадиазол-3-ил)бензолсульфонамид (2), 4-(3-(пиридин-2-ил)-1,2,4-оксадиазол-5-ил)тиофен- 2-сульфонамид (3) и 4-(5-метил-1,2,4-оксадиазол- 3-ил)бензолсульфонамид (4). Ингибиторы синтезированы согласно методике, опубликованной в работе Krasavin et al. [20]. Характеризация синтезированных соединений проводилась методами 1H и 13C ЯМР-спектроскопии (Bruker AVANCE DPX 400; «Bruker», США) и масс-спектрометрии высокого разрешения с ионизацией электрораспылением (Bruker microTOF; «Bruker»), а также включала измерение температуры плавления (Electrothermal IA 9300; «Electrothermal», Великобритания).

Характеризация соединений 1–4. 4-(3-фенил- 1,2,4-оксадиазол-5-ил)тиофен-2-сульфонамид (1). Выход – 181 мг (59%). Бежевое твердое вещество, t_пл 295–297 °С. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 8,59 (s, 1H); 8,18 (d, J ¼ 6,9 Hz, 2H); 8,02 (s, 1H); 7,88 (s, 2H); 7,75 (t, J ¼ 7,1 Hz, 1H); 7,67 (t, J ¼ 7,5 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 176,0 (С); 164,6 (С); 148,5 (С); 134,0 (CH); 133,2 (CH); 130,1 (CH); 128,4 (CH); 128,2 (CH); 127,4 (C); 123,6 (C). HRMS (ESI, m/z): рассчитано для C₁₂H₉N₃O₃S₂ [M + H]+ – 308,0158; найдено – 308,0155.

4-(5-(тиофен-3-ил)-1,2,4-оксадиазол-3-ил)бензолсульфонамид (2). Выход – 157 мг (51%). Бежевое твердое вещество, t_пл 279–281 °С. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 8,70 (s, 1H); 8,26 (d, J ¼ 8,4 Hz, 2H); 8,04 (t, J ¼ 6,7 Hz, 2H); 7,89 (dd, J ¼ 5,0, 2,9 Hz, 1H); 7,77 (d, J ¼ 5,1 Hz, 1H); 7,55 (s, 2H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 172,6 (C); 167,7 (C); 147,1 (C); 132,8 (CH); 129,9 (CH); 129,5 (C); 128,2 (CH); 127,1 (CH); 126,8 (CH); 125,0 (C). HRMS (ESI, m/z): рассчитано для C₁₂H₉N₃O₃S₂ [M + Na]+ – 329,9978; найдено – 329,9987.

4-(3-(пиридин-2-ил)-1,2,4-оксадиазол-5-ил)тиофен-2-сульфонамид (3). Выход – 222 мг (72%). Бежевое твердое вещество, t_пл 239–241 °С. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 8,87 (s, 1H); 8,79 (d, J ¼ 4,5 Hz, 1H); 8,15 (d, J ¼ 7,7 Hz, 1H); 8,10 (s, 1H); 8,06 (t, J ¼ 7,6 Hz, 1H); 7,97 (s, 2H); 7,64 (t, J ¼ 5,0 Hz, 1H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 171,5 (C); 168,7 (C); 150,8 (CH); 149,0 (C); 145,9 (C); 138,2 (CH); 136,1 (CH); 128,5 (CH); 126,7 (CH); 124,6 (C); 123,9 (CH). HRMS (ESI, m/z): рассчитано для C₁₁H₈N₄O₃S₂ [M + Na]+ – 330,9930; найдено – 330,9941.

4-(5-метил-1,2,4-оксадиазол-3-ил)бензолсульфонамид (4). Выход – 206 мг (86%). Белое твердое вещество, t_пл 214–215 °С. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 8,18 (d, J ¼ 8,5 Hz, 2H); 8,00 (d, J ¼ 8,5 Hz, 2H); 7,53 (s, 2H); 2,68 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 178,4 (C); 167,2 (C); 146,9 (C); 129,7 (C); 128,0 (CH); 127,1 (CH); 12,5 (CH₃). HRMS (ESI, m/z): рассчитано для С₉H₉N₃O₃S [M + H]+ – 240,0437; найдено – 240,0433.

Культивирование клеточной линии аденокарциномы легкого человека А549. Клетки аденокарциномы легкого человека А549 (ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных», Институт цитологии РАН) культивировали в среде (далее «полная» среда) ДМЕМ («Gibco», США) с добавлением 10% инактивированной бычьей эмбриональной сыворотки (FBS; «Gibco») без применения антибиотиков. Пересев клеток проводили с использованием раствора, содержащего 0,25% трипсина, и раствора Версена (0,02% ЭДТА) в соотношении 1/3 («Биолот», Россия). В эксперименте по клеточной миграции клетки линии А549 подвергались химически-индуцированной гипоксии с использованием известного миметика гипоксии CoCl₂ (С = 100 мкМ) [21–23]. Остальные эксперименты проводили в условиях физиологической гипоксии при 1%-ном содержании кислорода в газовой смеси. В качестве контроля использовали клетки, к которым добавляли ДМСО (финальное разведение – 1 : 1000), т.к. исследуемые соединения 1–4 были растворены в ДМСО.

Цитотоксичность. Изучение цитотоксичности соединений 1–4 и гефитиниба проводилось с использованием реагента МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид) на клетках линии А549. Клетки культивировали в CO₂-инкубаторе при +37 °С в увлажненной атмосфере, содержащей воздух и 5% CO₂, в полной питательной среде. В результате взаимодействия МТТ с NAD(F)Н-зависимыми клеточными оксидоредуктазами образуется окрашенный продукт – формазан с максимумом поглощения при длине волны 540 нм, содержание которого пропорционально количеству жизнеспособных клеток. Для проведения эксперимента клетки открепляли от культуральных флаконов, проводили подсчет числа клеток на анализаторе жизнеспособности клеток Luna-II («Logos Biosystems», Южная Корея), затем клетки переносили в 96-луночный планшет («Thermo Scientific», США) и инкубировали в течение ночи в CO₂-инкубаторе: за это время происходило прикрепление клеток к поверхности лунок (в каждую лунку вносили 5000 клеток в 200 мкл полной среды). Клетки инкубировали в течение 24 ч в условиях физиологической гипоксии, после чего в лунки добавляли растворы, содержащие соединения 1–4 и/или гефитиниб. Клетки инкубировали в планшетах в течение 48 ч в CO₂-инкубаторе при +37 °С. По окончании инкубационного периода культуральную среду удаляли путем инвертирования планшета. Далее, в лунки вносили 100 мкл полной среды DMEM-F12 и 20 мкл МТТ-реагента, и планшеты с клетками инкубировали в течение 1 ч в CO₂-инкубаторе при +37 °С. После удаления надосадочной жидкости кристаллы формазана растворяли в течение 15 мин при перемешивании в ДМСО (200 мкл на лунку). Поглощение измеряли на планшетном ридере Allsheng AMR-100 («Allsheng», Китай). Величину IC₅₀ рассчитывали с использованием пакета программ Graphpad Prism («GraphPad Software Inc.», США), n = 6.

Клеточная миграция. Скорость клеточной миграции изучалась в режиме реального времени с использованием системы клеточного анализа xCELLigence RTCA DP («ACEA Biosciences», США). В лунки нижней камеры CIM-планшета (CIM-Plate 16; «ACEA Biosciences») вносили по 160 мкл среды ДМЕМ, содержащей 10% FBS и 100 мкМ CoCl₂. Клетки линии А549, предварительно инкубированные в течение 24 ч с 100 мкМ CoCl₂, переносили в лунки верхней камеры CIM-планшета (3·104 клеток на лунку) в среде ДМЕМ без сыворотки с 100 мкМ CoCl₂ и добавляли тестируемые соединения – гефитиниб до конечной концентрации 10 мкМ и/или ингибиторы КАЧ IX до конечной концентрации 25 или 50 мкМ. Значение импеданса каждой лунки автоматически регистрировалось системой xCELLigence каждые 15 мин в течение 48 ч и выражалось в виде единиц клеточного индекса (КИ), отражающего изменение числа клеток на микроэлектронных сенсорах, расположенных с обратной стороны пористого дна лунок верхней камеры. Миграция клеток происходит в пределах 20–24 ч. Однако изучался эффект тестируемых соединений за период 48 ч, что дает дополнительную информацию об ингибирующей способности соединений 1 и 2. Все образцы анализировали в 3–4 повторах. Анализ полученных данных проводили с использованием программного обеспечения RTCA 2.0.0.1301 («ACEA Biosciences»). Анализ кривых проводили с использованием коэффициента наклона кривых (α) и t-критерия Стьюдента.

Подготовка клеток для проточной цитометрии. Для проведения анализа методом проточной цитометрии клетки линии А549 высевали в чашки Петри диаметром 40 мм («TTP», Швейцария) в количестве 5·104 клеток в 2 мл полной среды и предварительно инкубировали в течение 24 ч в гипоксическом инкубаторе (содержание О₂ – 1%). Спустя 24 ч среду в чашках меняли на среду с добавлением исследуемых ингибиторов (С = 25 мкМ или 50 мкМ) и гефитиниба (С = 10 мкМ). Через 24 и 48 ч клетки анализировали с использованием проточного цитометра CytoFLEX S («Beckman Coulter», США). Полученные данные обрабатывались с использованием пакета программ CytExpert («Beckman Coulter»). Перед анализом полностью собранные трипсинизацией с поверхности чашек клетки в одинаковом объеме переносили в пробирки, содержащие кондиционную среду, перемешивали и отбирали по 0,1 мл для определения жизнеспособности и концентрации клеток. Затем к суспензии клеток добавляли дигидрохлорид 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI; С = 2 мкг/мл; «Sigma-Aldrich»), и суспензию клеток перемешивали в течение 30 сек, после чего анализировали на проточном цитометре. Проводился анализ не менее 2000 событий в координатах FSC-A log/SSC-A log.

Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла. Анализ клеточного цикла является одним из методов изучения пролиферации клеток. Этим методом исследуются фазы клеточного цикла – распределение клеток по G₁/G₀-, S- и G₂/M-фазам клеточного цикла путем определения относительного содержания ДНК в клетках с использованием ДНК-связывающего флуоресцентного красителя DAPI. Клетки линии А549 трипсинизировали, осаждали и разводили полной средой до концентрации 1·106 клеток/мл. К полученной суспензии клеток добавлялась смесь DAPI (С = 100 мкг/мл) и Triton X-100 (С = 1%) в соотношении 1/5 («Sigma-Aldrich»). Окрашивание и пермеабилизацию клеток проводили в течение 1 мин при комнатной температуре при медленном перемешивании. Для анализа использовалось не менее 10 000 окрашенных клеток. Данные обрабатывались с использованием пакета программ ModFit LT («Verity Software House», США).

Определение активности каспаз 3/7. Активность каспаз, выявляемая при каспаза-зависимом апоптозе, определялась с использованием набора реактивов для проточной цитометрии CellEvent™ Caspase-3/7 Green («Invitrogen», США) в соответствии с протоколом производителя. В состав набора входит флуорогенный субстрат для активированных каспаз 3 и 7, который состоит из пептида DEVD, конъюгированного с красителем, связывающим ДНК. При проникновении в клетки субстрат не флуоресцирует, поскольку пептид DEVD ингибирует взаимодействие красителя с ДНК. При индукции апоптоза каспазы активируются и расщепляют пептид DEVD, что позволяет красителю связываться с ДНК и флуоресцировать. После трипсинизации определяли концентрацию клеток, которые затем разводили полной средой до концентрации 5·105 клеток/мл. После этого к 0,2 мл суспензии клеток линии А549 добавляли 0,2 мкл реагента CellEvent™ (С = 500 нМ). Клетки инкубировали в течение 30 мин при 37 °C в СО₂-инкубаторе. За 5 мин до окончания инкубации добавлялся раствор DAPI (С = 2 мкг/мл) для детектирования доли погибших или поздних апоптотических клеток. По окончании инкубации пробы анализировались на проточном цитометре. Флуоресценция возбуждалась лазерами 488 нм для регистрации сигнала каспаз 3/7 в канале FITC и 375 нм – для регистрации сигнала DAPI.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

С использованием кинетического метода остановленного потока в нашем предыдущем исследовании измерение констант ингибирования рекомбинантной КАЧ IX для соединений на основе замещенных 1,2,4-оксадиазолсодержащих первичных ароматических сульфаниламидов выявило серию ингибиторов-лидеров КАЧ IX – соединения 1–4 со значениями констант ингибирования (K_i), лежащими в наномолярном и субнаномолярном концентрационном диапазоне (табл. 1) [17].

 

Таблица 1. Новые ингибиторы КАЧ IX

№	Структура	Ki, нМ
1		0,24 ± 0,02
2		1,80 ± 0,13
3		0,39 ± 0,03
4		0,53 ± 0,04

 

Цитотоксическое действие ингибиторов КАЧ IX и гефитиниба на клетки аденокарциномы легкого А549. Изучение влияния ингибиторов 1–4, гефитиниба и их комбинированного влияния на жизнеспособность клеток линии А549 проводилось в условиях нормоксии и физиологической гипоксии (1% О₂). Было установлено, что в условиях физиологической гипоксии, по данным ОТ-ПЦР, отмечается повышение уровня экспрессии мРНК HIF1A в 2,1 раза и мРНК САIX – в 1,5 раза по сравнению с контролем (условия нормоксии) (рис. П1 в Приложении). На уровне белка отмечена стабилизация HIF1α (повышение относительной экспрессии в 19 раз) в условиях физиологической гипоксии, которая была подтверждена методом иммуноблоттинга. Уровень КАЧ IX также повышается, но в меньшей степени (рис. П2 в Приложении).

В табл. 2 представлены результаты анализа жизнеспособности клеток линии А549 в присутствии ингибиторов 1–4 и гефитиниба в условиях нормоксии и физиологической гипоксии. В эксперименте использовалась фиксированная концентрация гефитиниба (С = 10 мкМ), при которой он как моноагент не влиял на выживаемость клеток в условиях нормоксии и физиологической гипоксии. Как видно из табл. 2, сочетанное действие ингибиторов 1–3 и гефитиниба в условиях нормоксии приводит к снижению величины IC₅₀ в 2 (ингибитор 1), 1,9 (ингибитор 2) и 1,8 (ингибитор 3) раза соответственно по сравнению с индивидуальными ингибиторами 1–3. В условиях физиологической гипоксии комбинированное действие приводит к уменьшению величины IC₅₀ в 3 (ингибитор 1), 2,9 (ингибитор 2), 2,4 (ингибитор 3) и 1,6 (ингибитор 4) раза соответственно по сравнению с индивидуальными ингибиторами 1–4.

 

Таблица 2. Жизнеспособность клеток линии А549 и комбинационный индекс, характеризующий эффективность совместного действия ингибиторов 1–4 и гефитиниба в условиях нормоксии и физиологической гипоксии

№	Нормоксия		Гипоксия
	Ингибитор IC50, мкМ	Ингибитор + гефитиниб IC50, мкМ/*CI	Ингибитор IC50, мкМ	Ингибитор + гефитиниб IC50, мкМ/CI
1	58,3 ± 5,6	29,0 ± 3,3/0,97	45,6 ± 4,2	15,1 ± 1,6/0,92
2	60,4 ± 5,9	32,3 ± 4,1/1,01	35,4 ± 2,9	12,2 ± 1,8/0,93
3	76,1 ± 6,8	41,7 ± 2,8/1,02	45,6 ± 4,3	19,1 ± 1,8/1,01
4	–	80,3 ± 6,3/–	53,4 ± 6,6	24,1 ± 2,9/1,04

Примечание. Условия нормоксии и физиологической гипоксии (С (гефитиниба) = 10 мкМ, время инкубации – 48 ч). CI – Комбинационный индекс; *CI < 1, CI = 1 и CI > 1 показывают синергизм, аддитивный эффект или антагонизм действия соответственно. На основе данных IC₅₀ для гефитиниба, соединений 1–4 и их комбинации с гефитинибом были рассчитаны значения CI. В условиях физиологической гипоксии для комбинации ингибитора 1 с гефитинибом и ингибитора 2 с гефитинибом CI < 1, что свидетельствует о синергизме их действия; для комбинации ингибитора 3 с гефитинибом и ингибитора 4 с гефитинибом CI ≈ 1 показывает аддитивное действие.

 

Селективность цитотоксического действия ингибиторов 1–4 была изучена на клетках линии ARPE-19 (линия клеток пигментного эпителия сетчатки глаза человека) в условиях физиологической гипоксии. Выживаемость клеток линии ARPE-19 для ингибиторов 1–4 (С = 50 мкМ) составляла 72,3%, 83,0%, 92,3% и 95,1% соответственно (рис. П3 в Приложении).

Влияние ингибиторов КАЧ IX и гефитиниба на миграцию клеток аденокарциномы легкого А549 в условиях гипоксии (100 мкМ CoCl₂). Одной из основных причин прогрессирования рака является возникновение метастазов, которые могут распространяться на другие органы и ткани. Важным фактором, приводящим к формированию метастазов, является миграционная способность опухолевых клеток [24]. Поэтому, кроме действия комбинаций новых ингибиторов КАЧ IX 1–4 с гефитинибом на пролиферацию опухолевых клеток, была проведена оценка влияния этих комбинаций на миграцию клеток аденокарциномы легкого А549 в условиях химически-индуцированной гипоксии. Оценку клеточной миграции проводили в режиме реального времени электроимпедансным методом.

Полученные данные, оцениваемые по коэффициентам наклона кривых (α), свидетельствуют о том, что ингибитор 1 в концентрации 25 мкМ только в период до 24 ч в сочетании с гефитинибом (С = 10 мкМ) снижал миграцию клеток линии А549 по сравнению с эффектом индивидуального гефитиниба (рис. 1, а; р < 0,05). При повышении концентрации ингибитора 1 до 50 мкМ в сочетании с гефитинибом наблюдается ингибирование миграции клеток линии А549 как за период 24 ч (р < 0,01), так и за период 48 ч (р < 0,005) по сравнению как с контрольными клетками, так и с клетками, инкубированными в присутствии индивидуального гефитиниба (рис. 1, б). Соотношение α(ДМСО)/α(ингибитор 1 + гефитиниб) за 24 ч составило 1,93, а за 48 ч – 1,58. В то же время индивидуальный ингибитор 1 в концентрации 50 мкМ также уменьшал миграционную активность клеток по сравнению с контрольными клетками в период первых суток.

 

Рис. 1. Эффект ингибитора 1 и гефитиниба на миграцию клеток линии А549 в зависимости от концентрации ингибитора 1 и времени культивирования. а – Инкубация с гефитинибом (10 мкМ) и ингибитором 1 (25 мкМ), добавленным к клеткам перед началом измерения клеточного индекса (КИ); б – инкубация с гефитинибом (10 мкМ) и ингибитором 1 (50 мкМ), добавленным к клеткам перед началом измерения КИ. Показаны результаты одного репрезентативного измерения из трех разных экспериментов

 

Ингибитор 2 в концентрации 25 мкМ в комбинации с гефитинибом снижал миграционную активность клеток как в течение 24 ч (р < 0,05), так и за 48 ч (р < 0,05) по сравнению с индивидуальным гефитинибом (рис. 2, а). Соотношение α(ДМСО)/α(ингибитор 2 + гефитиниб) за 24 ч составляло 1,36. Однако после 30 ч эксперимента данный эффект исчезал. Через 24 ч эксперимента не было выявлено отличий в миграции клеток линии А549 под действием ингибитора 2 в концентрации 50 мкМ по сравнению с контрольными клетками, но в сочетании с гефитинибом ингибитор 2 снижал миграционную активность клеток (р < 0,005; рис. 2, б). Соотношение α(ДМСО)/α(ингибитор 2 + гефитиниб) за 24 ч составляло 1,8.

 

Рис. 2. Эффект ингибитора 2 и гефитиниба на миграцию клеток линии А549 в зависимости от концентрации ингибитора 2 и времени культивирования. а – Инкубация с гефитинибом (10 мкМ) и ингибитором 2 (25 мкМ), добавленным к клеткам перед началом измерения клеточного индекса (КИ); б – инкубация с гефитинибом (10 мкМ) и ингибитором 2 (50 мкМ), добавленным к клеткам перед началом измерения КИ. Показаны результаты одного репрезентативного измерения из трех разных экспериментов

 

Ингибитор 3 в концентрациях 25 мкМ (рис. 3, а) и 50 мкМ (рис. 3, б) в сочетании с гефитинибом действовал на миграционную активность клеток линии А549 так же, как и индивидуальный гефитиниб (хотя в начальный период эксперимента наблюдается небольшое подавление клеточной миграции) за период 24 ч и 48 ч. Индивидуальный ингибитор 3 за общий период времени 48 ч не влиял на миграцию клеток линии А549 по сравнению с контролем (рис. 3, а и б).

 

Рис. 3. Эффект ингибитора 3 и гефитиниба на миграцию клеток линии А549 в зависимости от концентрации ингибитора 3 и времени культивирования. а – Инкубация с гефитинибом (10 мкМ) и ингибитором 3 (25 мкМ), добавленным к клеткам перед началом измерения клеточного индекса (КИ); б – инкубация с гефитинибом (10 мкМ) и ингибитором 3 (50 мкМ), добавленным к клеткам перед началом измерения КИ. Показаны результаты одного репрезентативного измерения из трех разных экспериментов

 

Ингибитор 4 в концентрации 25 мкМ в сочетании с гефитинибом в первые 24 ч демонстрирует тенденцию к ингибированию клеточной миграции, однако никаких значимых отличий не наблюдается между кривыми (рис. 4, а). В следующие сутки клетки, культивируемые как в присутствии индивидуального гефитиниба, так и гефитиниба в комбинации с ингибитором 4, на биосенсорах регистрируются в большем количестве по сравнению с контролем и клетками, обработанными только ингибитором 4 (рис. 4, а). Ингибитор 4 в концентрации 50 мкМ в сочетании с гефитинибом в первые 24 ч ингибирует миграцию клеток по сравнению с контрольными клетками (р < 0,05) и с клетками, обработанными только гефитинибом (р < 0,05), соотношение α(ДМСО)/α(ингибитор 4 + гефитиниб) за 24 ч составило 1,34. После 30 ч эксперимента характер наклона кривой для ингибитора 4 (С = 50 мкМ) и гефитиниба меняется, демонстрируя увеличение КИ до уровня, сравнимого с таковым для клеток, обработанными только ингибитором 4, а также контрольных клеток (рис. 4, б).

 

Рис. 4. Эффект ингибитора 4 и гефитиниба на миграцию клеток линии А549 в зависимости от концентрации ингибитора 4 и времени культивирования. а – Инкубация с гефитинибом (10 мкМ) и ингибитором 4 (25 мкМ), добавленным к клеткам перед началом измерения клеточного индекса (КИ); б – инкубация с гефитинибом (10 мкМ) и ингибитором 4 (50 мкМ), добавленным к клеткам перед началом измерения КИ. Показаны результаты одного репрезентативного измерения из трех разных экспериментов

 

Несмотря на то что ингибиторы 1 и 2 в концентрациях 25 мкМ и 50 мкМ в комбинации с гефитинибом (10 мкМ) и по отдельности значительно снижают миграционную подвижность клеток в первые 24 ч, позднее во всех случаях наблюдается увеличение КИ. Действительно, миграция клеток обычно происходит в период 20–24 ч, а позднее, помимо миграции, вклад в повышение КИ может давать клеточная пролиферация. Это объясняет временный положительный эффект от химиотерапии различными противоопухолевыми препаратами, в том числе и гефитинибом. Таким образом, опухолевые клетки приобретают резистентность к гефитинибу, и по прошествии некоторого времени заболевание начинает прогрессировать [9]. Интерпретируя результаты эксперимента за последние 24 ч, а именно увеличение КИ, также нельзя исключать вероятность спонтанного метастазирования. В клинической практике встречаются случаи, когда монотерапия противоопухолевым препаратом вызывала повышенную миграцию раковых клеток. Так, сунитиниб значительно подавлял рост первичной опухоли, но усугублял ее гипоксию, тем самым увеличивая метастазирование [25].

По совокупности проведенных исследований можно заключить, что ингибиторы 1, 3 и 4 в концентрациях 25 мкМ и 50 мкМ не изменяют миграционной активности клеток линии аденокарциномы легкого человека А549, кроме эффекта ингибитора 2 в концентрации 50 мкМ, который проявился спустя 40 ч после начала эксперимента. При этом ингибиторы 1 и 2 (С = 50 мкМ) в сочетании с гефитинибом (С = 10 мкМ) проявляли стабильное ингибирующее действие на миграционную активность клеток линии А549, кроме того, в случае комбинации ингибитора 1 с гефитинибом миграция клеток подавлялась эффективнее всего. Таким образом, комбинации ингибиторов КАЧ IX с гефитинибом оказали большее влияние не только на выживаемость опухолевых клеток, но и на их подвижность, чем эти же соединения, взятые по отдельности. Ввиду того что адаптация опухолевых клеток к гипоксическим условиям способствует выбросу метастазов, а ингибиторы КАЧ IX эффективно действуют на метастатический потенциал опухолевых клеток [24], использование ингибиторов КАЧ IX в противоопухолевой терапии как части комбинационной терапии имеет большие перспективы.

Влияние комбинированного действия ингибиторов КАЧ IX и гефитиниба на распределение клеток по фазам клеточного цикла клеток линии А549. Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла, полученный методом проточной цитометрии, показал (рис. 5), что через 24 ч инкубации в условиях физиологической гипоксии происходит значительное накопление клеток в фазе G₀/G₁, инкубированных в присутствии индивидуального гефитиниба (до 75,7 ± 0,4% клеток) и в сочетании с ингибитором 1 (до 78,1 ± 1,2% клеток) по сравнению с контрольными клетками (57,7 ± 1,8%). Действие других ингибиторов КАЧ IX в сочетании с гефитинибом также оказывало цитостатический эффект на клетки линии А549. Клетки накапливались в фазе G₀/G₁, однако доля таких клеток была ниже по сравнению с действием гефитиниба, в особенности в сочетании с ингибитором 3 (70,8 ± 1,0% (25 мкМ) и 67,3 ± 0,7% (50 мкМ) при уровне достоверности p < 0,05 и p < 0,005 соответственно), что свидетельствует о разной начальной динамике прохождения клеток по фазам клеточного цикла.

 

Рис. 5. Распределение клеток линии А549 по фазам клеточного цикла в присутствии ингибиторов КАЧ IX и гефитиниба (24 ч и 48 ч) в условиях физиологической гипоксии (1% О₂)

 

Через 48 ч в присутствии гефитиниба доля клеток в фазе G₀/G₁ возросла до 81,0 ± 1,2%. При совместном действии ингибиторов КАЧ IX и гефитиниба к 48 ч инкубации торможение клеток в фазах G₀/G₁ выравнивалось во всех образцах на уровне 77–80% (рис. 5).

Влияние комбинированного действия ингибиторов КАЧ IX и гефитиниба на активность каспаз 3/7 и апоптоз. На рис. 6 представлены точечные цитограммы контрольных образцов клеток линии А549 в присутствии ДМСО или 10 мкМ гефитиниба (рис. 6, а), а также ингибиторов 1 и 2, проявивших в сочетании с гефитинибом способность индуцировать апоптоз опухолевых клеток в условиях физиологической гипоксии (рис. 6, б и в).

 

Рис. 6. Ингибиторы КАЧ IX в сочетании с гефитинибом вызывают каспаза 3/7-зависимый апоптоз клеток линии А549. а – Инкубация с гефитинибом (10 мкМ) в течение 24 ч и 48 ч; б – инкубация с гефитинибом (10 мкМ) и ингибитором 1 (25 и 50 мкМ) в течение 24 ч и 48 ч; в – инкубация с гефитинибом (10 мкМ) и ингибитором 2 (25 и 50 мкМ) в течение 24 ч и 48 ч. Типы клеток: D – погибшие клетки; N – поздние апоптотические клетки; L – живые клетки; A – ранние апоптотические клетки

 

Ранние апоптотические клетки позиционируются в нижнем правом квадрате и обозначены как А (каспазы 3/7+; DAPI−), поздние апоптотические клетки – в правом верхнем квадрате – как N (каспазы 3/7+; DAPI+). На цитограммах прослеживается дозо- и время-зависимое появление популяции ранних апоптотических клеток (А), которое свидетельствует об активации каспаз 3/7 в клетках линии А549 под действием ингибиторов 1 и 2 (рис. 6, б и в; табл. 3). Для ингибиторов 3 и 4 не наблюдалось появления ранних апоптотических клеток даже через 48 ч инкубации с модуляторами ответа (табл. 3).

 

Таблица 3. Цитометрический анализ активации каспаз 3/7 в клетках линии А549 в условиях физиологической гипоксии (1% О₂)

Тестируемый ингибитор, условия		Ранние апоптотические клетки, % (среднее ± SD)	Поздние апоптотические клетки, % (среднее ± SD)	Клеточная гибель, % (среднее ± SD)
ДМСО 24 ч ДМСО 48 ч		0,25 ± 0,05 1,20 ± 0,47	1,53 ± 0,10 1,34 ± 0,52	0,48 ± 0,18 0,42 ± 0,14
Гефитиниб, 10 мкМ, 24 ч Гефитиниб, 10 мкМ, 48 ч		0,17 ± 0,05 0,92 ± 0,14	2,35 ± 0,41 3,78 ± 1,26	0,51 ± 0,18 1,30 ± 0,35
№ 1	25 мкМ, 24 ч 25 мкМ, 48 ч	0,28 ± 0,02 7,79 ± 0,81	1,98 ± 0,12 3,16 ± 1,01	0,40 ± 0,10 0,39 ± 0,28
	50 мкМ, 24 ч 50 мкМ, 48 ч	2,09 ± 0,47 10,95 ± 0,69	2,88 ± 0,22 2,90 ± 0,48	0,26 ± 0,10 0,38 ± 0,13
№ 2	25 мкМ, 24 ч 25 мкМ, 48 ч	1,77 ± 0,38 3,68 ± 0,37	2,72 ± 0,11 2,55 ± 0,42	0,48 ± 0,06 1,21 ± 0,30
	50 мкМ, 24 ч 50 мкМ, 48 ч	4,66 ± 0,83 6,69 ± 0,55	2,20 ± 0,37 3,03 ± 0,45	1,24 ± 0,50 0,86 ± 0,07
№ 3	25 мкМ, 24 ч 25 мкМ, 48 ч	0,23 ± 0,08 0,30 ± 0,13	1,39 ± 0,45 2,04 ± 0,44	0,87 ± 0,09 2,35 ± 0,53
	50 мкМ, 24 ч 50 мкМ, 48 ч	0,26 ± 0,21 0,98 ± 0,65	2,05 ± 1,33 2,05 ± 0,18	1,41 ± 0,74 1,89 ± 0,23
№ 4	25 мкМ, 24 ч 25 мкМ, 48 ч	0,44 ± 0,13 0,24 ± 0,09	3,34 ± 1,23 3,16 ± 0,10	0,42 ± 0,07 1,08 ± 0,24
	50 мкМ, 24 ч 50 мкМ, 48 ч	0,33 ± 0,14 0,20 ± 0,11	2,71 ± 0,74 4,80 ± 0,47	0,46 ± 0,07 1,29 ± 0,36

 

Изучен комбинированный цитотоксический эффект гефитиниба и ингибиторов КАЧ IX (1–4), а также их влияние на пролиферацию, активацию каспаз 3/7 и клеточный цикл на примере клеточной линии аденокарциномы легкого человека А549 в условиях физиологической гипоксии. В условиях физиологической гипоксии для комбинации ингибитора 1 с гефитинибом и ингибитора 2 с гефитинибом рассчитаны значения CI, величины которых были меньше единицы, что свидетельствует о синергизме их действия. Установлено, что сочетание ингибиторов 1 и 2 с гефитинибом вызывает гибель клеток по механизму каспаза 3/7-зависимомого апоптоза и угнетает инвазивный потенциал клеток А549, из которых ингибитор 1 обладает наибольшим эффектом и может рассматриваться как перспективное соединение-лидер для дальнейших исследований.

Вклад авторов. А.С. Бунев – концепция, проведение экспериментов; А.А. Шетнев – синтез соединений; О.С. Шемчук – проведение экспериментов, статистическая обработка результатов, написание текста статьи; П.К. Кожухов – проведение экспериментов; Т.В. Шаронова – синтез соединений; И.И. Тюряева – проведение экспериментов, редактирование текста статьи; М.Г. Хотин – проведение экспериментов, редактирование текста статьи; С.В. Агеев – проведение экспериментов; Д.К. Холмуродова – обсуждение, проведение экспериментов; Ж.А. Ризаев – обсуждение, финансовые ресурсы; К.Н. Семенов – концепция, обсуждение и руководство работой; В.В. Шаройко – концепция, руководство работой, редактирование финального текста статьи, финансовые ресурсы.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 21-73-20264).

Благодарности. Исследование выполнено с использованием объекта инфраструктуры «Центр клеточных технологий» Института цитологии РАН.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Дополнительные материалы. Приложение к статье опубликовано на сайте журнала «Биохимия» (https://biochemistrymoscow.com).

About the authors

A. S. Bunev

Togliatti State University

Email: sharoyko@gmail.com

Medicinal Chemistry Center

Russian Federation, 445020 Togliatti

A. A. Shetnev

Institute of Biophysics of the Future

Email: sharoyko@gmail.com
Russian Federation, 141701 Dolgoprudny, Moscow Region

O. S. Shemchuk

Pavlov First St. Petersburg State Medical University

Email: sharoyko@gmail.com
Russian Federation, 197022 St. Petersburg

P. K. Kozhukhov

Pavlov First St. Petersburg State Medical University

Email: sharoyko@gmail.com
Russian Federation, 197022 St. Petersburg

T. V. Sharonova

St. Petersburg State University

Email: sharoyko@gmail.com
Russian Federation, 199034 St. Petersburg

I. I. Tyuryaeva

St. Petersburg State University; Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: sharoyko@gmail.com
Russian Federation, 199034 St. Petersburg; 194064 St. Petersburg

M. G. Khotin

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: sharoyko@gmail.com
Russian Federation, 194064 St. Petersburg

S. V. Ageev

Pavlov First St. Petersburg State Medical University; St. Petersburg State University

Email: sharoyko@gmail.com
Russian Federation, 197022 St. Petersburg; 199034 St. Petersburg

D. K. Kholmurodova

Samarkand State Medical University

Email: sharoyko@gmail.com

Scientific and Practice Center for Immunology, Allergology and Human Genomics

Uzbekistan, 100400 Samarkand

J. A. Rizaev

Samarkand State Medical University

Email: sharoyko@gmail.com

Scientific and Practice Center for Immunology, Allergology and Human Genomics

Uzbekistan, 100400 Samarkand

K. N. Semenov

Pavlov First St. Petersburg State Medical University; St. Petersburg State University; Samarkand State Medical University

Email: sharoyko@gmail.com

Scientific and Practice Center for Immunology, Allergology and Human Genomics, Samarkand State Medical University

Russian Federation, 197022 St. Petersburg; 199034 St. Petersburg; 100400 Samarkand, Uzbekistan

V. V. Sharoyko

Togliatti State University; Pavlov First St. Petersburg State Medical University; St. Petersburg State University; Samarkand State Medical University

Author for correspondence.
Email: sharoyko@gmail.com

Medicinal Chemistry Center, Togliatti State University; Scientific and Practice Center for Immunology, Allergology and Human Genomics, Samarkand State Medical University

Russian Federation, 445020 Togliatti; 197022 St. Petersburg; 199034 St. Petersburg; 100400 Samarkand, Uzbekistan

References

Supplementary files