The role of noncanonical stacking interactions of heterocyclic RNA bases in ribosome functioning

Full Text

Принятые сокращения: н.о. – нуклеотидные остатки; BIE – base-intercalated element; NA-BSE – non-adjacent base-stacking element; PDB – Protein Data Bank, банк данных трёхмерных структур белков и нуклеиновых кислот.

ВВЕДЕНИЕ

Рибонуклеиновые кислоты (РНК) выполняют в клетке разнообразные функции: матричные, регуляторные и ферментативные. Функционируя преимущественно в виде комплексов с белками, РНК составляют структурную основу этих комплексов, проявляя при этом ярко выраженную способность к обратимым конформационным превращениям [1, 2]. Ранее в ходе анализа межплоскостных (стэкинг) взаимодействий гетероциклических оснований нуклеотидов, не являющихся соседями в нуклеотидной последовательности самых разнообразных РНК [3, 4], мы показали, что с их помощью образуется мотив, широко распространённый в третичной структуре РНК. Он был обозначен как NA-BSE (от англ. non-adjacent base-stacking element). Роль этих элементов в образовании и поддержании 3D структур различных РНК была нами недавно достаточно подробно охарактеризована [4]. В настоящей работе рассмотрена роль NA-BSE в функционировании РНК. При этом объектом нашего анализа была рибосомная РНК (рРНК) в составе рибосом (т.е. в комплексе с рибосомными белками, тРНК, мРНК и факторами трансляции), поскольку объём информации о пространственной структуре этих важнейших макромолекулярных комплексов в различных функциональных состояниях в банках структурных данных (прежде всего в RCSB PDB) существенно превышает таковой для всех остальных РНК вместе взятых. Важно также, что доля нуклеотидных остатков (н.о.), образующих NA-BSE, в самих рРНК достаточно велика и приближается к 20% [3, 4].

Конформационные превращения рибосом, происходящие в ходе биосинтеза белка, можно подразделить на две группы: глобальные и локальные. В первом случае малая и большая субъединицы рибосомы на каждом шаге синтеза полипептидной цепи белка совершают обратимое перемещение друг относительно друга. Кроме того, при этом происходит обратимое смещение друг относительно друга крупных доменов, из которых состоят субъединицы рибосомы [5, 6]. Эти глобальные перемещения крупных сегментов рибосомы сопровождаются обратимыми локальными специфическими перестройками как контактов между н.о. в самих рРНК, так и их контактов с тРНК и мРНК. В настоящей работе рассматривается участие NA-BSE в этих структурных превращениях. Предполагается, что подобные структурные превращения лежат в основе механизмов передачи функциональных сигналов как в самой работающей рибосоме, так и в РНК других классов [7, 8].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Как и в нашей предыдущей работе [4], мы определили NA-BSE как максимальный набор из k рибонуклеотидов N₁, ..., N_k, такой, что для каждого i < k основания несмежных остатков N_i и N_i+1 образуют неканоническое стэкинг-взаимодействие оснований. Для построения набора данных NA-BSE мы использовали данные по структуре рибосом, внесённые в Protein Data Bank (PDB) [9], полученные с разрешением лучше 3,0 Å. Для этого мы отобрали записи, помеченные ключевым словом «LSU» (Large SUbunit) в классах эквивалентности репрезентативного набора RNA3DHub (версия 3.347, разрешение до 3,0 Å) [10]. Выбранный набор включал 677 записей PDB. Для аннотирования NA-BSE использовалась программа DSSR (версия 2.0 [11]), элементы вторичной структуры РНК аннотировали с помощью Python-библиотеки urslib2 [12], а затем NA-BSE аннотировали с помощью пользовательских скриптов Python. Результирующий набор данных включал только NA-BSE из цепей РНК длиной ≥ 25 нуклеотидов, при этом учитывались только стэкинг-взаимодействия оснований, имеющие угол основание-основание < 30° и расстояние между ближайшими атомами двух оснований < 4,0 Å.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Базы данных и статистика. Полученная база данных включает в себя 362 543 NA-BSE различных размеров, образованных за счёт стэкинг-взаимодействий между гетероциклическими основаниями 816 186 н.о., не являющимися непосредственными соседями в полинуклеотидных цепях РНК (табл. П1 Приложения). 81,2% (294 342) NA-BSE состоит из двух нуклеотидов, 13,6% (49 281) – из трёх нуклеотидов, 4,2% (15 225) – из четырёх нуклеотидов и 1% включает пять или более остатков (3417 – пять, 273 – шесть, четыре – семь и один NA-BSE – восемь остатков). 58,2% NA-BSE были мотивами, состоящими только из пуринов, 35,3% включали как пурины, так и пиримидины, 5% были образованы пиримидинами и 1,5% NA-BSE включали модифицированные основания. Только 1,3% (4577 из 362 543) NA-BSE включали межмолекулярные взаимодействия (табл. П2 Приложения). NA-BSE типа I, образованные исключительно основаниями одного участка цепи внутри элемента вторичной структуры РНК (стебля или петли), составили 28% набора данных. NA-BSE типа II, образованные разными участками цепи одной и той же петли или стебля, составили почти половину всех мотивов (46,8%), а NA-BSE, включающие дальнодействующие (long-range) взаимодействия между различными элементами вторичной структуры РНК (тип LR), составили 15,9% набора данных. Остальные 9,3% NA-BSE включали смесь различных типов стэкинг-взаимодействий оснований. 6,6% всех NA-BSE включали мотивы, ранее названные нами мотивами BIE (base-intercalated element) и BWE (base-wedged element) [3], причём BIE встречался в четыре раза чаще. Почти все мотивы (98,3%) были дополнительно стабилизированы взаимодействиями между основанием и фосфатом [13]. 24% NA-BSE были стабилизированы взаимодействием одного н.о. с O4′-атомом рибозы другого н.о. [14]. Более половины (56,2%) всех NA-BSE включали канонические (смежные) стэкинг-взаимодействия оснований, образованные фланкирующими остатками с двух сторон, а 35,3% мотивов включали канонический стэкинг оснований, образованный только с одной стороны, без предпочтения какой-либо из сторон. 92,3% всех NA-BSE образовывали канонические (35,6% всех пар оснований) и неканонические (64,4%) пары оснований с другими остатками. Интересно, что 70% неканонических пар оснований находились в транс-ориентации, согласно номенклатуре Леонтиса–Вестхофа [15], однако мы не наблюдали существенного предпочтения ни одной из трёх «граней» оснований («грань» Уотсона–Крика, Хугстена или остатка рибозы) ни среди пар оснований в транс-, ни в цис-положении.

Образование NA-BSE с участием тРНК, мРНК и рРНК в декодирующем центре рибосомы и в процессе транслокации. В ходе процесса транслокации т.н. А-тРНК, поступившая в А-сайт рибосомы в аминоацилированной форме, после завершения пептидилтрансферазной реакции (ПТР) перемещается из этого сайта в Р-сайт уже в виде пептидил-тРНК. Она замещает в этом сайте деацилированную Р-тРНК (которая до окончания ПТР несла на себе синтезирующийся пептид), вытесняя её в Е-сайт. При этом находившаяся в Е-сайте деацилированная тРНК покидает рибосому, а тРНК, ранее располагавшаяся в Р-сайте, занимая её место, образует с Е-сайтом несколько специфических тРНК-рРНК-контактов. Этот процесс сопровождается перемещением мРНК в мРНК-связывающем канале малой субъединицы рибосомы строго на один кодон. Отметим, что каждый шаг таких перемещений проходит через одно или несколько промежуточных состояний. Не вдаваясь в детали механизма работы рибосомы как молекулярной машины, подчеркнём ещё раз ключевую роль межнуклеотидных РНК-РНК-взаимодействий во всех этих процессах.

NA-BSE в декодирующем центре рибосомы. Прямое участие рРНК в декодировании генетической информации изучено во многих деталях [16–21]. В частности, убедительно доказано, что основания трёх н.о. рРНК малой субъединицы рибосомы, G530, A1492 и A1493, стабилизируют выбор рибосомой той тРНК, которая соответствует кодону мРНК, находящемуся в А-сайте (здесь и везде в тексте статьи, если специально не оговорено, указана нумерация нуклеотидов, принятая для рРНК рибосомы Escherichia coli) [16]. Это осуществляется с помощью А-минорных взаимодействий этих н.о. с малым желобком кодон-антикодоновой спирали (рис. 1, а). При этом адениновые основания н.о. А1492 и А1493 находятся в стэкинге друг с другом, а положение G530, как следует из анализа, проведённого в этой работе, стабилизировано его включением в NA-BSE, состоящий из трёх нуклеотидов G529–C518–G530 (рис. 1).

 

Рис. 1. Образование NA-BSE в декодирующем центре рибосомы E. coli. а – В кодон-антикодоновые взаимодействия вовлечены как А-, так и Р-сайты рибосомы (PDB ID: 5UYM); б – А-сайт рибосомы свободен (PDB ID: 5UYK) (подробности – в тексте). Построение пространственных структур РНК, их анализ и создание всех иллюстраций было осуществлено с помощью программы Discovery Studio Visualizer v.21.1.0.20298

 

Однако в свободной от тРНК рибосоме или в рибосоме, в А-сайте которой отсутствует «правильная» тРНК, А1492 теряет контакт c А1493, переключаясь на образование NA-BSE с аденином н.о. А1913 рРНК большой субъединицы рибосомы (рис. 1, б). Этот вновь образованный NA-BSE становится элементом «моста» между малой и большой субъединицами рибосомы (см. ниже). G530 находится в такой свободной рибосоме в syn-конформации, в то время как при взаимодействии с кодон-антикодоновым комплексом его конформация – anti. Ясно, что при перемещении тРНК из А-сайта в Р-сайт, т.е. при разрушении одного кодон-антикодонового комплекса и в преддверии образования нового, исходная структура двух рассмотренных выше NA-BSE должна восстанавливаться. Таким образом, приведённые здесь данные отчётливо демонстрируют способность анализируемых в этой работе мотивов разрушаться и образовываться вновь (флуктуировать) в ответ на изменение функционального состояния рибосомы.

Другое важное наблюдение, которое следует из анализа приведённых выше данных, заключается в том, что гетероциклическое основание в NA-BSE (в данном случае гуанин в G530) способно совершить поворот вокруг гликозидной связи фактически на 180° и вновь образовать стэкинг-контакт со своим прежним соседом (ср. конформации G530 на рис. 1, а и б).

Более того, было показано [22, 23], что когда в А-сайте рибосомы находится стоп-кодон, т.е. наступает стадия терминации трансляции, G530 вступает в стэкинг-взаимодействие с н.о. А3 этого кодона и образует с ним NA-BSE. Это, в свою очередь, приводит к временному образованию «стопки», состоящей из четырёх нуклеотидов (и, соответственно, из трёх NA-BSE), характеризующейся сильным перекрыванием плоскостей гетероциклических оснований (рис. 2, а).

 

Рис. 2. Образование стопкообразного NA-BSE с участием G530 16S рРНК и А3 стоп-кодона мРНК, расположенного в А-сайте рибосомы (PDB ID: 4V67, а). Универсальный способ фиксации тРНК в Р-сайте рибосомы путём образования NA-BSE из С34 тРНК и С1400 16S рРНК, экспонированного из её полинуклеотидной цепи вследствие образования NA-BSE C1399–G1401 (PDB ID: 7K00, б)

 

Таким образом, здесь происходит фиксация мРНК, которая продолжается до тех пор, пока не произойдут все события, составляющие процесс терминации трансляции.

И, наконец, ещё один консервативный NA-BSE, функция которого состоит в стабилизации кодон-антикодоновых взаимодействий, образуется с помощью стэкинг-контакта между С1400 рРНК малой субъединицы рибосомы и 5′-концевого нуклеотида в антикодоне Р-тРНК (например, как это показано на рис. 2, б, с С34 формилметиониновой тРНК E. coli) [24]. Необходимо заметить, что для того, чтобы этот контакт мог реализоваться, н.о. С1400 должен быть вытеснен из полинуклеотидной цепи 16S рРНК нуклеотидами С1399 и G1401, в свою очередь, также образующими NA-BSE [24] (рис. 2, б).

Контакты рРНК с мРНК вне декодирующего центра рибосомы, образованные NA-BSE. Ранее при анализе структурных мотивов в РНК, обозначенных нами как BIE и BWE [3], которые входят в рассматриваемое здесь более обширное семейство NA-BSE [4], мы описали мотив, образуемый н.о. А1503 рРНК малой субъединицы рибосомы с н.о. −1 и −2 мРНК. Он был обнаружен более десяти лет назад Noller et al. [25]. Авторы высказали предположение о том, что этот контакт необходим для поддержания правильной рамки считывания мРНК рибосомой в процессе транслокации. Недавно в той же лаборатории удалось получить убедительное доказательство этой гипотезы: в мутантных рибосомах E. coli, в 16S рРНК которых отсутствовало адениновое (и какое-либо другое) основание в положении 1503, сдвиг рамки считывания мРНК наблюдался примерно вдвое чаще, чем в рибосомах дикого типа [26]. Было показано также, что точное расположение сайта связывания остатка А1503 16S рРНК с мРНК зависит от функционального состояния рибосомы (ср., например, файлы с PDB ID: 4V9K и 4V8D).

По-видимому, аналогичную роль выполняют в процессе транслокации NA-BSE, образуемые нуклеотидами мРНК и консервативными н.о. С1397, U1196 и G926 рРНК малых субъединиц рибосом, приведёнными в табл. П2.

NA-BSE в составе «мостиков», соединяющих малую и большую субъединицы рибосомы. Известно, что субъединицы рибосомы связаны друг с другом при помощи т.н. «мостов», которые образуются за счёт белок-белковых, РНК-белковых и РНК-РНК-взаимодействий. Количество таких «мостов» варьирует от 12 до 17 у рибосом различных организмов (для обзора см. работу Liu и Fredrick [27]). Межсубъединичные контакты, образуемые в «мостиках» только н.о. рРНК, поддерживаются в большинстве случаев связями между 2′-гидроксилом рибозы и фосфатными группами (с участием ионов магния), а также с помощью А-минорных мотивов. Однако в двух случаях ключевую роль в образовании таких «мостов» играют NЕ-BSE.

Межсубъединичный контакт А1492-А1913, образующийся, когда А-сайт рибосомы свободен, рассмотрен нами выше (рис. 1, б). Он обозначается как «мост» В2a/d. Ярко выраженная относительная подвижность образующих его остатков адениловых кислот особенно отчётливо демонстрирует зависимость образования таких «мостов» от функционального состояния рибосомы.

Как показывает анализ данных, суммированных в табл. П2, второй «мост», обозначаемый как В7 и построенный из NA-BSE А702–А1848, сохраняется в процессе транслокации и в большинстве промежуточных функциональных состояний рибосомы и разрушается лишь тогда, когда величина угла поворота субъединиц друг относительно друга достигает максимальной величины (ср., например, относительное расположение этих нуклеотидов в структурах с PDB ID: 7SS9 и 7SSL (рис. 3)).

 

Рис. 3. Образование (PDB ID: 7SS9, а) и разрушение (PDB ID: 7SSL, б) «моста» В7 между субъединицами рибосомы E. coli

 

Роль NA-BSE в организации контактов между тРНК и рРНК большой субъединицы рибосомы. Здесь мы рассмотрим NA-BSE, которые временно возникают за счёт стэкинг-контактов нуклеотидных оснований рРНК и тРНК в ходе перемещения последней из одного сайта рибосомы в другой, т.е. в процессе транслокации. тРНК в двух из трёх основных состояний, А и Е, сопровождающих её перемещение по рибосоме, показана на рис. 4.

 

Рис. 4. NA-BSE, образующиеся в процессе транслокации тРНК по рибосоме в её А- и Е-сайтах

 

NA-BSE, возникающий в Р-сайте тРНК-рибосомного комплекса, мы рассмотрели выше (рис. 2, б). Оказалось, что как в А-, так и в Е-сайте такие мотивы образуются с участием двух важных функциональных элементов тРНК: т.н. «локтя» и 3′-концевой акцепторной области. В макромолекуле тРНК элемент её 3D структуры, называемый «локтем», формируется за счёт ряда специфических межнуклеотидных взаимодействий T- и D-петлевых одноцепочечных участков. Как мы показали ранее [3], NA-BSE также участвуют в формировании этого функционального центра тРНК. При этом плоскости двух гетероциклических оснований (в большинстве случаев G19 и С56) оказываются сближенными и экспонированными в раствор. Они задействованы практически во всех РНК-белковых и РНК-РНК-комплексах, которые можно наблюдать в процессе функционирования тРНК в клетке [28].

Когда тРНК находится в А-сайте рибосомы, одно из этих оснований, а именно G19, образует стэкинг-контакт с А896 рРНК большой субъединицы рибосомы [19] (рис. 4).

Кроме того, в большинстве функциональных комплексов рибосомы н.о. С74 тРНК, расположенный по соседству с её 3′-акцепторным концом, образует NA-BSE c U2555 рРНК большой субъединицы рибосомы (рис. 4). Нуклеотид U2555 входит в состав т.н. А-петли этой рРНК – одного из компонентов пептидилтрансферазного центра (ПТЦ) рибосомы. Его замена на пуриновые нуклеотиды сказывается на точности работы рибосомы [29]. В то же время мутация U2555C приводит к повышению термостабильности рибосом E. coli [30].

При перемещении пептидил-тРНК из А-сайта в Р-сайт оба NA-BSE разрушаются. При этом «локоть» тРНК в новых РНК-РНК-взаимодействиях не участвует (он взаимодействует главным образом с белком L5), а тРНК и рРНК образуют лишь рассмотренный нами ранее NA-BSE С34–С1400 (см. рис. 2, б).

Транслокация тРНК из Р-сайта в Е-сайт (происходящая, как мы уже отмечали, после завершения ПТР) сопровождается образованием наибольшего числа NA-BSE. Во-первых, в промежуточном состоянии этого перехода, когда кодон-антикодоновый комплекс в Р-сайте ещё сохраняется, адениновое основание 3′-концевого остатка тРНК (в большинстве тРНК это А76) размещается в специальном «кармане» с образованием, по сути дела, двойного NA-BSE. При этом А76 не интеркалирует между основаниями соседних н.о. рРНК (как в cлучае BIE), а размещается в «кармане» (полости), который уже предсуществует в рибосоме (рис. 5).

 

Рис. 5. NA-BSE, образующиеся при связывания 3′-конца деацилированной тРНК с E-сайтом рибосомы E. coli. а – «Карман» для связывания акцепторного конца тРНК в вакантной рибосоме (PDB ID: 6PJ6); б – NA-BSE G2421–A76–C2422, деацилированная тРНК находится в рибосоме в промежуточном P/E-состоянии (PDB ID: 8SYL); в – образование плоской конформации С75–А76 и стопкообразного NA-BSE с участием остатка С75 тРНК перед диссоциацией тРНК из рибосомы (PDB ID: 7K00)

 

Его можно обнаружить и в вакантной, не связанной с тРНК и не функционирующей рибосоме, выделенной из любого организма, а также из митохондрий и хлоропластов (рис. 5, а). Положение остатков G2421 и C2422 (непосредственных соседей в нуклеотидной последовательности рРНК, с основаниями каждого из которых аденин в А76 находится в стэкинге) в её 3D структуре стабилизировано образованием уотсон-криковской пары G2421–С2395 и неканонической пары C2422–U2393 соответственно. Между этими парами в противоположной цепи рРНК находится н.о. C2394. Положение А76, кроме стэкинг-взаимодействий, стабилизировано тремя полноценными Н-связями с основанием С2394 и сахаро-фосфатным остовом, также формирующими «карман» (рис. 5, б, в). Интересно, что образование этого NA-BSE можно наблюдать не только в случае полноразмерной тРНК, но и используя сравнительно короткий «акцепторный» фрагмент тРНК [31].

На следующем промежуточном этапе перемещения деацилированной тРНК из Р- в Е-сайт в игру вступает ещё один важный РНК-белковый домен большой субъединицы рибосомы, т.н. «L1-выступ», в организации которого белок L1 играет ключевую роль [32]. Первоначально NA-BSE образуется за счёт стэкинг-взаимодействия G19 тРНК с G2112 23S рРНК (рис. 6, а; PDB ID: 7ST6).

 

Рис. 6. Относительное расположение остатков G19 и C56 «локтя» тРНК и G2112 и G2168 «L1-выступа» 23S рРНК, а – на начальном этапе перемещения тРНК из Р-сайта в Е-сайт рибосомы (PDB ID: 7ST6); б – при полном перемещении тРНК в Е-сайт (PDB ID: 7SSN); в – на начальном этапе диссоциации тРНК из Е-сайта (PDB ID: 7ST2)

 

Когда же тРНК полностью переходит в Е-сайт, она закрепляется в нем ещё одним NA-BSE, образуемым остатками С56 тРНК и G2168 рРНК (рис. 6, б; PDB ID: 7SSN). И, наконец, эти контакты «локтя» с «L1-выступом» разрушаются перед тем, как тРНК покинет рибосому (рис. 6, в; PDB ID: 7ST2).

Что же касается акцепторного конца тРНК, то в случае рибосом эубактерий в районе «кармана» большой субъединицы образуется NA-BSE из остатков C75 тРНК и А2432 рРНК, который, в свою очередь, является фланкирующим нуклеотидом стопкообразного NA-BSE А2433–А199–А2434. Этот последний мотив выполняет в рибосоме роль соединяющего звена между сильно удалёнными друг от друга элементами вторичной структуры рРНК. При этом н.о. А76 и С75 тРНК, расположенной в Е-сайте рибосом бактерий, образуют весьма необычную структуру, в которой гетероциклические основания лежат в одной плоскости (рис. 5, б). Интересно, что контакт акцепторного конца тРНК с 23S рРНК, образованный двумя NA-BSE, оказывается настолько прочным, что её плоская 3′-концевая структура сохраняется, когда вся остальная часть макромолекулы тРНК покидает рибосому [24] (рис. 5, в).

Заметим, что образование стэкинг-контакта между С75 и А2432 и, соответственно, плоской структуры С75–А76 в рибосомах архей, а также в цитоплазматических и митохондриальных рибосомах эукариот невозможно вследствие стерических препятствий, создаваемых одним из белков, расположенных в этом районе рибосомы.

Взаимодействие D-петли 5S рРНК с рРНК большой субъединицы рибосомы. Среди мотивов, временно возникающих в процессе транслокации, мы хотели бы более подробно рассмотреть NA-BSE, образующийся в ряде третичных структур рибосом E. coli (табл. П2) из н.о. U89 D-петли 5S рРНК и U958 «петли 960» 23S рРНК (рис. 7).

 

Рис. 7. NA-BSE, образованный нуклеотидными остатками D-петли 5S рРНК и т.н. «петли 960», замыкающей спираль H39 23S рРНК в рибосоме E. coli (PDB ID: 5MDV)

 

Возможность для его образования открывается благодаря наличию в макромолекуле 5S рРНК этих рибосом другого, но уже постоянного NA-BSE, состоящего из G86 и С88, стэкинг-взаимодействие оснований которых приводит к экспонированию из D-петли двух остатков уридиловой кислоты – U87 и U89.

Наличие непосредственного контакта двух остатков уридиловой кислоты, показанных на рис. 8, хорошо согласуется с полученными ранее экспериментальными данными. Во-первых, рассматриваемые здесь одноцепочечные участки двух разных рРНК в рибосоме E. coli могут быть ковалентно связаны реагентами, избирательно сшивающими основания рядом расположенных н.о. РНК [33]. Во-вторых, мутации в «петле 960» 23S рРНК приводят к изменению реакционной способности соседнего с U89 остатка С90 D-петли 5S рРНК [34].

 

Рис. 8. Взаимное расположение нуклеотидных остатков U89 тРНК и U958 23S рРНК, а – в присутствии (PDB ID: 7SSL) и б – в отсутствии (PDB ID: 7SSW) элонгационного фактора EF-G в рибосоме E. coli

 

Почему же этот мотив представляет особый интерес? Известно, что 5S рРНК является обязательным компонентом цитоплазматических рибосом всех про- и эукариот. Рибосомы этих классов полностью лишены способности синтезировать белки, если 5S рРНК-белковый комплекс в них по каким-то причинам отсутствует. Сегодня, когда доступными стали сотни 3D структур 5S рРНК в составе рибосом, полученные с атомным или близким к атомному разрешением, проблему пространственной структуры 5S рРНК можно считать полностью решённой. В то же время ответ на вопрос о функциональной роли 5S рРНК в рибосоме остаётся открытым.

В литературе были высказаны две не противоречащие друг другу гипотезы, согласно которым, во-первых, 5S рРНК и специфичные к ней рибосомные белки выполняют роль сигнал-передающего звена между GTPазным центром и ПТЦ рибосомы [33–36] и, во-вторых, 5S рРНК обеспечивают правильную сборку больших субъединиц рибосом в процессе их биогенеза [37–39]. Ясно, что для проверки любой из этих гипотез, а также для дальнейшего выяснения деталей механизма функционирования 5S рРНК в рибосоме необходима надёжная информация о её контактах с другими РНК рибосомного комплекса. С другой стороны, в большинстве доступных на сегодня третичных структур 70S рибосом E. coli н.о. U89 D-петли 5S рРНК и U985 «петли 960» 23S рРНК стэкинг-структур не образуют, хотя они и расположены вблизи друг от друга. Возникает естественное предположение о том, что D-петля 5S рРНК и «петля 960» 23S рРНК в рибосомах бактерий только временно контактируют друг с другом посредством NA-BSE, подобно многим другим рассмотренным нами выше мотивам этого типа, несущим функциональную нагрузку. При этом такой контакт существует лишь в определённом функциональном состоянии рибосомы. Это предположение достаточно убедительно подтверждается примером, показанным на рис. 8 [40]: в рибосоме, которая в процессе транслокации связана с EF-G (рис. 8, а), образуется NA-BSE U89–U985. Этот мотив разрушается после того, как фактор элонгации покидает рибосому (рис. 8, б).

И действительно, в базах данных, которые мы использовали в настоящей работе (табл. П1 и П2), NA-BSE U89–U985 наблюдаются только в комплексах рибосомы с факторами трансляции. Как правило, положение EF-G на рибосоме в них было «заморожено» ингибиторами GTPазной активности фактора с помощью GMP-PCP или фусидовой кислоты (см., например, структуры с PDB ID: 4V9O и 5MDV). Как видно из рис. 8, прямой контакт между фактором элонгации EF-G и 5S рРНК в рибосоме отсутствует. Таким образом, EF-G катализирует образование NA-BSE U89–U985 аллостерически.

Что же касается NA-BSE, образование которого показано на рис. 7, то он формируется на рибосоме E. coli в присутствии фактора терминации трансляции RF2, который также является GTPазой (PDB ID: 5MDV).

Отметим, что экспонированные остатки уридиловой кислоты спирали IV, расположенные рядом c D-петлёй 5S рРНК рибосом некоторых архей, а также всех низших и высших эукариот (сведения о которых содержатся в базе данных П1) образуют постоянные NA-BSE-контакты с одним из остатков аденина большой петли, соединяющей спирали Н41 и Н42 рРНК большой субъединицы рибосом так, как это показано на примере рибосом Haloarcula marismortui (рис. 9).

 

Рис. 9. Контакт в виде NA-BSE примыкающей к D-петле двойной спирали IV 5S рРНК и н.о. А1124 двойной петли 23S рРНК рибосом Haloarcula marismortui

 

К сожалению, для рибосом этих организмов в литературе нет данных, которые позволили бы сравнить взаимное расположение этих нуклеотидов в присутствии или отсутствии белковых факторов трансляции, обладающих GTPазной активностью.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе мы рассмотрели сравнительно небольшую группу NA-BSE, весьма распространённого мотива в 3D структуре РНК. В этой группе представлены мотивы, которые образуются в процессе функционирования рибосомы на всех этапах синтеза полипептидной цепи белков (за исключением мотивов, расположенных в ПТЦ рибосомы, которые были рассмотрены нами ранее [3]). Эту группу составляют лишь менее 1% NA-BSE, участвующих в формировании третичной структуры рРНК (ср. табл. П1 и П2). Особенность этих мотивов состоит в том, что они образуются временно на определённом этапе функционирования рибосомы и диссоциируют при переходе к следующему этапу. Можно думать, что сигналами диссоциации служат ещё недостаточно изученные факторы, управляющие работой рибосомы как молекулярной машины. Ряд н.о. и их комбинаций, из которых состоят функциональные NA-BSE (например, н.о. D- и Т-петель тРНК, формирующие их «локти»), весьма консервативны и у всех организмов состоят из одних и тех же гетероциклических оснований. В других случаях консервативность проявляется на уровне сохранения пуриновых и пиримидиновых оснований в соответствующих позициях. В третьих случаях (как, например, в 5′-положении «кармана», предназначенного для связывания 3′-концевого нуклеотида акцепторного конца тРНК в Е-сайте рибосомы) консервативность отсутствует. Однако для формирования полноценного NA-BSE взаимная ориентация н.о., из которых он собирается, должна быть строго заданной. Это достигается как стэкинг-взаимодействием н.о. мотива с основаниями фланкирующих н.о., так и спариванием с находящимися по соседству комплементарными основаниями.

Нет сомнений в том, что расширение наших знаний о процессах образования и распада NA-BSE в РНК и их комплексов с белками будет способствовать более глубокому пониманию механизма функционирования этих ключевых для жизни клетки макромолекул.

Вклад авторов. В.М. проанализировал данные и подготовил все рисунки. Е.Б. выполнил вычислительную работу и конформационный анализ. А.Б. разработал проект. Все авторы внесли значительный вклад в написание рукописи.

Благодарности. Авторы благодарят рецензентов за внимательное прочтение рукописи и конструктивные предложения.

Финансирование. Статья выполнена в рамках работ по теме № 121031300037-7 госзадания.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Дополнительные материалы. Приложение к статье опубликовано на сайте журнала «Биохимия» (https://biochemistrymoscow.com).

About the authors

V. G. Metelev

Lomonosov Moscow State University

Email: bogdanov@belozersky.msu.ru

Faculty of Chemistry

Russian Federation, 119991 Moscow

E. F. Baulin

Moscow Institute of Physics and Technology

Email: bogdanov@belozersky.msu.ru
Russian Federation, 141701 Dolgoprudny, Moscow Region

A. A. Bogdanov

Lomonosov Moscow State University; Lomonosov Moscow State University; Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry

Author for correspondence.
Email: bogdanov@belozersky.msu.ru

Faculty of Chemistry, Lomonosov Moscow State University; A. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University

Russian Federation, 119991 Moscow; 119992 Moscow; 117997 Moscow

References

Supplementary files