17β-ГИДРОКСИСТЕРОИДДЕГИДРОГЕНАЗА ИЗ ГРИБА Cochliobolus lunatus: БИОСИНТЕЗ В КЛЕТКАХ АКТИНОБАКТЕРИЙ Mycolicibacterium neoaurum И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

17β-Гидроксистероиддегидрогеназа (17β-ГСД) – фермент, используемый в биотехнологии получения тестостерона из фитостерина. Гетерологичная 17β-ГСД из гриба Cochliobolus lunatus катализирует NADPH-зависимое восстановление 17-оксотруппы андростендиона/андростединендиона, образующихся в клетках миколицбактерий в результате присущего им полиферментного процесса окисления алифатической боковой цепи фитостерина, с образованием тестостерона/Δ1-дегидротестостерона соответственно. Объектом исследования являлась гетерологичная 17β-ГСД из гриба C. lunatus (17β-ГСДCl) с 6×His-меткой (6×His-17β-ГСДCl), синтезированная в клетках актинобактерий Mycolicibacterium neoaurum. Выделение и очистку рекомбинантного фермента проводили с помощью аффинной хроматографии. Наибольшую активность ферментный препарат 6×His-17β-ГСДCl проявлял по отношению к андростендиону. Активность 6×His-17β-ГСДCl зависела от NADPH и проявлялась в интервале pH от 6,0 до 9,0 с оптимумом при pH 7,0. Анализ кинетических характеристик показал, что свойства гетерологичного фермента 6×His-17β-ГСДCl, синтезированного в клетках M. neoaurum, сравнимы с таковыми, полученными для фермента 17β-ГСД, выделенного из гриба C. lunatus, а также для рекомбинантных ферментов 17β-ГСДCl, синтезированных в клетках Escherichia coli и Mycolicibacterium smegmatis. Результаты расширяют знания о микробных 17β-ГСД и свидетельствуют о перспективности применения рекомбинантных штаммов M. neoaurum, экспрессирующих кодон-оптимизированную последовательность кДНК, кодирующую 17β-ГСДCl из гриба C. lunatus, для получения тестостерона из фитостерина.

Об авторах

Т. А Тимакова

ФНЦ «Пущинский научный центр биологических исследований РАН»; Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Пущино, Россия

М. В Карпов

ФНЦ «Пущинский научный центр биологических исследований РАН»; Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Пущино, Россия

В. М Николаева

ФНЦ «Пущинский научный центр биологических исследований РАН»; Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Пущино, Россия

Д. Н Текучева

ФНЦ «Пущинский научный центр биологических исследований РАН»; Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Пущино, Россия

А. А Шутов

ФНЦ «Пущинский научный центр биологических исследований РАН»; Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Пущино, Россия

В. В Фокина

ФНЦ «Пущинский научный центр биологических исследований РАН»; Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Email: 2vvfokina@gmail.com
Пущино, Россия

М. В Донова

ФНЦ «Пущинский научный центр биологических исследований РАН»; Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Пущино, Россия

Список литературы

  1. Tekucheva, D. N., Nikolayeva, V. M., Karpov, M. V., Timakova, T. A., Shutov, A. A., and Donova, M. V. (2022) Bioproduction of testosterone from phytosterol by Mycolicibacterium neoaurum strains: “one-pot”, two modes, Bioresour. Bioprocess., 9, 116, https://doi.org/10.1186/s40643-022-00602-7.
  2. Tekucheva, D. N., Fokina, V. V., Nikolayeva, V. M., Shutov, A. A., Karpov, M. V., and Donova, M. V. (2022) Cascade biotransformation of phytosterol to testosterone by Mycolicibacterium neoaurum VKM Ac-1815D and Nocardioides simplex VKM Ac-2033D strains, Microbiology, 91, 303-312, https://doi.org/10.1134/S0026261722300099.
  3. Fernandez-Cabezon, L., Galan, B., and Garcia, J. L. (2016) Engineering Mycobacterium smegmatis for testosterone production, Microb. Biotechnol., 10, 151-161, https://doi.org/10.1111/1751-7915.12433.
  4. Cassetta, A., Budefeld, T., Rizner, T. L., Kristan, K., Stojan, J., and Lamba, D. (2005) Crystallization, X-ray diffraction analysis and phasing of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase from the fungus Cochliobolus lunatus, Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun., 61, 1032-1034, https://doi.org/10.1107/S1744309105034949.
  5. Brunskole, M., Kristan, K., Stojan, J., and Rizner, T. L. (2009) Mutations that affect coenzyme binding and dimer formation of fungal 17β-hydroxysteroid dehydrogenase, Mol. Cell. Endocrinol., 301, 47-50, https://doi.org/10.1016/j.mce.2008.07.023.
  6. Fürtges, L., Conradt, D., Schätzle, M. A., Singh, S. K., Krasevec, N., Rizner, T. L., Müller, M., and Husain, S. M. (2016) Phylogenetic studies, gene cluster analysis, and enzymatic reaction support anthrahydroquinone reduction as the physiological function of fungal 17β-hydroxysteroid dehydrogenase, Chem. Biochem., 18, 77-80, https://doi.org/10.1002/cbic.201600489.
  7. Zorko, M., Gottlieb, H. E., and Zakelj-Mavric, M. (2000) Pluripotency of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase from the filamentous fungus Cochliobolus lunatus, Steroids, 65, 46-53, https://doi.org/10.1016/s0039-128X(99)00085-9.
  8. Rizner, T.L., Stojan, J., and Adamski, J. (2001) Searching for the physiological function of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase from the fungus Cochliobolus lunatus: studies of substrate specificity and expression analysis, Mol. Cell. Endocrinol., 171, 193-198, https://doi.org/10.1016/s0303-7207(00)00424-x.
  9. Plememitas, A., Zakelj-Mavric, M., and Komel, R. (1998) Hydroxysteroid dehydrogenase of Cochliobolus lunatus, J. Steroid. Biochem., 29, 371-372, https://doi.org/10.1016/0022-4731(88)90041-6.
  10. Kristan, K., Rizner, T. L., Stojan, J., Gerber, J. K., Kremmer, E., and Adamski, J. (2003) Significance of individual amino acid residues for coenzyme and substrate specificity of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase from the fungus Cochliobolus lunatus, Chem. Biol. Interact., 143-144, 493-501, https://doi.org/10.1016/s0009-2797(02)00205-3.
  11. Kristan, K., Deluca, D., Adamski, J., Stojan, J., and Rizner, T. L. (2005) Dimerization and enzymatic activity of fungal 17β-hydroxysteroid dehydrogenase from the short-chain dehydrogenase/reductase superfamily, BMC Biochem., 6, 28, https://doi.org/10.1186/1471-2091-6-28.
  12. Ulrih, N. P., and Rizner, T. L. (2006) Conformational stability of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase from the fungus Cochliobolus lunatus, FEBS J., 273, 3927-3937, https://doi.org/10.1111/j.1742.
  13. Kristan, K., Adamski, J., Rizner, T. L., and Stojan, J. (2007) Hist64 regulates accessibility to the active site in fungal 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase, Biochimie, 89, 63-71, https://doi.org/10.1016/j.biochi.2006.09.004.
  14. Zhou, Y., Wang, Y., Chen, X., Feng, J., Wang, M., Wu, Q., and Zhu, D. (2021) Modulating the active site lid of an alcohol dehydrogenase from Ralstonia sp. enabled efficient stereospecific synthesis of 17β-hydroxysteroids, Enzyme Microb. Technol., 149, 109837, https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2021.109837.
  15. Wei, Y., Mei, G., Zhao, J., Zhang, S., Qin, W., Sheng, Q., and Yang, Z. (2023) Testosterone biosynthesis from 4-androstene-3,17-dione catalyzed via bifunctional ketoreductase, Fermentation, 9, 998, https://doi.org/10.3390/fermentation9120998.
  16. Guevara, G., Olortegui Flores, Y., Fernandez de Las Heras, L., Perera, J., and Navarro Llorens, J. M. (2019) Metabolic engineering of Rhodococcus ruber Chol-4: A cell factory for testosterone production, PLoS One, 14, e0220492, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220492.
  17. Tekucheva, D. N., Karpov, M. V., Fokina, V. V., Timakova, T. A., Shutov, A. A., and Donova, M. V. (2024) Single-stage bioconversion of phytosterol into testosterone by recombinant strains of Mycolicibacterium neoaurum, Microbiology, 93, 134-138, https://doi.org/10.1134/S0026261723603913.
  18. Karpov, M., Sukhodolskaya, G., Nikolaeva, V., Fokina, V., Shutov, A., Donova, M., and Strizhov, N. (2016) Bio-based testosterone production from phytosterol, Proc. Nat. Acad. Sci. Belarus Chem. Ser., 3, 78.
  19. Strizhov, N., Karpov, M., Sukhodolskaya, G., Nikolaevya, V., Fokina, V., Shutov, A., and Donova, M. (2016) Development of mycobacterial strains producing testosterone Proc. Nat. Acad. Sci. Belarus, Chem. Ser., 3, 57-58.
  20. Berne, S., Lah, L., Korosec, B., Krasevec, N., and Komel, R. (2008) Progesterone-induced gene expression profile of the filamentous fungus Cochliobolus lunatus, Acta Chim. Slov., 55, 93-100.
  21. Timakova, T. A., Fokina, V. V., Bubnova, T. V., Nemashkalov, V. A., and Donova, M. V. (2022) Optimization of growth conditions for the testosterone-producing Mycolicibacterium neoaurum strain, Opera Med. Physiol., 9, 98-104, https://doi.org/10.24412/2500-2295-2022-3-98-104.
  22. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, https://doi.org/10.1038/227680a0.
  23. Jork, H., Funk, W., Fischer, W., and Wimmer, H. (1990) Thin-layer chromatography. Reagents and detection methods. Physical and chemical detection methods: fundamentals, reagents I, VCH: Weinheim, Germany, 1a, 333-336.
  24. Lobastova, T., Fokina, V., Pozdnyakova-Filatova, I., Tarlachkov, S., Shutov, A., and Donova, M. (2022) Insight into different stages of steroid degradation in thermophilic Saccharopolyspora hirsuta VKM Ac-666T strain, Int. J. Mol. Sci., 23, 16174. https://doi.org/10.3390/ijms232416174.
  25. Rizner, T. L., and Zakelj-Mavric, M. (2000) Characterization of fungal 17β-hydroxysteroid dehydrogenases, Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol., 127, 53-63, https://doi.org/10.1016/s0305-0491(00)00234-0.
  26. Тимакова Т. А., Карпов М. В., Текучева Д. Н., Николаева В. М., Шутов А. А. (2024) Получение рекомбинантной НАДФ-Н-зависимой 17β-гидроксистероиддегидрогеназы и характеристика ее активности in vitro. Сборник докладов Международной научной конференции Актуальные аспекты и перспективы развития современной биотехнологии, Белгород, с. 110-116.
  27. Bragin, E. Y., Shtratnikova, V. Y., Dovbnya, D. V., Schelkunov, M. I., Pekov, Y. A., Malakho, S. G., Egorova, O. V., Ivashina, T. V., Sokolov, S. L., Ashapkin, V. V., and Donova, M. V. (2013) Comparative analysis of genes encoding key steroid core oxidation enzymes in fast-growing Mycobacterium spp. strains, J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 138, 41-53, https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2013.02.016.
  28. Rohman, A., and Dijkstra, B. W. (2021) Application of microbial 3-ketosteroid Δ1-dehydrogenases in biotechnology, Biotechnol. Adv., 49, 107751, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2021.107751.
  29. Egorova, O. V., Nikolaevya, V. M., Suzina, N. E., and Donova, M. V. (2004) Localization of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase in Mycobacterium sp. VKM Ac-1815D mutant strain, J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 94, 519-525, https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2004.12.044.
  30. Rizner, T. L., Zakelj-Mavric, M., Plemenitas, A., and Zorko, M. (1996) Purification and characterization of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase from the filamentous fungus Cochliobolus lunatus, J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 59, 205-214, https://doi.org/10.1016/s0960-0760(96)00098-2.
  31. Rizner, T. L., Moeller, G., Thole, H. H., Zakelj-Mavric, M., and Adamski, J. (1999) A novel 17β-hydroxysteroid dehydrogenase in the fungus Cochliobolus lunatus: new insights into the evolution of steroid-hormone signalling, Biochem. J., 337, 425-431, https://doi.org/10.1042/0264-6021:3370425.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Российская академия наук, 2025

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».