Studying the optical properties of assembled silver and gold nanoparticles for the purpose of creating SERS sensors

Texto integral

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время существует необходимость разработки экспресс-систем для высокочувствительного детектирования различных патогенных биологических агентов [1]. Возможность наработки патогенов в достаточно простых «домашних» условиях делает их весьма привлекательными для использования в качестве оружия массового поражения. В связи с этим в ряде стран на законодательном уровне опубликованы списки веществ, требующих постоянного мониторинга и совершенствования систем их обнаружения [2–4]. Помимо предупреждения угрозы биотерроризма также есть необходимость своевременной диагностики различных заболеваний для оказания необходимой терапии и, в случае опасной инфекции (например, COVID-19), принятия срочных мер для предотвращения ее распространения [5].

Перспективными подходами, способными обеспечить высокую чувствительность и специфичность определения различных патогенов, являются аптасенсорные платформы и иммунохимический анализ на основе спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния света (ГКР). Они работают по принципу специфического взаимодействия аптамера или антитела с детектируемой мишенью (антигеном). Получающиеся в результате такого взаимодействия комплексы детектируются на ГКР-подложке, с которой, как правило, связан аптамер или антитело [6, 7].

В настоящее время уже существуют многочисленные типы упомянутых выше сенсоров, которые позволяют определять различные патогены с высокой чувствительностью [8–10]. Вместе с тем, не теряет актуальности задача по ГКР – детекции мономолекулярного взаимодействия детектирующей молекулы и антигена, которая продиктована необходимостью определения сверхмалых доз целого ряда патогенов [11, 12]. Одним из возможных решений данной задачи является непрерывный поиск и анализ способов получения подложки, способной дать максимально высокую интенсивность ГКР.

В данной работе мы исследовали способ химического осаждения различных коллоидных растворов серебра и золота на поверхности подложек из стекла, оксида кремния, монокристаллического кремния (далее кремний) и алюминиевой фольги (далее фольга). Наш выбор обоснован следующими соображениями:

• известно множество простых и доступных способов химического синтеза коллоидных растворов серебра и золота, которые позволяют получить наночастицы нужного размера [13–15];
• хорошо изучена химия поверхности перечисленных выше материалов, что позволяет легко подобрать ее модификатор для эффективной хемосорбции наночастиц [16, 17];
• фольга, кремний и оксид кремния имеют низкий фоновый оптический отклик, который можно легко учесть при получении ГКР-спектров [18].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

В работе использовали коммерческие реагенты без дополнительной очистки: 25% водный раствор цетилтриметиламмония хлорида (ЦТАХ), цетилтриметиламмония бромид (ЦТАБ), L-аскорбиновая кислота (AA), нитрат серебра (AgNO₃), гидроксиламина гидрохлорид (NH₂OH·HCl), натрия гидроксид, боргидрид натрия (NaBH₄), 4-аминотиофенол (4-ABT) и 3-аминопропилтриэтоксисилан (АПТЭС) (Sigma-Aldrich, США); тригидрат тетрахлораурата водорода (HAuCl₄) (ALFA Aesar, США); 37%-водный раствор перекиси водорода (H₂O_2водн) и 30%-водный раствор аммиака (NH_3водн) (Ленреактив, Россия). Во всех экспериментах использовалась деионизованная вода, полученная из системы Milli-Q Integral 5.

В качестве материала подложек использовали монокристаллический кремний, полученный по методу Чохральского (ООО «Телеком-СТВ», Россия), оксидированный кремний с толщиной слоя оксидной пленки 300 нм (Nova Electronic Materials, США), оптическое стекло К8 (ООО «Флюорит», Россия) и алюминиевую фольгу (Solve Grocery Store, Китай).

Синтез наночастиц золота

Наночастицы золота были получены жидкофазным химическим синтезом по двухстадийному зародышевому протоколу [19] с незначительными модификациями [20]. На первом этапе Au нанокластеры готовили путем смешивания 5 мл водного раствора ЦТАБ (0.2 М), 5 мл HAuCl₄ (1 мМ) с 600 мкл NaBH₄ (0.01 М). Затем были приготовлены 10-нм Au зародыши путем смешивания на магнитной мешалке 20 мл 0.1 М ЦТАХ, 15 мл 0.1 М аскорбиновой кислоты, 0.5 мл Au нанокластеров и 20 мл 0.5 мМ HAuCl₄. Полученные наночастицы трижды центрифугировали при 20 000 g по 60 мин, финальный препарат Au зародышей ресуспендировали в 10 мл 0.01 М ЦТАХ. На втором этапе 10-нм Au зародыши доращивали до необходимых размеров по следующей методике. В стеклянной колбе смешивали 40 мл 0.1 М ЦТАХ, 2.6 мл 0.01 М АА и Au зародыши размером 10 нм, после чего добавляли по каплям 10 мл 2 мМ HAuCl₄. Размер полученных наночастиц зависит от количества Au зародышей: для синтеза частиц размером 40 нм добавляли 500 мкл 10-нм Au зародышей, для 60 нм – 160 мкл, 80 нм – 70 мкл, 100 нм – 40 мкл. Полученные наночастицы центрифугировали при 4000–8000 g в зависимости от размера и ресуспендировали полученные осадки в 5 мл воды.

Синтез наночастиц серебра

Наночастицы серебра были получены жидкофазным химическим синтезом по аналогичному вышеописанному двухстадийному зародышевому протоколу. На первом этапе получали 40 нм Ag наночастицы на 10 нм Au зародышах следующим образом. В пластиковой пробирке с резьбовой крышкой смешивали 50 мл 0.02 М ЦТАХ, 0.5 мл 10 нм Au зародышей, 0.5 мл 0.1 М AgNO₃ и 2.5 мл 0.1 М АА. Далее инкубировали полученную смесь при 70°C в течение 2 ч. Полученные наночастицы дважды центрифугировали при 8000 g по 15 мин, ресуспендировали осадок в 50 мл 0.01 М ЦТАХ, и фильтровали через шприцевые нейлонные фильтры с диаметром пор 0.22 мкм. На втором этапе полученные 40 нм Ag наночастицы использовали в качестве зародышей для доращивания Ag наночастиц необходимых размеров по следующей методике. В пробирке с резьбовой крышкой смешивали 8 мл 0.02 М ЦТАХ, 40 нм Ag зародыши, 0.1 мл 0.1 М AgNO₃ и 0.4 мл 0.1 М АА. Далее инкубировали полученную смесь при 70°C в течение 2 ч. Размер полученных наночастиц зависит от количества Ag зародышей: для синтеза частиц размером 60 нм частиц добавляли 4 мл 40 нм Ag зародышей, для 80 нм – 2 мл, для 100 нм – 1 мл. Полученные наночастицы дважды центрифугировали при 4000–8000 g в зависимости от размера, ресуспендировали осадок в 1 мл 0.01 М ЦТАХ, и фильтровали через шприцевые нейлонные фильтры с диаметром пор 0.22 мкм.

Синтез наночастиц серебра по методу Леопольда–Лендла

Синтез наночастиц серебра проводили по методу Леопольда–Лендла [13] с незначительными модификациями [21]. При комнатной температуре при интенсивном перемешивании медленно по каплям добавляли 10 мл 10^–2 М раствора нитрата серебра к 90 мл раствора гидрохлорида гидроксиламина и гидроксида натрия с концентрациями 1.67·10^–3 и 3.33·10^–3 М, соответственно. После завершения добавления нитрата серебра реакцию проводили в течение 30 мин. Полученный коллоидный раствор центрифугировали при 5000 g и ресуспендировали в 10 мл воды.

Характеристика наночастиц

Спектры экстинкции измеряли на спектрофотометре Specord S-300 (Analytik Jena, Германия). Изображения просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) получали на микроскопе Libra 120 (Carl Zeiss, Германия) в Центре коллективного пользования исследовательским оборудованием в области физико-химической биологии и нанобиотехнологии «Симбиоз» ИБФРМ РАН, Саратов. Для измерений с помощью ПЭМ наночастицы дважды центрифугировали и повторно диспергировали в воде. 10 мкл отмытых наночастиц наносили на медную микроскопическую сеточку для ПЭМ с формваровой подложкой, изображения получали при напряжении 120 кВ.

Подготовка поверхности и иммобилизация золей

Подложки дважды подвергали ультразвуковой обработке в смеси водных растворов аммиака и перекиси водорода (NH_3водн: H₂O_2водн: H₂O = 1:1:6 v:v) в течение 30 мин при 50°C с последующей тщательной промывкой в деионизированной воде. После этого их выдерживали в сушильном шкафу при 120°C в течение 45 мин и затем погружали в 0.5% (v:v) раствор АПТЭС в воде и проводили их обработку ультразвуком при 50°C в течение 30 мин. По окончании этой процедуры, подложки тщательно промывали деионизированной водой и выдерживали в сушильном шкафу при 120°C в течение 12 мин. Подложки охлаждали до комнатной температуры и наносили золи в две зоны по 10 мкл, выдерживали их 2 ч в закрытой чашке Петри, высушивали под вакуумом и тщательно промывали деионизированной водой. Промытые подложки снова высушивали под вакуумом и хранили в пластиковых пробирках в атмосфере азота.

Регистрация ГКР-спектров

На поверхность ГКР-подложек наносили по 2 мкл 1⋅10^–5 М раствора 4-ABT. Капле давали высохнуть, после чего проводили измерение сигнала. Спектры ГКР получали с помощью оптического сканирующего микроскопа Olympus BX51 (Olympus Corporation, Япония) на базе спектрометров ФОТОН-БИО (ООО «ФОТОН-БИО», Россия) с длинами волн лазерного излучения 532 (мощностью 5 мВт), 638 (30 мВт) и 785 нм (60 мВт). Диаметр лазерного пятна для всех источников излучения составлял 10 мкм. В результате регистрировались спектры 4-ABT на различных ГКР-поверхностях (при этом время экспозиции составляло 1 с при 20 кадрах записи) и рассчитывались средние значения и ошибки для всех измерений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Типичный спектр экстинкции свежесинтезированных коллоидов, используемых для приготовления плазмонных платформ, представлен на рисунках 1а и 2а. На рис. 1б-е и 2б-е показаны ПЭМ-изображения наночастиц, иллюстрирующие их геометрию. Средние размеры частиц, определенные путем обработки ПЭМ-изображений, и значения максимумов плазмонного резонанса, приведены в табл. 1.

 

Рис. 1. Спектры экстинкции (а); типичные ПЭМ-изображения свежеприготовленных коллоидов Au наночастиц с различными средними размерами: 10 (б); 40 (в); 60 (г); 80 (д); 100 нм (е). Масштабные линейки соответствуют 100 нм

 

Рис. 2. Спектры экстинкции (а); типичные ПЭМ-изображения свежеприготовленных коллоидов Ag наночастиц с различными средними размерами: 20 (по методике Леопольда–Лендла [13, 21]) (б); 40 (в); 60 (г); 80 (д); 100 нм (е). Масштабные линейки составляют 100 нм

 

Таблица 1. Характеристики коллоидов Au и Ag наночастиц

Образец	λmax, нм	Размер, нм
Au-40	526	37.1 ± 5.4
Au-60	533	56.4 ± 7.2
Au-80	545	77.2 ± 6.2
Au-100	560	94.8 ± 8.6
Ag-20 [13, 21]	416	20.0 ± 4.6
Ag-40	450	41.2 ± 6.8
Ag-60	480	62.1 ± 7.5
Ag-80	498	80.6 ± 9.2
Ag-100	517	98.9 ± 9.7

 

Из представленных данных видно, что максимум поглощения коллоидов зависит от среднего размера и материала частиц. Полученные результаты позволяют предположить, что на ГКР-подложках с серебряными частицами интенсивность сигнала будет выше при длине волны лазера, находящегося в зеленой области спектра (532 нм), а с золотыми в красной области спектра (638 и 785 нм).

В результате экспериментов получены КР-спектры вещества 4-АВТ, которые показаны на рис. 3. Видно, что в зависимости от материала частиц и длины волны возбуждающего лазерного излучения изменяется соотношение интенсивностей характеристических полос спектра 4-АВТ. Это вызвано зависимостью спектрального положения пика плазмонного поглощения подложки от материала наночастиц и взаимодействием SH-группы анализируемого вещества с серебром и золотом [22]. Хорошо известно также, что аминотиофенол может димеризоваться на ГКР подложках с образованием димеркаптоазобензена, что существенно влияет на его спектр комбинационного рассеяния [23]. Для сравнительной оценки усиления ГКР различными подложками была выбрана линия спектра 1074 см^-1 благодаря ее сохраняющейся относительно стабильной и высокой интенсивности от опыта к опыту.

 

Рис. 3. ГКР-cпектры 4-АВТ: наночастицы серебра, синтезированные по методике Леопольда–Лендла, λ_возб = 532 нм (а); наночастицы серебра, синтезированные по методике Леопольда–Лендла, λ_возб = 638 нм (б); наночастицы серебра, синтезированные по методике Леопольда–Лендла, λ_возб = 785 нм (в); наночастицы золота с размером 60 нм, λ_возб = 638 нм (г); наночастицы золота с размером 60 нм, λ_возб = 785 нм (д)

 

В результате опытов проанализировано 32 типа различных ГКР-подложек, полученных в результате иммобилизации частиц из перечисленных в табл. 1 золей на поверхность кремния, оксида кремния, стекла и алюминиевой фольги. Результаты представлены на рис. 4 и в табл. 2.

 

Рис. 4. Интенсивность ГКР-линии 1074 см^-1 вещества 4-АВТ в зависимости от среднего размера частиц, их материала и длины волны возбуждающего лазерного излучения на: кремнии (а); оксиде кремния (б); стекле (в) и фольге (г)

 

Таблица 2. Интенсивность ГКР-линии 1074 см^-1 вещества 4-АВТ в зависимости от среднего размера частиц, их материала и длины волны возбуждающего излучения

Средний размер частиц, нм

Интенсивность ГКР-линии 1074 см-1 вещества 4-АВТ, отн. ед.

Кремний

Окись кремния

Стекло

Фольга

Длина волны возбуждающего излучения, нм

532

638

785

532

638

785

532

638

785

532

638

785

Серебро

20

11300 ± 1120

3400 ± 400

6700 ± 720

25000 ± 2580

295000 ± 30100

11100 ± 1120

16400 ± 1580

65600 ± 6710

107500 ± 11000

48200 ± 4780

775400 ± 78100

32400 ± 3190

40

86700 ± 8950

9600 ± 1020

101200 ± 10760

133000 ± 14500

6500 ± 700

72400 ± 7340

92500 ± 9340

342600 ± 3590

46000 ± 4780

45200 ± 4600

361900 ± 37100

28900 ± 2800

60

70000 ± 7120

10700 ± 1150

76600 ± 8030

86700 ± 7990

6600 ± 700

50700 ± 5090

56700 ± 5700

25900 ± 2610

34900 ± 3510

45000 ± 4620

185900 ± 19500

27700 ± 2790

80

65000 ± 6950

29300 ± 1980

66200 ± 6740

73300 ± 7640

6600 ± 660

34700 ± 3540

44000 ± 4450

25900 ± 2610

20400 ± 2110

37000 ± 3820

55000 ± 5680

22600 ± 2380

100

12400 ± 1260

10700 ± 1090

18200 ± 1850

56700 ± 5780

6100 ± 660

26900 ± 2710

5300 ± 600

8000 ± 750

19900 ± 1990

22300 ± 2220

54000 ± 5670

19600 ± 2150

Золото

40

260 ± 20

1100 ± 150

15700 ± 1620

180 ± 20

11300 ± 1120

10500 ± 1100

0

24000 ± 2510

17300 ± 1870

1200 ± 130

69400 ± 7150

22300 ± 2600

60

760 ± 80

2000 ± 220

10500 ± 1130

320 ± 30

46300 ± 4520

36300 ± 3540

0

48600 ± 4950

19500 ± 2130

0

84800 ± 8800

54800 ± 5850

80

0

5600 ± 580

7000 ± 850

320 ± 30

9000 ± 1030

28700 ± 2960

0

28600 ± 2960

11600 ± 1250

0

65000 ± 6800

34600 ± 3660

100

0

3100 ± 350

6450 ± 710

320 ± 30

3300 ± 410

20800 ± 2120

0

21700 ± 2210

5300 ± 610

0

43000 ± 4900

23600 ± 2500

 

Из представленных данных видно, что ГКР-интенсивность 4-АВТ на всех поверхностях с серебряными наночастицами выше таковой для поверхностей с золотыми частицами. Следует отметить, что уровень интенсивности сигнала зависит не только от типа, размера наночастиц и длины волны возбуждающего излучения, но и от материала подложки. Это проявляется как в абсолютных значениях интенсивности линии 1074 см^-1, так и в положении ее максимумов интенсивности относительно длины волны лазера (выделены зеленым и желтым цветом). Мы полагаем, что данный эффект, в первую очередь, связан с различной «упаковкой» частиц в агрегаты при высушивании на различных типах подложек.

Было установлено, что предел обнаружения анализируемого вещества составляет 10^–8 М. С учетом того факта, что при мечении, например, антител на одну детектирующую молекулу таких меток можно посадить несколько, полученные подложки являются перспективными для использования их в аптасенсорах и иммунохимическом анализе.

По итогам исследования установлено, что для работы на лазерах с длиной волны возбуждающего излучения 532, 638 и 785 нм возможно создание универсальных ГКР-подложек на основе коллоидных растворов, полученных жидкофазным химическим методом со средним размером частиц серебра 40 нм и по методу Леопольда–Лендла со средним размером 20 нм. Показан высокий потенциал их применимости в аптасенсорах и иммунохимическом анализе. В дальнейших исследованиях мы планируем рассмотреть другие способы получения ГКР-поверхностей и разработать на их основе высокочувствительные оптические сенсоры для детектирования биологических объектов.

Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (проект № 19-72-30003).

Sobre autores

A. Subekin

Moscow Institute of Physics and Technology

Email: kukushvi@mail.ru
Rússia, Dolgoprudny

T. Pylaev

Saratov Scientific Center of the Russian Academy of Sciences; Razumovsky Saratov State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: kukushvi@mail.ru
Rússia, Saratov; Saratov

V. Kukushkin

Osipyan Institute of Solid-State Physics of the Russian Academy of Sciences

Autor responsável pela correspondência
Email: kukushvi@mail.ru
Rússia, Chernogolovka

E. Rudakova

Federal Research Center for Problems of Chemical Physics and Medicinal Chemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: kukushvi@mail.ru
Rússia, Chernogolovka

B. Khlebtsov

Saratov Scientific Center of the Russian Academy of Sciences

Email: kukushvi@mail.ru
Rússia, Saratov

Bibliografia

Arquivos suplementares