Low molecular inverse agonist of the thyrotropin receptor is active both intraperitoneal and oral administration

封面

如何引用文章

全文:

详细

Autoimmune hyperthyroidism (Graves’ disease), which is caused by stimulating autoantibodies to the thyroid-stimulating hormone (TSH) receptor, and thyroid gland (TG) tumors, caused by constitutively increased activity of this receptor, are widespread and have a poor prognosis. The drugs used to treat them are not very effective and have many side effects. One of the approaches for the treatment of these thyroid diseases may be the use of allosteric regulators of the TSH receptor with the activity of inverse agonists. The purpose of the work was to study the effects of our previously developed compound TP48 and the new compound TPY5, belonging to the class of thieno[2,3-d]-pyrimidines, on the basal and thyrotropin-releasing hormone (TRH)-stimulated levels of thyroid hormones (THs) in the blood of rats and on the expression of genes responsible for the synthesis of THs in the TG. The effectiveness of TP48 and TPY5 was studied both with intraperitoneal (i.p., 20 mg/kg) and oral (40 mg/kg) administration. Using ELISA, the levels of free (fT4) and total (tT4) thyroxine and free (fT3) and total (tT3) triiodothyronine in the blood were assessed, including during TRH stimulation (intranasally, 300 μg/kg). The gene expression for thyroid peroxidase (Tpo), thyroglobulin (Tg), Na+/I–-symporter (Nis), type 2 deiodinase (Dio2) and TSH receptor (Tshr) in the TG was assessed using PCR. TPY5, with both routes of administration, reduced both basal and TRH-stimulated TH levels, while TP48 suppressed TH production only with i.p. administration. Orally administered TPY5 significantly reduced basal Tpo gene expression and TRH-stimulated Tg and Dio2 gene expression. I.p. administered TP48 reduced only TRH-stimulated expression of the Tg and Dio2 genes. Quite surprisingly, TPY5 (oral) and TP48 (i.p.) reduced basal Tshr gene expression and did not prevent its inhibition by TRH. Thus, the TPY5 compound we developed has the activity of an inverse agonist of the TSH receptor, is effective when administered orally, which is more in demand in medicine, and can be considered as a prototype of drugs to treat autoimmune hyperthyroidism and thyroid tumors.

全文:

ВВЕДЕНИЕ

Нарушения функций щитовидной железы в настоящее время имеют широкое распространение, вызывают большое число осложнений со стороны нервной, эндокринной, сердечно-сосудистой и других систем организма, приводят к инвалидизации и преждевременной смерти пациентов, вследствие чего поиск эффективных путей для их лечения является одной из актуальных проблем современной медицины [1, 2]. Для коррекции гипотиреоидных состояний, в том числе аутоиммунного тиреоидита, наиболее часто применяют заместительную терапию препаратами тиреоидных гормонов (ТГ), которая обычно хорошо переносится пациентами [3]. В то же время антитиреоидные препараты, в том числе наиболее широко применяемые в клинике производные тионамидов (мерказолил, метилтиоурацил и др.), которые используются для предотвращения тиреотоксикоза при аутоиммунном тиреоидите (болезни Грейвса), не столь эффективны и приводят к ряду серьезных побочных эффектов [4]. Вследствие этого для лечения такой тиреоидной патологии часто прибегают к терапии радиоактивным йодом и хирургическим вмешательствам [5]. Не менее острую проблему представляет лечение токсических аденом и опухолей щитовидной железы, причиной которых являются активирующие мутации в рецепторе тиреотропного гормона (ТТГ). Эти мутации вызывают значительное повышение базальной активности рецептора и делает его нечувствительным к регуляции эндогенным ТТДля лечения аденом и опухолей щитовидной железы, практически безальтернативно, используют радиоизотопные и хирургические методы, которые несут в себе серьезные риски для здоровья пациентов [6, 7].

Одним из перспективных подходов для лечения болезни Грейвса, а также токсических аденом и опухолей щитовидной железы, обусловленных конститутивно повышенной активностью рецептора ТТГ, является применение низкомолекулярных инверсионных агонистов, которые взаимодействуют с аллостерическим сайтом, локализованным в трансмембранном канале рецептора [8–11]. Поскольку этот сайт топологически отделен от ортостерического сайта, который расположен во внеклеточном домене, то связывание с ним аллостерического инверсионного агониста не препятствует взаимодействию ТТГ с рецептором [8]. В настоящее время разработано несколько инверсионных агонистов рецептора ТТГ, которые были активны как в условиях in vitro, так и in vivo, подавляя активацию рецептора как гормоном, так и стимулирующими аутоантителами и снижая конститутивно повышенную базальную активность рецептора [12–15]. Нами было разработано соединение TP48, производное тиено[2, 3-d]-пиримидина, наделенное свойствами инверсионного агониста, которое при внутрибрюшинном (в/б) введении крысам не только ингибировало продукцию ТГ, стимулированную тиролиберином (TRH), рилизинг-фактором ТТГ, но и снижало, хотя и в небольшой степени, базовые уровни ТГ [16, 17].

Низкомолекулярные аллостерические регуляторы G-белок-сопряженных рецепторов имеют целый ряд преимуществ в сравнении с лигандами ортостерических сайтов. Они имеют более умеренную активность, и тем самым их применение не приводит к гиперстимуляции (в случае полных агонистов) или избыточному ингибированию (в случае инверсионных агонистов) рецептора. Кроме того, они характеризуются более высокой селективностью регуляции внутриклеточных сигнальных каскадов (“предвзятостью” сигналинга). В ряде случаев низкомолекулярные аллостерические регуляторы активны не только при парентеральных, но и при пероральном способе введения, будучи устойчивыми и хорошо всасываясь в желудочно-кишечном тракте, как это продемонстрировано нами для тиено[2, 3-d]-пиримидиновых производных с активностью агонистов рецептора лютеинизирующего гормона [18]. В этой связи следует отметить, что пероральный способ доставки более востребован в медицине.

В соответствии с вышесказанным нами была поставлена цель разработать инверсионные агонисты рецептора ТТГ, способные снижать как стимулированную, так и базальную его активность не только при парентеральном (в/б), но и при пероральном способе доставки. Исследовали регуляторные эффекты ранее разработанного соединения TP48 и нового соединения TPY5, также относящегося к классу тиено[2, 3-d]-пиримидинов, на базовые и стимулированные TRH уровни ТГ в крови крыс, а также влияние этих соединений на экспрессию генов, ответственных за синтез ТГ в щитовидной железе.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При проведении экспериментов были использованы самцы крыс линии Wistar в возрасте 3–4-х месяцев. Крыс содержали в режиме 12 ч день/12 ч ночь, при температуре 22 ± 3°С, со свободным доступом к питьевой воде и гранулированному сухому корму.

Соединение TP48 (5-амино-N-(трет-бутил)-4-(4-иодфенил)-2-(метилтио) тиено [2,3-d] пиримидин-6-карбоксамид) получали, как описано ранее, из 5-амино-4-(4-иодфенил) - (метилтио)тиено[2,3-d] пиримидин-6-карбоновой кислоты как предшественника [16]. Структуру подтверждали с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения с помощью спектрометра “Bruker micrOTOF” (Германия). Масса иона [M+K+] для TP48 составила 536.9868 (вычислено 536.9886; C18H19IN4OS2K).

Соединение TPY5 (5-амино-N-(трет-бутил)-4-(4-(3-(2,3-дигидроксипропокси)проп-1-ин-1-ил)фенил)-2-(метилтио)тиено[2, 3-d]пиримидин-6-карбоксамид) получали из TP48 по реакции Соногаширы с 2-((проп-2-ин-1-илокси)метил)оксираном с последующим кислотным гидролизом оксиранового цикла. По данным масс-спектрометрического анализа масса иона [M+Na+] для TPY5 составила 523.1443 (вычислено 523.1444; C24H28N4O4S2Na).

Оба соединения растворяли в ДМСО и однократно вводили крысам, в/б в дозе 20 мг/кг и перорально в дозе 40 мг/кВыбор доз основывался на результатах предварительных исследований зависимости доза–эффект, а в случае TP48 был продиктован результатами, полученными ранее при его в/б введении [16, 17]. При в/б введении соединения растворяли в объеме 200 мкл ДМСО. При пероральном введении соединения, растворенные в том же объеме ДМСО, вводили с помощью назогастрального зонда. Контрольной группе вместо тиено[2, 3-d]-пиримидинов в/б вводили ДМСО в объеме 200 мкл. TRH производства фирмы “Sigma” (США) вводили крысам интраназально, однократно, в дозе 300 мкг/кг, как описано ранее [19]. Для этого животных переворачивали на спину и осторожно, по каплям, вводили раствор TRH в физиологическом растворе в носовую полость (общий объем 20 мкл, по 10 мкл в каждую ноздрю, поочередно, порциями по 5 мкл). Контрольным животным вместо раствора TRH вводили в том же объеме физиологический раствор.

В общей сложности были сформированы 10 групп: контрольные крысы (группа C), получавшие только растворители TRH и тиено[2, 3-d]-пиримидинов; крысы, которые были обработаны либо с помощью TRH (группа TRH), либо с помощью TP48 при в/б и пероральном введении (группы TP48ip и TP48or), либо с помощью TPY5 при в/б и пероральном введении (группы TPY5ip и TPY5or); крысы, которые были последовательно обработаны тиено-[2, 3-d]-пиримидинами, TP48 и TPY5 при различных способах введения и затем TRH (группы TRH-TP48ip, TRH-TP48or, TRH-TPY5ip и TRH-TPY5or). В/б введение тиено[2, 3-d]-пиримидиновых производных осуществляли в 10.30, пероральное – в 10.15, в то время как TRH во всех случаях вводили в 11.00. Первый забор крови осуществляли в 10.00 (до введения препаратов), второй забор – в 14.00, через 3 ч. после введения TRH. Соответственно со времени в/б введения TP48 и TPY5 проходило 3 ч. 30 мин., со времени их перорального введения – 3 ч. 45 мин. В каждой группе было по шесть животных. Образцы крови получали из хвостовой вены, используя местный наркоз – 2%-ный раствор лидокаина (2–4 мг/кг).

Для определения концентрации в крови крыс ТГ – свободного (fТ4) и общего (tТ4) тироксина и свободного (fТ3) и общего (tТ3) трийодтиронина использовали ИФА-наборы фирмы “Иммунотех” (Россия).

Количественную ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией осуществляли, как описано ранее [16, 17]. Для этого из ткани щитовидной железы выделяли тотальную РНК, используя реагент “ExtraRNA”, обратную транскрипцию проводили с помощью набора “MMLV RT Kit” фирмы “Evrogen” (Россия). Процедуру амплификации осуществляли в инкубационной смеси, содержащей 10 нг продукта ПЦР, по 0.4 мкМ прямого и обратного праймеров, а также реагент “qPCRmix-HS SYBR+LowROX” (“Евроген”). Сигнал детектировали с помощью прибора “7500 Real-Time PCR System” (“Thermo Fisher Scientific Inc.”, США). Для оценки экспрессии генов использовали последовательности комплементарных кДНК прямого и обратного праймеров, а также референсные гены, кодирующие 18S-рРНК (18S rRNA) или β-актин (Actb). Структура праймеров для генов, кодирующих тиреопероксидазу (Tpo), тиреоглобулин (Tg), Na+/I–-симпортер (Nis), дейодиназу 2-го типа (Dio2) и рецептор ТТГ (Tshr), а также для референсных генов представлена в табл. 1. Полученные данные рассчитывали с использованием метода ΔΔСt, значения RQ рассчитывали по отношению к экспрессии гена в контрольной группе, которую принимали за единицу.

Статистический анализ проводили с помощью компьютерной программы “IBM SPSS Statistics 26” (“IBM”, США). Нормальность распределения данных проверяли с использованием критерия Шапиро–Уилка. Для оценки равенства дисперсий применяли критерий Ливиня. Все данные имели нормальное распределение, вследствие чего для сравнения групп при оценке влияния препаратов, включая комбинации TRH и тиено-[2, 3-d]-пиримидинов, на уровни ТГ и экспрессию генов использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Апостериорный анализ проводили с использованием теста Тьюки. Для сравнения уровней ТГ в одной группе, в исходной точке и после обработки TP48 или TPY5, использовали t-критерий Стьюдента. Данные представляли в виде M ± SEM. Все различия считали статистически достоверными при уровне значимости p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Соединение TP48 при в/б введении самцам крыс снижало у них базовые уровни ТГ, причем уровни общего и свободного трийодтиронина, основного эффекторного гормона тиреоидной системы, снижались на 27 и 43% соответственно (табл. 2). Предобработка животных с помощью TP48 при его в/б введении снижала стимулирующий эффект интраназально вводимого TRH на продукцию fT4 и tT4, в меньшей степени ослабляя TRH-индуцированную стимуляцию продукции трийодтиронина (табл. 3). TRH в отсутствие TP48 повышал уровень fT4 на 38%, в то время как после предобработки TP48 только до 21%. Однако при пероральном введении ингибирующее влияние TP48 на базальные и стимулированные TRH уровни ТГ полностью утрачивалось. На это указывает отсутствие влияния TP48, вводимого перорально, на базовые уровни обоих ТГ (табл. 2), а также сохранение в его присутствии стимулирующего эффекта TRH (табл. 3). Таким образом, TP48 функционирует как инверсионный агонист рецептора ТТГ только при в/б введении этого соединения.

Новое соединение TPY5, производное TP48, было активным как при в/б, так и при пероральном введении (табл. 2).

 

Таблица 2. Влияние тиено[2,3-d]-пиримидиновых производных на базовые уровни ТГ в крови при их внутрибрюшинном и пероральном введении самцам крыс

Группа

Общий Т4,

нмоль/л

Свободный Т4,

пмоль/л

Общий Т3,

нмоль/л

Свободный Т3,

пмоль/л

TP48ip-0

71.9 ± 2.0

36.6 ± 0.9

4.01 ± 0.15

3.86 ± 0.19

TP48ip

56.9 ± 2.7 a

29.0 ± 1.6 a

2.92 ± 0.26 a

2.20 ± 0.23 a

TP48or-0

69.3 ± 2.6

36.4 ± 2.2

3.84 ± 0.24

4.13 ± 0.19

TP48or

65.6 ± 2.9

33.3 ± 1.5

3.71 ± 0.24

3.93 ± 0.17

TPY5ip-0

68.0 ± 2.8

35.9 ± 1.1

3.72 ± 0.23

4.24 ± 0.16

TPY5ip

49.9 ± 1.2 a

27.3 ± 1.3 a

2.89 ± 0.19

2.79 ± 0.15 a

TPY5or-0

67.2 ± 3.3

35.0 ± 0.8

3.70 ± 0.22

3.90 ± 0.25

TPY5or

54.9 ± 3.0 a

26.5 ± 1.0 a

2.62 ± 0.23 a

2.69 ± 0.20 a

a – различия статистически значимы с исходной точкой (до введения TP48 или TPY5, а также их растворителя ДМСО) при p < 0.05. Данные представлены как M ± SEM, во всех группах n = 6. Для сравнения уровней ТГ в исходной точке и после обработки препаратами использовали t-критерий Стьюдента.

 

На это указывает снижение у крыс с обработкой TPY5 базового уровня всех изученных форм ТГ (за исключением tT3 в группе TPY5ip), причем ингибирующие эффекты TPY5 в изученных дозах при обоих способах введения были сопоставимыми. Так, уровни fT3 при в/б и пероральном введении TPY5 снижались на 34 и 31% соответственно. Стимулирующий эффект TRH на продукцию ТГ у крыс с предобработкой в/б вводимым TPY5 снижался для tT4 и fT3, в то время как в случае перорально вводимого TPY5 отмечали снижение уровней всех изученных форм ТГ, причем, за исключением tT3, они не отличались от таковых в контрольной группе (табл. 3). Тем самым, в отличие от TP48, соединение TPY5 проявляло свойства инверсионного агониста при обоих способах введения.

 

Таблица 3. Влияние тиено[2,3-d]-пиримидиновых производных, вводимых внутрибрюшинно или перорально, на стимулированные тиролиберином уровни ТГ в крови самцов крыс

Группа

Общий Т4,

нмоль/л

Свободный Т4,

пмоль/л

Общий Т3,

нмоль/л

Свободный Т3,

пмоль/л

TRH-0

69.1 ± 1.6

39.4 ± 1.3

3.79 ± 0.21

3.55 ± 0.15

TRH

96.5 ± 3.8 a

54.5 ± 2.6 a

5.43 ± 0.26 a

5.44 ± 0.38 a

TRH-TP48ip-0

67.7 ± 3.1

36.7 ± 2.1

3.99 ± 0.22

3.60 ± 0.20

TRH-TP48ip

79.6 ± 4.6 a,b

44.5 ± 2.9 a,b

4.75 ± 0.25 a

4.41 ± 0.34 a

TRH-TP48or-0

66.1 ± 2.9

40.2 ± 1.9

4.06 ± 0.22

3.49 ± 0.14

TRH-TP48or

90.7 ± 5.2 a

54.3 ± 2.4 a

5.38 ± 0.21 a

4.94 ± 0.26 a

TRH-TPY5ip-0

70.9 ± 2.9

38.5 ± 1.9

3.95 ± 0.21

3.77 ± 0.19

TRH-TPY5ip

80.0 ± 2.5 a,b

46.7 ± 3.5 a

4.51 ± 0.30 a

4.11 ± 0.29 b

TRH-TPY5or-0

69.4 ± 1.5

35.8 ± 1.5

3.70 ± 0.31

3.63 ± 0.26

TRH-TPY5or

76.3 ± 3.6 b

42.2 ± 3.8 b

4.13 ± 0.30 a,b

4.17 ± 0.23 b

Различия с исходной точкой (до введения TRH или совместно TRH и тиено[2, 3-d]-пиримидинового производного) (a) и между группами с обработкой одним TRH и комбинацией TRH и тиено[2, 3-d]-пиримидинового производного (b) статистически значимы при p < 0.05. Данные представлены как M ± SEM, во всех группах n = 6. Для сравнения уровней ТГ в исходной точке и после обработки препаратами использовали t-критерий Стьюдента. Для сравнения групп TRH, TRH-TP48ip и TRH-TP48or, а также для сравнения групп TRH, TRH-TPY5ip и TRH-TPY5or использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), апостериорный анализ проводили с использованием теста Тьюки.

 

На заключительном этапе исследования в ткани щитовидной железы крыс изучали влияние TP48 и TPY5 на экспрессию генов, кодирующих рецептор ТТГ и основные белки, ответственные за синтез ТОценивали эффекты перорально вводимого TPY5 на генную экспрессию, а также соответствующие эффекты TP48 при его в/б введении, поскольку при пероральном введении TP48 утрачивал активность.

Достаточно неожиданным был тот факт, что в/б вводимый TP48 и перорально вводимый TPY5 снижали базальную экспрессию гена Tshr, кодирующего рецептор ТТГ, в ткани щитовидной железы (рис. 1). Обработка TRH, который, стимулируя тиреоидную ось, усиливал продукцию ТГ, в значительной степени подавляла экспрессию гена Tshr, причем соединения TP48 и TPY5 хотя и смягчали ингибирующий эффект TRH, но не вызывали нормализации экспрессии этого гена (рис. 1).

 

Рис. 1. Влияние внутрибрюшинно вводимого TP48 (a) и перорально вводимого TPY5 (b) на экспрессию гена рецептора ТТГ (Tshr) в щитовидной железе крыс с обработкой тиролиберином и без таковой. Различия статистически значимы при p < 0.05 при сравнении с контролем (ᵃ) и группами TP48ip или TPY5or (ᵇ). Значения представлены как M ± SEM, во всех группах n = 6. Для сравнения групп использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), апостериорный анализ проводили с использованием теста Тьюки.

 

Таблица 1. Прямые и обратные праймеры для генов, кодирующих рецептор ТТГ и белки, ответственные за синтез ТГ, а также референсные гены

Ген

Последовательности прямого (For) и

 обратного (Rev) праймеров

Индексация

 в Genbank

Tshr

(For) CTCGGACAAGACATGAGCCC

NM_012888.1

(Rev) GGTCCAGGGACTTGCTCAAA

Tg

(For) GCCCTAACTCATCCGTCCA

NM_005106.4

(Rev) TGTTGATAAGCCCATCGTCCT

Dio2

(For) CGTCATCCTCAAGTGTCCCC

NM_031720.5

(Rev) TGGTACGCGCACATTACCTT

Tpo

(For) TTGGATCTGGCATCACTGAACTT

NM_005105.4

(Rev) ATCTTGTTGACCATGCTTCTGTTG

Nis

(For) AAGTGACCGGGTTGGACATC

NM_052983.2

(Rev) AGCCAACGAGCATTACCACA

18S rRNA

(For) GGACACGGACAGGATTGACA

NM_046237.1

(Rev) ACCCACGGAATCGAGAAAGA

Actb

(For) CTGGCACCACACCTTCTACA

NM_031144.3

(Rev) AGGTCTCAAACATGATCTGGGT

Tshr – ген рецептора ТТГ; Tg – ген тиреоглобулина; Dio2 – ген дейодиназы 2-го типа; Tpo – ген тиреопероксидазы; Nis – ген Na+/I–-симпортера; 18S rRNA и Actb – гены 18S-рРНК и β-актина, используемые как референсные гены.

 

Соединение TP48 существенно не влияло на базальный уровень экспрессии генов, вовлеченных в синтез ТГ, за исключением тенденции к снижению экспрессии гена Nis, кодирующего Na+/I‒-симпортер, но различия с контролем в этом случае не были достоверными (рис. 2). В то же время соединение TPY5 значимо снижало базальный уровень экспрессии гена Tpo, кодирующего тиреопероксидазу (рис. 3).

Предобработка крыс как с помощью TP48, так и TPY5 ослабляла стимулирующие эффекты TRH на экспрессию генов Tg и Dio2, кодирующих тиреоглобулин, прекурсор ТГ и дейодиназу 2-го типа, осуществляющую конверсию тироксина в трийодтиронин (рис. 2, 3). Ослабление экспрессии этих генов может быть одним из механизмов ингибирующего влияния тиено-[2, 3-d]-пиримидиновых производных на продукцию ТГ.

 

Рис. 2. Влияние TP48 при его внутрибрюшинном введении на экспрессию генов тиреоглобулина (Tg), тиреопероксидазы (Tpo), дейодиназы 2-го типа (Dio2) и Na⁺/I⁻-симпортера (Nis) в щитовидной железе крыс с обработкой тиролиберином и без таковой. Различия статистически значимы при p < 0.05 при сравнении с контролем (ᵃ), группами TP48ip (ᵇ) или TRH (ᶜ). Значения представлены как M±SEM, во всех группах n = 6. Для сравнения групп использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), апостериорный анализ проводили с использованием теста Тьюки.

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные нами данные демонстрируют, что соединения TP48 и TPY5 по характеру их влияния на синтез ТГ являются инверсионными агонистами рецептора ТТГ, которые не только снижают базальный уровень ТГ, но и их уровни, стимулированные TRH. Необходимо отметить, что стимулирующее действие TRH на тиреоидный статус, в том числе при интраназальном введении, обусловлено активацией синтеза и секреции ТТГ тиреотрофами гипофиза. Это приводит к ТТГ-индуцированной стимуляции рецептора ТТГ и усилению синтеза ТГ в тироцитах [20]. TP48 при обработке им крыс был эффективен только при парентеральном способе введения (в/б), но терял активность при пероральном введении, в то время как TPY5 был в одинаковой степени эффективен как при в/б, так и при пероральном введении. Это указывает на устойчивость и хорошую всасываемость TPY5 в желудочно-кишечном тракте, что существенно расширяет возможности его применения в клинике.

Снижение стимулированной TRH продукции ТГ в тироцитах щитовидной железы, осуществляемое на уровне рецептора ТТГ, представляет значительный интерес для лечения аутоиммунного гипертиреоза (болезни Грейвса), который составляет 60–80% от всех патологических форм гипертиреоза, а также для предотвращения ассоциированной с аутоиммунным гипертиреозом офтальмопатии Грейвса – тяжелого воспалительного заболевания глаз, угрожающего зрению изъязвлением роговицы и сдавлением зрительного нерва [21]. В основе развития аутоиммунного гипертиреоза лежит гиперпродукция ТГ тироцитами щитовидной железы в ответ на стимуляцию рецептора ТТГ стимулирующими аутоантителами. В свою очередь, основной причиной офтальмопатии Грейвса является вызываемая теми же аутоантителами гиперактивация рецепторов ТТГ, локализованных в соединительной ткани орбиты, и это приводит к усилению в ней воспалительных процессов и последующему фиброзу. Стимулирующие аутоантитела с высокой аффинностью связываются с локализованными в эктодомене рецептора сайтами, которые взаимно перекрываются с ортостерическим сайтом, мишенью ТТГ и мимикрируют стимулирующее действие гормона на рецептор ТТГ.

В настоящее время для нормализации тиреоидного статуса при аутоиммунном гипертиреозе применяют тотальную или частичную резекцию ткани щитовидной железы, терапию радиоактивным йодом и фармакотерапию антитиреоидными препаратами. Однако все эти подходы характеризуются множеством побочных эффектов, что во многом обусловлено острым дефицитом ТГ при хирургических операциях, высоким риском нарушений функционирования паращитовидных желез при проведении тиреоидэктомии, развитием агранулоцитоза, васкулитов, поражения печени, кожных реакций при использовании фармакотерапии тионамидами [4, 5, 22, 23]. Значимой проблемой является низкая эффективность этих подходов для предотвращения офтальмопатии Грейвса [22, 23]. Последнее обусловлено тем, что патогенетические механизмы развития аутоиммунного гипертиреоза и офтальмопатии Грейвса различаются. В первом случае в тироцитах аутоантитела активируют цАМФ-зависимые сигнальные пути, ответственные за синтез ТВо втором случае в фибробластах орбиты и периорбитальных тканей они воздействуют на сигнальные пути, в первую очередь на цАМФ-зависимые и β-аррестиновые, обеспечивающие функциональное взаимодействие между рецепторами ТТГ и инсулиноподобного фактора роста-1, что и является пусковым механизмом для развития офтальмопатии Грейвса [24, 25].

Поскольку механизмы активации рецептора ТТГ гормоном и стимулирующими аутоантителами и передача генерируемого ими сигнала к внутриклеточным мишеням как в тироцитах, так и в ретроорбитальных фибробластах реализуются с участием пути рецептор ТТГ–аденилатциклаза–цАМФ–протеинкиназа А [25, 26], который является основной мишенью для разрабатываемых нами тиено-[2, 3-d]-пиримидинов [16, 27, 28], то инверсионные агонисты TP48 и TPY5 могут быть эффективны не только для нормализации уровня ТГ в условиях гипертиреоза, но и для предотвращения офтальмопатии Грейвса. В пользу этого свидетельствуют и данные других авторов, исследовавших специфическую активность других аллостерических лигандов рецептора ТТГ с активностью инверсионных агонистов [13, 14]. Соединение NCGC00229600, производное 2,3-дигидрохиназолин-4-она, снижало стимулирующий аденилатциклазу эффект аутоантител к рецептору ТТГ в культуре тироцитов человека и соответствующий эффект ТТГ и аутоантител в культуре ретроорбитальных фибробластов, полученных от пациентов с офтальмопатией Грейвса [13, 14]. Соединение S37a подавляло стимуляцию аденилатциклазы, вызванную ТТГ и ауто-ТТГР-антителами (стимулирующими моноклональными антителами TSAb M22 человека и олигоклональными антителами TSAb, полученными от пациентов с болезнью Грейвса) [15]. Следует, однако, отметить, что эти инверсионные агонисты были изучены только в условиях in vitro, с использованием клеточных культур, что не позволяет оценить их возможный терапевтический потенциал. Только в случае соединения S37a были проведены пилотные исследования по его токсичности и биодоступности, но влияние S37a на тиреоидный статус и компоненты ТТГ-зависимых систем не оценивалось [15].

Ранее нами было показано, что TP48 при в/б введении в дозе 25 мг/кг снижает в щитовидной железе крыс базальный уровень экспрессии гена Na+/I‒-симпортера, осуществляющего транспорт йода в фолликулярные клетки, и подавляет TRH-стимулированную экспрессию всех изученных в том исследовании генов тиреоидогенеза – Tg, Tpo и Nis [16, 17]. В настоящем исследовании мы показали сходный паттерн ингибирующего влияния TP48, вводимого в более низкой дозе 20 мг/кг, на экспрессию генов, вовлеченных в синтез ТГ, но значимое снижение было обнаружено только в отношении экспрессии генов Tg и Dio2 (рис. 2). Соединение TPY5 при пероральном введении снижало базальную экспрессию гена Tpo и подавляло TRH-стимулированную экспрессию генов Tg и Dio2, причем в большей степени в сравнении с TP48 (рис. 3).

 

Рис. 3. Влияние TPY5 при его пероральном введении на экспрессию генов тиреоглобулина (Tg), тиреопероксидазы (Tpo), дейодиназы 2-го типа (Dio2) и Na⁺/I⁻-симпортера (Nis) в щитовидной железе крыс с обработкой тиролиберином и без таковой. Различия статистически значимы при p < 0.05 при сравнении с контролем (ᵃ), группами TPY5or (ᵇ) или TRH (ᶜ). Значения представлены как M±SEM, во всех группах n = 6. Для сравнения групп использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), апостериорный анализ проводили с использованием теста Тьюки.

 

Это является одной из ключевых причин снижения базальных и стимулированных TRH уровней ТГ у крыс с обработкой TP48 и TPY5. В свою очередь, снижение экспрессии генов тиреоидогенеза в щитовидной железе при обработке животных TP48 и TPY5 обусловлено вызываемым этими соединениями ослаблением стимуляции рецептора гормоном. Установлено, что стимуляция экспрессии генов тиреоглобулина, тиреопероксидазы и других компонентов системы синтеза ТГ реализуется через цАМФ-зависимый каскад, активируемый связыванием гормона с рецептором ТТГ, который включает в качестве конечного эффекторного звена транскрипционный фактор CREB (cAMP response element binding protein) [29-31]. Другими авторами было показано, что соединение NCGC00229600, наделенное активностью инверсионного агониста, подавляло и базальную, и стимулированную аутоантителами экспрессию гена Tpo с эффективностью, сходной с таковой TP48 и TPY5, но эти исследования были проведены в условиях in vitro, в первичной культуре тироцитов человека [13]. Еще один аллостерический регулятор, NCGC00242364, при введении мышам в 4–5 раз снижал TRH-стимулированную экспрессию генов Nis и Tpo, но не влиял на базальную, в том числе на конститутивно повышенную, активность рецептора ТТГ, функционируя как нейтральный антагонист [32].

Снижение содержания йода в организме, приводящее к его дефициту и к снижению продукции ТГ, повышает экспрессию транскрипционных факторов TTF-1 и PAX8, которые положительно регулируют экспрессию гена Tshr [33]. В нашем исследовании у крыс, обработанных TRH, на фоне повышения продукции ТГ отмечали снижение экспрессии гена Tshr в среднем в 3–4 раза (рис. 1), что обусловлено запуском отрицательных обратных связей в тиреоидной оси. В связи с этим достаточно неожиданными оказались результаты влияния TP48 и TPY5 на экспрессию гена Tshr, которая в их присутствии снижалась (рис. 1). Одним из возможных объяснений этого может быть стабилизирующее или модулирующее влияние TP48 и TPY5 на интернализацию и внутриклеточный эндосомальный транспорт рецептора ТТГ, поскольку низкомолекулярные аллостерические регуляторы могут функционировать как шапероны для рецепторов гликопротеиновых гормонов [34]. Однако это требует дополнительных исследований, в том числе включающих изучение влияния TP48 и TPY5 на экспрессию и активность транскрипционных факторов TTF-1 и PAX8, регуляторов транскрипционной активности гена Tshr.

Таким образом, разработано новое соединение TPY5 – производное тиено-[2, 3-d]-пиримидина, которое при различных способах введения, в том числе при пероральном способе доставки, снижало как базальный, так и стимулированный TRH уровни ТГ, действуя как инверсионный агонист рецептора ТТВ основе эффекта TPY5 лежит его ингибирующее влияние на экспрессию генов, вовлеченных в синтез ТГ в щитовидной железе, а также снижение экспрессии рецептора ТТНесмотря на то, что ранее разработанный нами инверсионный агонист TP48 при его в/б введении сопоставим по активности с TPY5, он оказался неактивным при пероральном способе введения, что ограничивает его возможное применение в медицине. Тем самым, TPY5 может рассматриваться как прототип для создания лекарственных препаратов, предназначенных для лечения аутоиммунного гипертиреоза и офтальмопатии Грейвса, обусловленных выработкой в организме пациента стимулирующих аутоантител к рецептору ТТГ, а также для лечения и профилактики токсических аденом и опухолей щитовидной железы, обусловленных конститутивно повышенной активностью рецептора ТТГ.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эксперименты с животными проводились в соответствии с международными рекомендациями и были одобрены биоэтическим комитетом Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, протокол заседания № 4-2/2023 от 25.04.2023 г.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств Российского научного фонда (проект № 19-75-20122). Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

Идея работы и планирование эксперимента (А.О.Ш. и К.В.Д.), сбор данных (А.А.Б., И.А.Л., В.Н.С.), химический синтез (Е.А.Д., В.Н.С.), обработка данных (А.А.Б., И.А.Л, В.Н.С., К.В.Д., А.О.Ш.), написание и редактирование манускрипта (К.В.Д., А.О.Ш.).

×

作者简介

K. Derkach

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences

编辑信件的主要联系方式.
Email: derkatch_k@list.ru
俄罗斯联邦, St. Petersburg

A. Bakhtyukov

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: derkatch_k@list.ru
俄罗斯联邦, St. Petersburg

V. Sorokoumov

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences; Institute of Chemistry, St. Petersburg State University

Email: derkatch_k@list.ru
俄罗斯联邦, St. Petersburg; St. Petersburg

I. Lebedev

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: derkatch_k@list.ru
俄罗斯联邦, St. Petersburg

E. Didenko

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: derkatch_k@list.ru
俄罗斯联邦, St. Petersburg

A. Shpakov

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: derkatch_k@list.ru
俄罗斯联邦, St. Petersburg

参考

  1. Biondi B, Cappola AR, Cooper DS (2019) Subclinical Hypothyroidism: A Review. JAMA 322(2): 153–160. https://doi.org/10.1001/jama.2019.9052
  2. Vanderpump MP (2011). The epidemiology of thyroid disease. British medical bulletin 99: 39–51. https://doi.org/10.1093/bmb/ldr030
  3. Bekkering GE, Agoritsas T, Lytvyn L, Heen AF, Feller M, Moutzouri E, Abdulazeem H, Aertgeerts B, Beecher D, Brito JP, Farhoumand PD, Singh Ospina N, Rodondi N, van Driel M, Wallace E, Snel M, Okwen PM, Siemieniuk R, Vandvik PO, Kuijpers T, Vermandere M (2019) Thyroid hormones treatment for subclinical hypothyroidism: a clinical practice guideline. BMJ 365: l2006. https://doi.org/10.1136/bmj.l2006
  4. Hoang TD, Stocker DJ, Chou EL, Burch HB (2022) Update on Clinical Management of Graves Disease and Thyroid Eye Disease. Endocrinol Metab Clin North Am 51(2): 287–304. https://doi.org/10.1016/j.ecl.2021.12.004
  5. Vos XG, Endert E, Zwinderman AH, Tijssen JG, Wiersinga WM (2016) Predicting the Risk of Recurrence Before the Start of Antithyroid Drug Therapy in Patients With Graves’ Hyperthyroidism. J Clin Endocrinol Metab 101(4): 1381–1389. https://doi.org/10.1210/jc.2015-3644
  6. Whitmer D, Phay JE, Holt S, O’Donnell B, Nguyen J, Joseph D, Chi A, Wu S, Hao Y, Huang J, Klopper JP, Kloos RT, Kennedy GC, Shin J (2022) Risk of malignancy in cytologically indeterminate thyroid nodules harboring thyroid stimulating hormone receptor mutations. Front Endocrinol (Lausanne) 13: 1073592. https://doi.org/10.3389/fendo.2022.1073592
  7. Langdon J, Gupta A, Sharbidre K, Czeyda-Pommersheim F, Revzin M (2023) Thyroid cancer in pregnancy: diagnosis, management, and treatment. Abdom Radiol (NY) 48(5): 1724–1739. https://doi.org/10.1007/s00261-023-03808-1
  8. Jäschke H, Neumann S, Moore S, Thomas CJ, Colson AO, Costanzi S, Kleinau G, Jiang JK, Paschke R, Raaka BM, Krause G, Gershengorn MC (2006) A low molecular weight agonist signals by binding to the transmembrane domain of thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR) and luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor (LHCGR). J Biol Chem 281(15): 9841–9844. https://doi.org/10.1074/jbc.C600014200
  9. Kleinau G, Worth CL, Kreuchwig A, Biebermann H, Marcinkowski P, Scheerer P, Krause G (2017) Structural-Functional Features of the Thyrotropin Receptor: A Class A G-Protein-Coupled Receptor at Work. Front Endocrinol (Lausanne) 8: 86. https://doi.org/10.3389/fendo.2017.00086
  10. Mezei M, Latif R, Das B, Davies TF (2021) Implications of an Improved Model of the TSH Receptor Transmembrane Domain (TSHR-TMD-TRIO). Endocrinology 162(7): bqab051. https://doi.org/10.1210/endocr/bqab051
  11. Fokina EA, Shpakov AO (2022) Thyroid-stimulating hormone receptor: role in the development of thyroid pathology and its correction. J Evol Biochem Physiol 58(5): 1439–1454. https://doi.org/10.1134/S0022093022050143
  12. Neumann S, Huang W, Eliseeva E, Titus S, Thomas CJ, Gershengorn MC (2010) A small molecule inverse agonist for the human thyroid-stimulating hormone receptor. Endocrinology 151(7): 3454–3459. https://doi.org/10.1210/en.2010-0199
  13. Neumann S, Eliseeva E, McCoy JG, Napolitano G, Giuliani C, Monaco F, Huang W, Gershengorn MC (2011) A new small-molecule antagonist inhibits Graves’ disease antibody activation of the TSH receptor. J Clin Endocrinol Metab 96(2): 548–554. https://doi.org/10.1210/jc.2010-1935
  14. Neumann S, Pope A, Geras-Raaka E, Raaka BM, Bahn RS, Gershengorn MC (2012) A drug-like antagonist inhibits thyrotropin receptor-mediated stimulation of cAMP production in Graves’ orbital fibroblasts. Thyroid 22(8): 839–843. https://doi.org/10.1089/thy.2011.0520
  15. Marcinkowski P, Hoyer I, Specker E, Furkert J, Rutz C, Neuenschwander M, Sobottka S, Sun H, Nazare M, Berchner-Pfannschmidt U, von Kries JP, Eckstein A, Schülein R, Krause G (2019) A New Highly Thyrotropin Receptor-Selective Small-Molecule Antagonist with Potential for the Treatment of Graves’ Orbitopathy. Thyroid 29(1): 111–123. https://doi.org/10.1089/thy.2018.0349
  16. Derkach KV, Bakhtyukov AA, Sorokoumov VN, Shpakov AO (2020) New Thieno-[2,3-d]pyrimidine-Based Functional Antagonist for the Receptor of Thyroid Stimulating Hormone. Dokl Biochem Biophys 491(1): 77–80. https://doi.org/10.1134/S1607672920020064
  17. Derkach KV, Fokina EA, Bakhtyukov AA, Sorokoumov VN, Stepochkina AM, Zakharova IO, Shpakov AO (2022) The Study of Biological Activity of a New Thieno[2,3-D]-Pyrimidine-Based Neutral Antagonist of Thyrotropin Receptor. Bull Exp Biol Med 172(6): 713–717. https://doi.org/10.1007/s10517-022-05462-x
  18. Derkach KV, Dar’in DV, Lobanov PS, Shpakov AO (2014) Intratesticular, intraperitoneal, and oral administration of thienopyrimidine derivatives increases the testosterone level in male rats. Dokl Biol Sci 459: 326–329. https://doi.org/10.1134/S0012496614060040
  19. Derkach KV, Bogush IV, Berstein LM, Shpakov AO (2015) The Influence of Intranasal Insulin on Hypothalamic-Pituitary-Thyroid Axis in Normal and Diabetic Rats. Horm Metab Res 47(12): 916–924. https://doi.org/10.1055/s-0035-1547236
  20. Chiamolera MI, Wondisford FE (2009) Minireview: Thyrotropin-releasing hormone and the thyroid hormone feedback mechanism. Endocrinology 150(3): 1091–1096. https://doi.org/10.1210/en.2008-1795
  21. Ginsberg J (2003) Diagnosis and management of Graves’ disease. CMAJ 168(5): 575-585.
  22. Catania A, Guaitoli E, Carbotta G, Bianchini M, Di Matteo FM, Carbotta S, Nardi M, Fabiani E, Grani G, D’Andrea V, Fumarola A (2013) Total thyroidectomy for Graves’ disease treatment. Clin Ter 164(3): 193–196. https://doi.org/10.7417/CT.2013.1548
  23. Ma C, Xie J, Wang H, Li J, Chen S (2016) Radioiodine therapy versus antithyroid medications for Graves’ disease. Cochrane Database Syst Rev 2(2): CD010094. https://doi.org/ 10.1002/14651858.CD010094.pub2
  24. Krieger CC, Boutin A, Jang D, Morgan SJ, Banga JP, Kahaly GJ, Klubo-Gwiezdzinska J, Neumann S, Gershengorn MC (2019) Arrestin-β-1 Physically Scaffolds TSH and IGF1 Receptors to Enable Crosstalk. Endocrinology 160(6): 1468–1479. https://doi.org/10.1210/en.2019-00055
  25. Cui X, Wang F, Liu C (2023) A review of TSHR- and IGF-1R-related pathogenesis and treatment of Graves’ orbitopathy. Front Immunol 14: 1062045. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1062045
  26. Wiersinga WM (2011) Autoimmunity in Graves’ ophthalmopathy: the result of an unfortunate marriage between TSH receptors and IGF-1 receptors? J Clin Endocrinol Metab 96(8): 2386–2394. https://doi.org/10.1210/jc.2011-0307
  27. Шпаков АО, Деркач КВ, Дарьин ДВ, Лобанов ПС (2014). Активация аденилатциклазы тиенопиримидиновыми производными в семенниках и яичниках крыс. Цитология 56(5): 346–352. [Shpakov AO, Derkach KV, Dar’in DV, Lobanov PS (2014) Activation of adenylyl cyclase in the testes and ovaries of rats using thienopyrimidine derivatives. Tsitologiia 56(5): 346–352. (In Russ)].
  28. Деркач КВ, Легкодух АС, Дарьин ДВ, Шпаков АО (2016). Стимулирующее влияние тиенопиримидинов, структурных аналогов Org43553, на активность аденилатциклазы в семенниках и на продукцию тестостерона у самцов крыс. Цитология 58(8): 602–609. [Derkach KV, Legkodukh AS, Dar’in DV, Shpakov AO (2016) The stimulating effect of thienopyrimidines, the structural analogs of Org 43553, on the activity of adenylyl cyclase in the testes and on the testosterone production in male rats. Tsitologiia 58(8): 602–609. (In Russ)].
  29. Chu YD, Yeh CT (2020) The Molecular Function and Clinical Role of Thyroid Stimulating Hormone Receptor in Cancer Cells. Cells 9(7): 1730. https://doi.org/10.3390/cells9071730
  30. Jang D, Marcus-Samuels B, Morgan SJ, Klubo-Gwiezdzinska J, Neumann S, Gershengorn MC (2020) Thyrotropin regulation of differentiated gene transcription in adult human thyrocytes in primary culture. Mol Cell Endocrinol 518: 111032. https://doi.org/10.1016/j.mce.2020.111032
  31. Jang D, Eliseeva E, Klubo-Gwiezdzinska J, Neumann S, Gershengorn MC (2022) TSH stimulation of human thyroglobulin and thyroid peroxidase gene transcription is partially dependent on internalization. Cell Signal 90: 110212. https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2021.110212
  32. Neumann S, Nir EA, Eliseeva E, Huang W, Marugan J, Xiao J, Dulcey AE, Gershengorn MC (2014) A selective TSH receptor antagonist inhibits stimulation of thyroid function in female mice. Endocrinology 155(1): 310–314. https://doi.org/10.1210/en.2013-1835
  33. Huang H, Chen L, Liang B, Cai H, Cai Q, Shi Y (2016) Upregulation of TSHR, TTF-1, and PAX8 in Nodular Goiter Is Associated with Iodine Deficiency in the Follicular Lumen. Int J Endocrinol 2016: 2492450. https://doi.org/10.1155/2016/2492450
  34. Newton CL, Whay AM, McArdle CA, Zhang M, van Koppen CJ, van de Lagemaat R, Segaloff DL, Millar RP (2011) Rescue of expression and signaling of human luteinizing hormone G protein-coupled receptor mutants with an allosterically binding small-molecule agonist. Proc Natl Acad Sci U S A 108(17): 7172–7176. https://doi.org/10.1073/pnas.1015723108

补充文件

附件文件
动作
1. JATS XML
下载
2. Fig.1. Effect of intraperitoneally administered TP48 (a) and orally administered TPY5 (b) on the expression of the TSH receptor gene (Tshr) in the thyroid gland of rats with and without treatment with thyrotropin-releasing hormone. The differences are statistically significant at p < 0.05 when compared with the control (ᵃ) and the TP48ip or TPY5or groups (ᵇ). Values ​​are presented as M ± SEM, all groups n = 6. One-way analysis of variance (ANOVA) was used to compare groups, and post hoc analysis was performed using Tukey's test.

下载 (260KB)
索引源数据
3. Fig.2. Effect of TP48, when administered intraperitoneally, on the expression of thyroglobulin (Tg), thyroid peroxidase (Tpo), deiodinase type 2 (Dio2) and Na⁺/I⁻-symporter (Nis) genes in the thyroid gland of rats with and without treatment with thyrotropin-releasing hormone. The differences are statistically significant at p < 0.05 when compared with control (ᵃ), TP48ip (ᵇ) or TRH (ᶜ) groups. Values ​​are presented as M ± SEM, all groups n = 6. One-way analysis of variance (ANOVA) was used to compare groups, and post hoc analysis was performed using Tukey's test.

下载 (409KB)
索引源数据
4. Fig.3. Effect of TPY5, when administered orally, on the expression of thyroglobulin (Tg), thyroid peroxidase (Tpo), deiodinase type 2 (Dio2) and Na⁺/I⁻-symporter (Nis) genes in the thyroid gland of rats with and without thyrotropin-releasing hormone treatment. The differences are statistically significant at p < 0.05 when compared with control (a), TPY5or (b) or TRH (c) groups. Values ​​are presented as M ± SEM, all groups n = 6. One-way analysis of variance (ANOVA) was used to compare groups, and post hoc analysis was performed using Tukey's test.

下载 (409KB)
索引源数据

版权所有 © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».