Activated Endothelium Changes The Activity Of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells During Physiological Hypoxia Or Short Hypoxic Stress In Vitro

Мұқаба

Дәйексөз келтіру

Толық мәтін

Аннотация

Multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) are used for supplemental therapy of ischemic and inflammatory diseases. After systemic administration, transmigration of MSCs to the target tissue is accompanied by interaction with activated endothelial cells (ECs) at the site of injury. In this study, we investigated the influence of TNF-α-activated ECs on the functions of MSCs under different levels of hypoxia. For this purpose, MSCs and TNF-α activated ECs were cocultured in a direct cell-to-cell setting for a short period of time. MSCs retained their stromal phenotype and multilineage differentiation potential after interaction with activated ECs. At the same time, changes in molecules involved in MSC-cell and MSC-extracellular matrix interaction were detected. The paracrine activity of MSCs and activated ECs after interaction was demonstrated by both upregulated transcription and increased levels of pleiotropic IL-6 and IL-8. Proteases/antiproteases profiles were also altered after interaction. These data suggest that short-term interaction of MSCs with activated ECs may play an important role in tissue repair and remodeling processes. In particular, it may promote the migratory phenotype of MSCs. In comparison to physiological hypoxia – 5% O2, acute hypoxic stress (0.1% O2, 24 h) attenuated the stimulatory effects of ECs on MSCs.

Толық мәтін

ВВЕДЕНИЕ

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) представляют собой клетки, основными функциями которых считаются поддержание гомеостаза и репарация тканей как путем дифференцировки в различные клеточные типы, так и за счет секреции факторов роста и цитокинов. Благодаря иммуноуклончивости для терапевтических целей можно использовать как аутологичные, так и аллогенные клетки [1, 2]. В настоящее время в ряде стран одобрено клиническое применение препаратов на основе МСК для дополнительной терапии различных заболеваний [2–4].

На функционирование МСК существенным образом влияет концентрация О2 в окружающих тканях. МСК располагаются в тканях периваскулярно, в условиях «физиологической» гипоксии (от 3 до 10% О2) [5, 6]. Культивирование МСК в условиях, близких к «физиологической» гипоксии, модулирует их важнейшие свойства, что способствует поддержанию их малодифференцированного состояния. In vitro продемонстрировано, что при 5% О2 в популяции МСК выявляется больше клеток, способных давать клоны – колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-ф) при лимитирующе низкой плотности посадки. При стандартной плотности культивирования такие МСК быстрее пролиферируют, менее чувствительны к остео- и адипогенным дифференцировочным стимулам [5, 7].

С другой стороны, значительная депривация О2 и увеличение содержания провоспалительных медиаторов могут выступать в качестве стимулов для вовлечения МСК в репаративное ремоделирование тканей. Показано, что краткосрочная депривация О2 (1–72 ч, < 1% O2) приводит к метаболическим изменениям, таким как усиление гликолиза [5, 8, 9], наблюдается реорганизация цитоскелета, стимуляция миграции [10, 11]. Кроме того, гипоксический стресс повышает секрецию паракринных факторов, которые оказывают трофическое действие на ткань, регулируя активность других клеток [10, 12, 13]. Установлено, что адаптивные изменения функциональных свойств МСК в ответ на гипоксический стресс могут быть обусловлены активацией HIF-1α-зависимого сигнального пути [8, 14, 15].

Ряд доклинических и клинических исследований продемонстрировал, что применение МСК может улучшать прогноз при различных заболеваниях [16–19]. Показано, что после системной трансфузии МСК частично задерживаются в легких, что ограничивает попадание в другие ткани [20, 21]. Однако терапевтический эффект обусловлен тем, что циркулирующие по кровеносной системе МСК активно мигрируют через эндотелиальный монослой стенки сосуда в поврежденный орган, клетки которого продуцируют медиаторы с хемотактическим действием [20–24]. В связи с этим внутрисосудистое введение МСК часто используется как метод доставки клеток в органы-мишени для терапевтических целей. Воспалительные цитокины (ФНО-α, IFNγ, интерлейкины и др.) не только служат хемоаттрактантами для МСК, но и активируют эпителиальные клетки (ЭК) сосудистой стенки. Активированные ЭК изменяют профиль продуцируемых растворимых медиаторов, а также экспрессируют молекулы адгезии, что необходимо для экстравазации МСК.

Конечные свойства МСК, используемых для терапии, зависят от параметров микроокружения, в которое они попадут. По мере миграции в область повреждения МСК столкнутся с активированными ЭК и гипоксией разной степени выраженности. Известно, что концентрация О2 в среде влияет на свойства МСК, однако неизвестно, как изменится ответ при взаимодействии с ЭК. Хотя миграция МСК из сосудистого русла в ткань занимает несколько часов [19, 25, 26], даже непродолжительный контакт с эндотелием может повлиять на репаративные свойства стромальных клеток.

Известно, что взаимодействие in vitro МСК и ЭК в течение 24–72 ч индуцирует экспрессию генов миогенной дифференцировки и способствует увеличению продукции ИЛ-6 [27–29]. Эти данные указывают на изменения функциональных свойств МСК, важных для участия в репарации ткани.

Цель настоящей работы заключалась в изучении эффектов провоспалительно активированных ЭК на МСК в условиях гипоксии разной степени выраженности.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение и культивирование МСК

Образцы МСК из жировой ткани человека были получены из коллекции Лаборатории клеточной физиологии Института медико-биологических проблем РАН. Культивирование МСК проводили на чашках Петри, используя полную ростовую среду α-МЕМ (Gibco, США), с добавлением 10% ФТС (HyClone, США), 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия) при 5% O2 в CO2-инкубаторе (Sanyo, Япония), как описано ранее [30]. В экспериментах использовали клетки 3–6 пассажей.

Культивирование ЭК

ЭК из вены пупочного канатика были предоставлены Банком пуповинной крови Криоцентра (Москва, Россия) в рамках научного соглашения. ЭК культивировали в среде 199 с 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 25 мМ HEPES (Gibco, Life Technologies, США), 50 ед./мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% ФТС (Hyclone, США), 200 мкг/мл фактора роста эндотелиальных клеток (Sigma-Aldrich, США) при 20% O2 в CO2-инкубаторе (Sanyo, Япония). После пассирования клетки культивировали на чашках Петри, покрытых 0.2%-ным раствором желатина в полной ростовой среде 199. В экспериментах использовали ЭК 3–5 пассажей. ЭК активировали с использованием ФНО-α (10 нг/мл) (Abcam, США) в течение 24 ч.

Схема эксперимента

Для оценки эффектов активированных ФНО-α ЭК на МСК при тканевых значениях О2 использовали модель контактного сокультивирования в соответствии со схемой (рис. 1). ЭК активировали в состоянии предмонослоя, добавляя среду, содержащую 10 нг/мл ФНО-α на 24 ч. Далее клетки отмывали от среды с ФНО-α и добавляли суспензию МСК к активированным ЭК в соотношении 1:1. Культуральную среду меняли во всех чашках на свежую (α-МЕМ и 199 в соотношении 1:1) и инкубировали 24 ч. После этого сокультуры и монокультуры клеток трипсинизировали и анализировали экспрессию молекул адгезии методом проточной цитометрии. Клеточные сокультуры разделяли методом иммуносепарации с использованием микрочастиц, несущих CD31 антитела (Miltenyi biotec, США).

 

Рис. 1. Схема эксперимента по оценке эффектов взаимодействия мезенхимальных стромальных и эндотелиальных клеток.

 

Проточная цитометрия

МСК были охарактеризованы по экспрессии минимального набора поверхностных маркеров в соответствии с рекомендациями Международного общества клеточной терапии [31]. Для анализа использовали первичные мышиные моноклональные антитела: CD45, CD73, CD90 и CD105 (IgG1) (Immunotech, Франция). В ЭК оценивали экспрессию ряда эндотелиальных маркеров CD144, CD106, CD62E, CD54 (Immunotech, Франция). В качестве отрицательного контроля (автофлуоресценция) использовали FITC- или PE-конъюгированные изотипические антитела IgG1 мыши (Immunotech, Франция).

Для оценки жизнеспособности клеток моно- и сокультуры отделяли с помощью трипсина и окрашивали с использованием набора Annexin V – FITC kit (Beckman Coulter, Франция).

Содержание активных форм кислорода (АФК) в клетках определяли с помощью красителя H2DCFDA (Sigma, США) (ex/em ~492-495/517-527 нм) в концентрации 10 мкМ. Продукцию оксида азота (ОА) определяли после окрашивания клеток 5мкМ раствором DAF-FM Diacetate (Sigma, США) (ex/em ~495/515 нм). Инкубация клеток в среде, содержащей зонд, проводилась 30 мин при 37°С в условиях 5 или 0.1% О2. Далее клетки открепляли при помощи трипсина и анализировали на проточном цитофлуориметре Accuri C6 (BD Biosciences, США).

Подсчет КОЕ-ф

Колониеобразующая активность МСК оценивалась после посева клеток в низкой плотности на чашки Петри (100 клеток на чашку) диаметром 35 мм. Чашки инкубировали 14 дней, далее образцы фиксировали и окрашивали в течение 5 мин 0.5%-ным раствором кристалл-виолета в метаноле. Чашки с фиксированными клетками высушивали, затем окрашенные колонии подсчитывали.

Направленная миграция МСК

Для определения скорости направленной миграции МСК использовали модифицированную камеру Бойдена, где в качестве нижней камеры выступает ячейка 24-луночного планшета, а верхней камеры – ячейка-вставка (трансвелл, Corning) с полупроницаемой мембраной. В лунки планшета добавляли кондиционированную среду от ЭК, контролем служила ростовая среда для культивирования эндотелия. 20 тыс. клеток помещали в трансвеллы, далее планшеты инкубировали 24 ч в CO2-инкубаторе при 20% О2. Прикрепившиеся к мембране МСК фиксировали 4%-ным параформальдегидом и окрашивали 30%-ным раствором йодида пропидия в фосфатном буферном растворе. Трансвелл помещали на предметное стекло, далее фотографировали 5 случайных полей зрения в режиме флуоресцентной микроскопии. На микрофотографиях с помощью программы ImageJ (Wayne Rasband, США) подсчитывали количество ядер, окрашенных йодидом пропидия.

Ненаправленная миграция МСК в модели «рана»

Скорость ненаправленной миграции МСК определяли в модели «рана». МСК выращивали до состояния монослоя, наносили «рану» путем механического повреждения и меняли среду для культивирования на кондиционированную среду от ЭК. Далее чашки инкубировали 24 ч при 20% О2. На дне чашки Петри с МСК обозначали 5 случайных участков для фотографирования «раны». Состояние «раны» фотографировали сразу после нанесения механического повреждения (точка 0 ч) и через 24 ч с помощью микроскопа Nikon Eclipse Ti-U. С использованием программы NIS-elements AR версии 3.21 (Nikon, Германия) подсчитывали площадь раны в нулевой точке и через 24 ч, по этим показателям оценивали подвижность МСК.

Определение концентрации цитокинов в среде культивирования

Паракринный ответ МСК и ЭК в монокультурах и после взаимодействия изучали путем анализа уровня цитокинов в кондиционированной среде методом иммуноферментного анализа (ИФА). После 72 ч сокультивирования кондиционированную среду собирали, затем определяли концентрации медиаторов с использованием наборов для ИФА IL-6, IL-8 и набора реагентов BD OptEIA ™ (BD, США) в соответствии с инструкцией производителя.

ОТ-ПЦР

Для оценки экспрессии генов RUNX2, SOX9, PPARγ, IL6, IL8 клеточные культуры трипсинизировали. Сокультуру МСК и ЭК разделяли путем магнитной иммуносепарации. Далее выделяли мРНК с использованием Trizol (Qiagen, США). С использованием Quantitech Reverse Transcription Kit (Qiagen, США) на матрице мРНК синтезировали кДНК. Экспрессию генов производили методом ОТ-ПЦР на амплификаторе Mx3000P (Stratagene, США), используя праймеры к соответствующим генам (Qiagen). Для определения относительного значения изменения уровня экспрессии целевых генов в качестве контрольного гена использовали значения экспрессии гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), транскрипция которого постоянна в различном уровне О2. Кратность изменения экспрессии генов рассчитывали с использованием метода 2−ΔΔCt (где Ct – номер порогового цикла).

Анализ профиля протеаз/ингибиторов, продуцируемых МСК

Для оценки белкового профиля МСК после сокультивирования с ЭК определяли содержание соответствующих ферментов в лизатах МСК с использованием наборов Human Protease Array/Human Inhibitor Array Kit (R&D Systems, США) в соответствии с инструкцией производителя. Детекцию хемилюминесцентного сигнала проводили на приборе ChemiDoc МР (Biorad, США).

Статистический анализ

Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартного отклонения (M ± SD). Статистическую достоверность различий между двумя группами данных оценивали с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни. В каждой группе сравнения количество образцов n ≥ 3. Различия считали достоверными при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

МСК в условиях депривации О2

Прежде чем проводить сокультивирование с ЭК, в МСК охарактеризовали жизнеспособность, иммунофенотип и экспрессию генов, кодирующих белки, связанные с дифференцировкой, и продукцию плейотропных цитокинов ИЛ-6, ИЛ-8.

МСК как при 5, так и при 0.1% О2 соответствовали минимальным критериям Общества по клеточной терапии [31]. Клетки прикреплялись к поверхности культурального пластика, а также характеризовались фибробластоподобной формой (рис. 2a). Кроме того, независимо от уровня О2 МСК экспрессировали стромальные маркеры (CD90, CD73, CD105) и не экспрессировали маркер гемопоэтических клеток (CD45) (табл. 1).

 

Рис. 2. Характеристика культивируемых МСК при различном содержании О2. (a) – репрезентативная микрофотография культивируемых МСК при 5% О2, масштабный отрезок 100 мкм; (b) – характеристика жизнеспособности МСК с применением флуоресцентных красителей аннексин/йодид пропидия (Ann/PI); представлены репрезентативные гистограммы (нижний левый квадрант – популяция живых клеток, верхний левый квадрант – клетки в состоянии раннего апоптоза, правый верхний квадрант – клетки в состоянии позднего апоптоза, нижний правый квадрант – клетки в состоянии некроза); (c) – продукция АФК; (d) – экспрессия генов-регуляторов дифференцировки в МСК, представлена кратность изменения экспрессии генов по сравнению с монокультурой МСК при 5% О2; (e) – продукция ИЛ-6, ИЛ-8 в МСК. На графиках представлена медиана, межквартильный разброс, максимальные и минимальные значения, n ≥ 4, * – p < 0.05 по сравнению с монокультурой МСК, культивируемых при 5% О2.

 

Таблица 1. Экспрессия стромальных маркеров МСК

Антиген

Условия культивирования

5% O2

0.1% O2, 24 ч

CD90

93.2–98.8 (96.0)

97.3–98.8 (98.1)

CD73

99.0–99.5 (99.3)

99.0–99.9 (99.5)

CD105

97.6–99.3 (98.5)

98.2–99.5 (98.9)

CD45

0.5–1.0 (0.8)

0.7–1.0 (0.9)

 

Независимо от содержания О2 в среде культивирования МСК имели высокую жизнеспособность. При 5% О2 жизнеспособность клеток составила 95.3–95.7%. Клетки в состоянии раннего апоптоза составили 1.3–2.1%, в состоянии позднего апоптоза – 1.2–1.6% от общего количества МСК в образцах. В условиях гипоксического стресса (0.1% О2) МСК также демонстрировали высокий уровень жизнеспособности (95.4–96.8%), при этом доля клеток в состоянии раннего и позднего апоптоза составила 1.6–2.2% и 1.2–1.4% соответственно (рис. 2b). После воздействия гипоксического стресса МСК характеризовались в 1.3 раза более высокой продукцией АФК (H2O2) по сравнению с клетками, культивируемыми при 5% О2 (рис. 2c). В условиях гипоксического стресса и при 5% О2 уровень транскрипции генов-регуляторов дифференцировки RUNX2, SOX9, PPARγ не отличался (рис. 2d). Оценка паракринной активности не выявила отличий в продукции ИЛ-8, однако продемонстрировала снижение концентрации ИЛ-6 в кондиционированной среде от МСК при действии гипоксического стресса (рис. 2e).

ЭК при активации ФНО-α и депривации О2

Также мы оценили влияние ФНО-α и депривации О2 на экспрессию молекул межклеточного взаимодействия, жизнеспособность и продукцию активных форм кислорода в ЭК.

Неактивированные ЭК из пупочной вены демонстрировали эндотелиальный фенотип (рис. 3a). Клетки имели округлую и полигональную форму, формировали группы по 5–10 клеток при низкой плотности, сохраняли исходную жизнеспособность, экспрессировали высокий уровень VE-кадгерина и характеризовались низким уровнем VCAM-1, ICAM-1, Е-селектина (рис. 3b; табл. 2).

 

Рис. 3. Влияние активации ФНО-α и депривации О2 на ЭК при различном уровне О2. (a) – интактные и ФНО-α активированные ЭК после краткосрочного культивирования при 5% О2, световая микроскопия, репрезентативные микрофотографии ЭК при 5% О2, масштабный отрезок 100 мкм; (b) – жизнеспособность ЭК, представлены репрезентативные гистограммы (нижний левый квадрант – популяция живых клеток, верхний левый квадрант – клетки в состоянии раннего апоптоза, правый верхний квадрант – клетки в состоянии позднего апоптоза, нижний правый квадрант – клетки в состоянии некроза); (c) – экспрессия молекул адгезии на ЭК при различном уровне О2, репрезентативные гистограммы при 5% О2. ECs – интактные ЭК, ECs TNF-α – активированные ЭК, control – клетки, окрашенные изотипическими IgG1 антителами.

 

Таблица 2. Характеристика культивируемых ЭК в условиях депривации О2 и активации ФНО-α

Единицы измерения

Показатель

Концентрация О2

20%

20→5%, 24 ч

20→0.1%, 24 ч

ЭК

ЭК

ЭК+ФНО

ЭК

ЭК+ФНО

% клеток

An-/PI-

90.0–94.3 (92.1)

88.6–93.4 (91.0)

85.0–90.0 (87.6)

91.1–95.8 (93.4)

90.0–93.0 (92.3)

ИФ*103

VE- кадгерин

49.7–81.9 (51.7)

27.1–117.3 (55.5)

30.0–117.1 (54.0)

34.2–119.4 (41.2)

29.7–111.3 (49.8)

VCAM-1

9.3–26.9 (17.3)

11.1–20.1 (15.1)

23.0–34.5 (28.3)

12.0–27.7 (19.8)

18.4–26.7 (18.6)

ICAM-1

28.0–36.0 (31.7)

28.0–36.0 (31.7)

517.0–699.0 (620.1) *

27.8–28.8 (28.3)

578.8–755.9 (668.3) #

Е- селектин

18.8–25.4 (22.0)

25.5–30.1 (27.3)

30.0–32.3 (31.4)

20.9–23.2 (22.9)

27.3–29.6 (27.8)

АФК, отн. ед.

H2O2

1

0.4–1.3 (0.8)

1.6–2.7 (2.2)

1.7–3.0 (2.4)*

5.1–8.7 (6.9) #

NO

1

0.5–1.1 (0.9)

0.9–1.9 (1.4)

0.9–2.2 (1.7)

2.5–2.6 (2.5) #

ЭК – монокультура интактных ЭК, ЭК ФНО – ФНО-α активированные ЭК. В таблице представлены минимальное, максимальное значение и медиана (в скобках), n ≥ 3. В связи с отличиями в базовых значениях интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных зондом для детекции NO и Н2О2, в таблице этот показатель представлен в относительных единицах по отношению к флуоресценции ЭК, постоянно культивируемых при 20% О2. * – p < 0.05 по сравнению с ЭК 5% О2, # – p < 0.05 по сравнению с ЭК 0.1% О2. ИФ*103 – интенсивность флуоресценции на клетку.

 

Активированные ЭК были более вытянутыми (рис. 3a), при этом доля жизнеспособных клеток составила 88.1–95.1% при 5% О2 и 91.6–93.2% при 0.1% О2, что было сопоставимо с активированными ЭК при 20% О2 (90.3–96.1%) (рис. 3b; табл. 2). Активация при различном содержании О2 вызывала увеличение экспрессии маркера провоспалительной активации ICAM-1 в эндотелиальных клетках. Индукция экспрессии Н2О2 наблюдалась при действии гипоксического стресса. Сочетанное действие ФНО-α и гипоксического стресса вызывало повышение уровня не только Н2О2, но и NО (табл. 2).

Взаимодействие МСК и активированных ЭК при депривации О2 различной степени

После взаимодействия с активированными ЭК при 5 и 0.1% О2 МСК сохраняли стромальный фенотип: имели высокую экспрессию поверхностных стромальных маркеров СD90, CD73, СD105 и не экспрессировали маркер CD45, характерный для гемопоэтических клеток (табл. 3), а также сохраняли исходное число КОЕ-ф (табл. 4).

 

Таблица 3. Характеристика иммунофенотипа МСК после взаимодействия с активированными ЭК

Концентрация О2

CD90

CD73

CD105

CD44

CD45

5%

92.7–98.0 (95.4)

97.9–99.1 (98.5)

97.4–99.2 (98.3)

97.0–100.0 (99.9)

0.9–1.1 (1.0)

0.1%

93.2–98.0 (95.6)

96.0–99.0 (96.1)

98.3–99.2 (98.8)

99.0–100.0 (99.9)

0.2–1.5 (1.0)

Указана доля положительно окрашенных клеток. Данные представлены как минимальное – максимальное значение и медиана (в скобках), n ≥ 4.

 

Таблица 4. Колониеобразующая способность МСК после взаимодействия с активированными ЭК

Параметр

МСК 5% O2

МСК+ЭК ФНО 5% O2

МСК 0.1% O2

МСК+ЭК ФНО 0.1% O2

КОЕ-ф

190–250 (205)

180–280 (200)

100–250 (170)

150–280 (215)

Указано количество колоний, образованных КОЕ-ф/1000 МСК. Данные представлены как минимальное – максимальное значение и медиана (в скобках), n ≥ 3. МСК – монокультура МСК, МСК+ЭК ФНО – МСК после 24 ч сокультивирования с активированными ФНО-α ЭК.

 

Морфологический анализ показал, что через 24 ч после добавления МСК к эндотелиальному монослою наблюдалось распределение стромальных клеток между группами (кластерами) ЭК. Характер распределения клеток в сокультурах был схожим при различном уровне О2 в среде (рис. 4a).

 

Рис. 4. Морфология и транскрипционный профиль МСК после взаимодействия с ЭК активированными ФНО-α. (a) – вид сокультуры через 24 ч при 5 и 0.1% О2. Представлены репрезентативные изображения, полученные путем совмещения микрофотографий, сделанных в режиме фазового контраста и флуоресценции, эндотелиальные клетки окрашены флуоресцентным красителем PKH27. Масштабный отрезок равен 100 мкм. Стрелками указаны МСК; (b), (c) – экспрессия дифференцировочных генов МСК после взаимодействия с ЭК, активированными при пониженном содержании О2. На графиках показана кратность изменения экспрессии генов в МСК после сокультивирования по сравнению с монокультурой МСК (пунктирная линия) в тех же условиях. Данные представлены как медиана, межквартильный разброс, максимальные и минимальные значения, n ≥ 3. * – p < 0.05 по сравнению с монокультурой МСК, культивируемых при 5% О2. MSC+EC TNF-α – МСК после 24 ч сокультивирования с активированными ФНО-α ЭК.

 

Для оценки влияния ЭК на мультилинейный дифференцировочный потенциал в МСК определяли уровень транскрипции генов-регуляторов хондрогенной (SOX9), остеогенной (RUNX2) и адипогенной (PPARγ) дифференцировок. После сокультивирования с активированными ЭК в МСК снижался уровень мРНК SOX9 в условиях «физиологической» гипоксии в 2.5 раза, а после гипоксического стресса в 2 раза (рис. 4b, c). Экспрессия RUNX2, PPARγ существенно не изменялась.

Краткосрочное взаимодействие c активированным эндотелием приводило к значимому увеличению количества МСК, которые экспрессировали интегрин α1, αVβ3, ICAM-1 и снижали количество клеток, экспрессирующих интегрин α4 и N-кадгерин при «физиологической» гипоксии и при гипоксическом стрессе. Также изменялась средняя интенсивность флуоресценции окрашенных антителами интегринов α1, αVβ3, α4, ICAM-1 и N-кадгерина. В условиях гипоксического стресса было отмечено возрастание средней интенсивности флуоресценции интегрина α5 на МСК в моно- и сокультуре по сравнению с культивируемыми клетками при «физиологической» гипоксии (рис. 5). Таким образом, после сокультивирования с ЭК при гипоксии разной степени (5, 0.1% O2) наблюдалось изменение экспрессии молекул адгезии МСК, участвующих в образовании межклеточных контактов и контактов с компонентами внеклеточного матрикса.

 

Рис. 5. Экспрессия молекул межклеточного взаимодействия МСК после сокультивирования с ФНО-α активированными ЭК. На графиках представлена доля положительно окрашенных МСК до и после взаимодействия с активированными ЭК (медиана, минимальное и максимальное значение). На этих же графиках размер пузырьков соответствует значению медианы интенсивности флуоресценции окрашенных клеток, n ≥ 3. * – p < 0.05 по сравнению с монокультурой МСК в тех же условиях культивирования. 1 – МСК 5% О2, 2 – МСК после сокультивирования с ЭК 5% О2, 3 – МСК 0.1% О2, 4 – МСК после сокультивирования с ЭК 0.1% О2.

 

Секреция паракринных факторов МСК и активированных ФНО-α ЭК изменялась при взаимодействии, о чем свидетельствовало увеличение концентрации плейотропных цитокинов ИЛ-6, ИЛ-8 в среде от сокультур. В условиях физиологической гипоксии уровень ИЛ-6 в кондиционированной среде вырос в 3.4 раза, а уровень ИЛ-8 – в 6.5 раз по сравнению со средой от монокультуры МСК. После действия краткосрочного гипоксического стресса продукция ИЛ-6 и ИЛ-8 в сокультуре увеличилась в 3.9 и в 8.7 раз соответственно по сравнению с монокультурой МСК (рис. 6a, b). Анализ экспрессии генов цитокинов в МСК и ЭК показал, что сокультивирование индуцировало возрастание уровня мРНК IL6, IL8 в МСК и в активированных ЭК. Наблюдаемое возрастание экспрессии IL8 в клетках после сокультивирования было более выраженным при действии гипоксического стресса (0.1% О2, 24 ч). В этих же условиях возрастание экспрессии IL6 в обоих типах клеток было менее выраженным (рис. 6c, d). Таким образом, сокультивирование индуцировало как транскрипцию генов IL6 и IL8, так и продукцию этих цитокинов. Однако после гипоксического стресса в МСК и ЭК индукция транскрипции IL8 усиливалась, а индукция IL6 была не такой выраженной как при 5% О2.

 

Рис. 6. Изменение паракринной активности ЭК и МСК после взаимодействия при пониженном содержании О2. (a) – концентрация ИЛ-6 в среде от моно- и сокультур МСК и активированных ЭК; (b) – концентрация ИЛ-8 в среде от моно- и сокультур МСК и активированных ЭК; (c) – изменение экспрессии генов IL6 и IL8 в МСК; (d) – изменение экспрессии генов IL6 и IL8 в ЭК. На графиках представлена кратность отличий экспрессии генов интереса в МСК (c) и ЭК (d) после взаимодействия по сравнению с монокультурой клеток (пунктирная линия) в тех же условиях культивирования. Данные представлены как медиана, межквартильный разброс, максимальные и минимальные значения, n = 3, * – p < 0.05 по сравнению с монокультурой МСК в тех же условиях культивирования. ** – p < 0.05 по сравнению с монокультурой ЭК в тех же условиях культивирования. MSC+EC TNF-α – МСК после взаимодействия с активированными ЭК. EC TNF-α+MSC – активированные ЭК после взаимодействия с МСК.

 

МСК способны мигрировать в ткани благодаря способности отвечать на хемотактические стимулы, продуцируемые находящимися там клетками. Для оценки влияния активированных ЭК на подвижность МСК мы проанализировали эффективность ненаправленной (в модели рана) и направленной (в системе трансвелл) миграции клеток в кондиционированной среде. При различном содержании кислорода (5 и 0.1% О2) среда, полученная от активированных ЭК, по сравнению с обычной средой культивирования увеличивала процент закрытия площади экспериментальной «раны» (рис. 7a, b). Кроме того, количество клеток, мигрировавших через трансвелл в кондиционированной среде, в 2.5–3 раза превышало количество МСК, которые мигрировали в ростовой среде (рис. 7c, d). Таким образом, кондиционированная среда, полученная после культивирования активированных ЭК при гипоксии разной степени выраженности, увеличивала скорость направленной и ненаправленной миграции МСК.

 

Рис. 7. Паракринное влияние ЭК на подвижность МСК. (a) – ненаправленная миграция МСК в модели «рана» в кондиционированной среде от активированных ЭК. Репрезентативные микрофотографии сразу после нанесения «раны» (0 ч) и через сутки (24 ч); (b) – площадь закрытия раны. На графике площадь закрытия представлена в % относительно изначальной площади раны; (c) – направленная миграция МСК через мембрану трансвелл в кондиционированной среде от активированных ЭК. Репрезентативные микрофотографии, сделанные через 24 ч инкубации клеток в лунках планшетов; (d) – на графике представлена доля клеток, мигрировавших за 24 ч (соотношение клеток, мигрировавших в кондиционированной среде от ЭК, по сравнению с количеством клеток, мигрировавших в ростовой среде). Данные представлены как медиана, межквартильный разброс, максимальные и минимальные значения, n = 3. * – p < 0.05 по сравнению с количеством клеток, мигрировавших в ростовой среде (Cntrl). CM 5% О2 – кондиционированная среда от активированных ЭК, культивируемых при 5% О2. CM 0.1% О2 – кондиционированная среда от активированных ЭК, культивируемых при 0.1% О2.

 

МСК могут участвовать в ремоделировании внеклеточного матрикса за счет продукции различных протеаз/ингибиторов протеаз. В условиях повреждения и провоспалительного микроокружения это свойство необходимо для вовлечения клеток в процессы репарации ткани [32–35]. Были определены концентрации 32 протеаз, таких как металлоэндопептидазы, протеиназы ADAMTS, катепсины, калликреиновые протеазы, металлопротеазы и урокиназы (рис. 8, табл. 5). Также были проанализированы уровни 32 белков, обладающих регуляторным действием в отношении протеаз: цистатинов, ингибиторов сериновых протеаз (HAI), индуктора матриксных металлопротеаз (EMMPRIN), серпинов, белков семейства Testican, Latexin, ингибиторов тканевого фактора, тканевых ингибиторов металлопротеаз (табл. 6).

 

Рис. 8. Определение уровня протеаз в лизатах МСК до и после 24 ч сокультивирования с ЭК активированными ФНО-α. (a) – репрезентативные фотографии мембран; (b), (c) – схема расположения и названия детектирующих антител к различным протеазам.

 

Таблица 5. Влияние ФНО-α активированных ЭК на продукцию протеаз в МСК

Название протеазы

5% O2 МСК

5% O2 МСК + ЭК

0.1% O2 МСК

0.1% O2 МСК + ЭК

ADAMTS1

22.4–28.2

(25.3)

58.7–69.1

(63.9)*

27.4–27.6

(27.5)

75.2–78.6

(76.9)**

Cathepsin A

30.1–35.5

(32.8)

70–129.8

(99.9)*

40.0–48.0

(44.0)

93.4–162.6

(128.0)**

Cathepsin B

59.1–65.3

(62.2)

102.0–103.0

(102.5)*

75.8–76.8

(76.3)

77.6–78.0

(77.8)

Cathepsin C

7.8–9.2

(8.5)

24.7–25.9

(25.2)*

7.6–8.8

(8.2)

11.5–14.7

(13.1)

Cathepsin D

23.9–32.1

(28.0)

100.0–103.4

(101.7)*

36.3–37.5

(36.9)

97.7–117.3

(107.7)**

Cathepsin X/Z/P

35.6–45.6

(40.6)

89.8–136.4

(113.1)*

41.4–49.6

(45.5)

45.6–82.2

(64.0)**

MMP-1

14.3–15.5

(14.9)

52.9–54.7

(53.8)*

11.8–13.8

(12.8)

42.1–43.1

(42.6)**

MMP-2

138.1–173.3

(155.7)

233.6–242.2

(237.9)*

268.0–291.0

(279.5)

231.4–249.8

(240.6)**

MMP-3

61.2–78.4

(69.8)

132.6–153.8

(143.2)*

54.6–80.2

(67.4)

69.3–93.7

(81.5)

MMP-10

4.1–7.1

(5.6)

145.9–175.3

(160.6)*

3.6–5.6

(4.6)

154.6–176.6

(165.6)**

Urokinase

12.4–14.2

(13.3)

78.4–92.6

(85.5)*

8.5–9.5

(9.0)

61.5–76.5

(69.0)**

Данные представлены как минимальное – максимальное значение и медиана (в скобках), n = 3. * – р < 0.05 по сравнению с монокультурой МСК 5% O2; ** – р < 0.05 по сравнению с монокультурой МСК 0.1% O2, 24 ч.

 

Таблица 6. Влияние сокультивирования c ФНО-α активированными ЭК на продукцию белков-регуляторов протеаз в МСК

Название белка-регулятора

5% O2 МСК

5% O2 МСК + ЭК

0.1% O2 МСК

0.1% O2 МСК + ЭК

APP/Protease Nexin II

97.4–101.0

(99.2)

131.3–251.4

(191.3)*

93.8–101.8

(97.8)

174.4–185.7

(180.1)**

Cystatin B

40.4–55.8

(48.0)

144.4–150.9

(147.6)*

41.8–46.5

(44.1)

157.5–179.3

(168.0)**

EMMPRIN/CD147

47.7–67.9

(57.8)

121.5–132.3

(126.9)*

45.1–46.7

(45.9)

137.6–174.4

(156.1)**

Serpin B6

59.3–65.1

(62.2)

114.9–143.7

(129.3)*

34.7–42.1

(38.4)

112.1–129.5

(120.8)**

Serpin B8

90.9–102.1

(96.5)

92.6–103.2

(98.0)

43.2–58.4

(50.8)

186.8–202.2

(194.5)**

Serpin E1/PAI-1

104.1–108.5

(106.3)

158.7–179.3

(169.0)*

125.9–183.5

(154.8)

114.8–138.2

(126.5)

Testican 1/SPOCK1

130.9–136.9

(133.9)

254.1–256.1

(255.1)*

138.2–144.6

(141.4)

244.8–245.8

(245.3)**

TFPI

31.3–31.7

(31.5)

107.1–110.7

(108.9)*

26.6–31.2

(28.9)

114.3–115.1

(114.8)**

TFPI-2

54.5–62.1

(58.3)

282.2–356.2

(319.2)*

40.6–40.8

(40.7)

352.2–366.4

(359.3)**

TIMP-1

194.3–226.7

(210.5)

94.5–122.5

(108.1)*

134.6–143.8

(139.2)

117.5–121.1

(119.3)

TIMP-2

193.5–211.9

(202.7)

205.8–214.2

(210.0)

259.0–272.6

(265.8)

134.9–149.1

(142.1)**

Данные представлены как минимальное – максимальное значение и медиана (в скобках), n = 3. * – р < 0.05 по сравнению с монокультурой МСК 5% O2; ** – р < 0.05 по сравнению с монокультурой МСК 0.1% O2, 24 ч.

 

Наши данные показали, что сокультивирование с активированными ЭК вызывало увеличение продукции протеаз, которые участвуют в деградации ВКМ и миграции клеток (ADAM8, Cathepsin B, Cathepsin V, MMP-2, ADAM9, ADAMTS1, Cathepsin A, Cathepsin C, Cathepsin D, Cathepsin X/Z/P, MMP-1, MMP-3, MMP-10, Urokinase), в 1.5 и более раз (табл. 5). В пользу потенциального увеличения протеолитической активности МСК также свидетельствует снижение уровня ингибитора матриксных металлопротеаз широкого спектра действия TIMP-1 в 1.9 раза и возрастание уровня индуктора активности различных металлопротеаз EMMPRIN/CD147. Наблюдалось повышение продукции и других белков с регуляторной активностью в отношении протеаз APP/Protease Nexin II, Latexin, Serpin E1/PAI-1, Testican 1/SPOCK1, Cystatin B, Serpin B6, TFPI, TFPI-2 (табл. 6). В условиях гипоксического стресса профиль продуцируемых протеаз и ингибиторов в МСК после сокультивирования с ФНО-активированными ЭК отличался от такового при «физиологической» гипоксии. Наблюдалась отмена увеличения продукции некоторых протеаз (ADAM8, Cathepsin B, Cathepsin X/Z/P, MMP-3) (табл. 5) и антипротеаз (Serpin E1/PAI-1, Serpin F1/PEDF) (табл. 6). При этом продукция Serpin B8 возрастала, а TIMP-2 снижалась в МСК. Таким образом, взаимодействие с эндотелиальными клетками стимулировало секрецию протеаз МСК, однако в условиях значительной кислородной депривации (0.1% О2) наблюдалось ослабление этого эффекта.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящей работе проведена оценка функциональных свойств МСК после краткосрочного сокультивирования с активированными ЭК при физиологической гипоксии (5%) и гипоксическом стрессе О2 (0.1%).

Мы обнаружили, что сами по себе МСК и ЭК демонстрируют устойчивость к действию краткосрочной депривации О2. При контактном взаимодействии активированные ЭК не влияли на стромальный фенотип и мультилинейный дифференцировочный потенциал МСК, при этом происходило изменение экспрессии молекул межклеточной адгезии, продукции растворимых медиаторов и протеаз в МСК. Модулирующее действие краткосрочного гипоксического стресса выражалось преимущественно в изменении экспрессии генов IL6, IL8 по сравнению с условиями физиологической гипоксии (5% О2).

Предварительный этап включал оценку возможных неблагоприятных эффектов гипоксического стресса (0.1% О2, 24 ч) на МСК и ЭК, а также провоспалительной активации ФНО-α на ЭК. МСК демонстрировали высокую устойчивость к депривации О2. Предполагается, что изменения, которые помогают клеткам адаптироваться к гипоксическому стрессу, вызваны работой антиоксидантных систем, возрастанием активности транскрипционного фактора HIF и транзиторным увеличением экспрессии HIF1A, HIF3A [8, 14, 15, 36–38].

Анализ эффектов ФНО-α и кислородной депривации разной степени выраженности на ЭК показал, что краткосрочное воздействие физиологической гипоксии (5% О2) и активация ФНО-α в этих условиях существенно не влияли на исследуемые параметры ЭК по сравнению с культивированием клеток при стандартных условиях (20% О2). ЭК демонстрировали морфологические и иммунофенотипические признаки активации при действии ФНО-α, что сопоставимо с полученными ранее экспериментальными данными [39, 40]. На фоне краткосрочной кислородной депривации (0.1% О2, 24 ч) наблюдались признаки окислительного стресса (↑H2O2), а совместно с действием ФНО-α выраженность этих признаков усиливалась (↑H2O2 ↑NO). Увеличение продукции эндогенных АФК может быть связано с ингибирующим действием NO на фермент каталазу, функция которого заключается в деактивации H2O2 [41, 42]. Возможно, устойчивость ЭК к действию краткосрочного гипоксического стресса и ФНО-α обусловлена активацией сигнального пути NFkB и возрастанием активности HIF, что помогает клеткам адаптироваться к стрессовым факторам среды [43].

Анализ эффектов межклеточного взаимодействия при пониженном содержании О2 показал, что после краткосрочного контакта с активированными ЭК МСК не отличались от монокультуры клеток по клоногенной активности, экспрессии стромальных маркеров, также отсутствовали признаки коммитирования, судя по экспрессии генов-регуляторов дифференцировки, что может свидетельствовать в пользу сохранения статуса малокоммитированных предшественников. Ранее было показано, что МСК сохраняют мультилинейный потенциал несмотря на длительное взаимодействие с ЭК [28], что согласуется с нашими данными.

В настоящей работе оценивались эффекты ЭК на экспрессию поверхностных молекул МСК, которые участвуют в регуляции межклеточной адгезии, миграции, пролиферации и дифференцировке клеток [44, 45]. Взаимодействие вызывало снижение экспрессии белка гомотипических межклеточных контактов (N-кадгерина) и интегрина α4 в МСК. При этом увеличивалось количество клеток, экспрессирующих молекулы, которые участвуют в миграции и формировании гетероклеточных контактов МСК-ЭК, МСК-иммунные клетки (интегрин α1 и αVβ3, ICAM-1) [46, 47]. Гипоксический стресс способствовал усилению индукции ICAM-1 в МСК после взаимодействия с активированными ЭК. Как показано для некоторых клеточных линий, в гипоксических условиях (1% О2, 24 ч) происходит протеасомная деградация белка IkB, который является цитоплазматическим ингибитором NFkB. Известно, что активация сигнального пути NFkB индуцирует экспрессию ICAM-1, что может объяснять наблюдаемые изменения [48].

Терапевтическое применение МСК напрямую связано с их способностью мигрировать в поврежденные органы по градиенту цитокинов с хемотактическим действием [21, 24]. В настоящем исследовании мы оценили изменение потенциала к направленной и ненаправленной миграции МСК в кондиционированной среде от активированных ЭК. Наблюдаемое нами увеличение подвижности МСК в модели направленной и ненаправленной миграции свидетельствует о мобилизации МСК в ответ на факторы, продуцируемые активированными ЭК.

МСК оказывают трофическое действие на ткань за счет продукции различных цитокинов и факторов роста. Опубликованные ранее экспериментальные данные демонстрируют, что при взаимодействии стромальных и эндотелиальных клеток изменялась транскрипция генов некоторых паракринных медиаторов МСК, однако данные о влиянии ЭК на секреторный профиль МСК практически не представлены [49, 50]. В настоящем исследовании представлены новые данные о том, что сокультивирование МСК и активированных ЭК индуцирует не только транскрипцию, но и продукцию цитокинов ИЛ-6, ИЛ-8. Известно, что VEGF путем связывания с рецептором VEGFR2 усиливает транскрипцию генов IL6 и IL8 в ЭК с помощью протеинкиназы D1 [51]. Можно предположить, что VEGF-опосредованные сигнальные пути способствовали усилению экспрессии генов IL6 и IL8 в совместно культивируемых МСК и ЭК, поддерживая повышенную продукцию этих интерлейкинов.

Протеазы участвуют во многих физиологических процессах, таких как репарация ткани, ангиогенез, иммунный ответ, свертывание крови [52–54]. Баланс секретируемых протеаз и их ингибиторов непосредственно контролирует высвобождение связанных форм цитокинов и факторов роста, способствует образованию «путей» для миграции клеток, опосредует иммунный ответ, что влияет на заживление ран и формирование новых сосудов (тканевой гомеостаз/репаративные процессы в ткани) [55–57].

Анализ белкового профиля сокультивируемых МСК показал возрастание протеолитической активности МСК за счет продукции белков, которые индуцируют локально опосредованную деградацию компонентов ВКМ и миграцию МСК, таких как матриксные металлопротеазы (MMP-1, -2, -3, -10), катепсины, урокиназа. Формирование миграционного фенотипа МСК связано с работой матриксных металлопротеаз, и ЭК являются индукторами активности этих ферментов [58, 59]. Продемонстрировано, что кондиционированная среда от ЭК повышает уровни ММР-1, ММР-3 и скорость миграции МСК [33]. Также известно, что ММР-2 положительно влияет на трансэндотелиальную миграцию МСК. В то же время уменьшение трансэндотелиальной миграции МСК связано с ингибированием ММР-2 и возрастанием экспрессии TIMP-3 [60]. Ries и соавт. показали, что подавление MMP-2 или TIMP-2 снижает клеточную подвижность, в то время как подавление экспрессии TIMP-1, наоборот, активизирует клеточную подвижность [61]. Катепсины участвуют в неспецифической деградации ВКМ и процессинге цитокинов, хемокинов и клеточных рецепторов. Показано, что катепсины А, В, D стимулируют миграцию различных типов клеток, в том числе МСК [62–65].

Избыточная продукция клетками протеолитических ферментов, которые деградируют ВКМ, может неблагоприятно отражаться на восстановлении поврежденного органа. Однако регуляция процесса деградации ВКМ осуществляется за счет белков-регуляторов, которые ингибируют или стимулируют действие различных протеаз.

Тканевые ингибиторы матриксных металлопротеаз (TIMP) являются регуляторами функциональной активности соответствующих ферментов. В организме TIMPs контролируют ремоделирование матрикса при регенерации различных тканей [59, 66]. Наблюдаемое нами снижение продукции ингибитора металлопротеаз широкого спектра действия TIMP-1 и возрастание продукции Emmprin (индуктор внеклеточной матриксной металлопротеазы), индуцирующего активность металлопротеаз, наряду с возрастанием продукции MMP-1, -2, -3, -10 может свидетельствовать в пользу увеличения протеолитической активности МСК. Вместе с этим наблюдалась индукция экспрессии белков, которые оказывают ингибирующее действие на подвижность МСК, таких как PAI-1, nexin-1, cystatin B, TFPI, после взаимодействия с активированными ЭК [67–69].

В настоящем исследовании мы также проанализировали влияние значительной депривации О2, характерной для ишемического повреждения ткани, на взаимодействие ЭК и МСК.

В условиях гипоксического стресса многие эффекты эндотелия на МСК были подобны таковым при «физиологической» гипоксии (рис. 9). Среди отличий можно отметить увеличение экспрессии интегрина α5 как в моно-, так и в сокультуре, значительное увеличение экспрессии ICAM-1 на МСК после взаимодействия с активированными ЭК, что может указывать на потенцирующее действие кислородной депривации на экспрессию некоторых молекул межклеточного взаимодействия. Ранее показано, что краткосрочная кислородная депривация (1–2% О2, 24 ч) приводит к возрастанию экспрессии интегрина α5 на поверхности МСК из костного мозга [70, 71], что согласуется с нашими результатами. Увеличение экспрессии ICAM-1 наблюдается при поляризации МСК в провоспалительный фенотип, что связано с активацией TLR4 или действием воспалительных цитокинов (ФНО-α, ИФНγ, ИЛ-1β) [72]. ЭК могут синтезировать ИЛ-1α, который обладает ИЛ-1β-подобным действием (относится к провоспалительным цитокинам), а при гипоксии его секреция увеличивается [73], что может обусловливать потенцирующее влияние гипоксического стресса на экспрессию ICAM-1 в МСК при взаимодействии с ЭК.

 

Рис. 9. Эффекты гипоксического стресса на взаимодействие активированных ЭК и МСК.

 

При гипоксическом стрессе, как и при «физиологической» гипоксии, концентрации ИЛ-6 и ИЛ-8 в среде после сокультивирования МСК и активированных ЭК значительно возрастали. Кроме того, мы наблюдали, что сокультивирование клеток в условиях гипоксического стресса индуцировало экспрессию гена IL8 и ослабляло усиление экспрессии IL6 в МСК и ЭК по сравнению с «физиологической» гипоксией. Также гипоксический стресс отменял увеличение продукции протеаз, стимулирующих клеточную миграцию, таких как катепсины, MMP-3, TIMP-2, что может непосредственно влиять на подвижность МСК.

Таким образом, мы наблюдали изменение экспрессии поверхностных молекул, ответственных за миграцию МСК и образование гомо- и гетероклеточных контактов, а также возрастание скорости миграции МСК, что свидетельствует об увеличении подвижности клеток. Более высокий уровень транскрипции и трансляции провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ИЛ-8 и активация продукции протеолитических белков может свидетельствовать в пользу усиления межклеточной коммуникации и ремоделирования внеклеточного матрикса. При этом краткосрочная депривация О2 (0.1% О2, 24 ч) частично отменяла индукцию экспрессии IL6 и некоторых протеаз и ингибиторов протеаз при взаимодействии МСК и ЭК.

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Идея работы и планирование экспериментов (Е. Р. А., О. В. Ж.), проведение экспериментов, сбор и обработка данных (О. В. Ж.), написание и редактирование манускрипта (Е. Р. А., О. В. Ж., Л. Б. Б.).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств бюджета Программы фундаментальных исследований Института медико-биологических проблем РАН (тема 65.3 и FMFR-2024-0032). Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эксперименты были одобрены Комиссией по биомедицинской этике Института медико-биологических проблем РАН, протокол № 550МСК от 22 июля 2020 г.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

×

Авторлар туралы

O. Zhidkova

Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: flain-fish@yandex.ru
Ресей, Moscow

E. Andreeva

Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences

Email: andreeva1564@gmail.com
Ресей, Moscow

L. Buravkova

Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences

Email: buravkova@imbp.ru
Ресей, Moscow

Әдебиет тізімі

  1. Caplan AI, Correa D (2011) The MSC: An Injury Drugstore. Cell Stem Cell 9: 11–15. https://doi.org/10.1016/j.stem.2011.06.008
  2. Squillaro T, Peluso G, Galderisi U (2016) Clinical Trials with Mesenchymal Stem Cells: An Update. Cell Transplant 25: 829–848. https://doi.org/10.3727/096368915X689622
  3. Galipeau J, Sensébé L (2018) Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell 22: 824–833. https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.05.004
  4. Fernández-Garza LE, Barrera-Barrera SA, Barrera-Saldaña HA (2023) Mesenchymal Stem Cell Therapies Approved by Regulatory Agencies around the World. Pharmaceuticals 16: 1334. https://doi.org/10.3390/ph16091334
  5. Buravkova LB, Andreeva ER, Gogvadze V, Zhivotovsky B (2014) Mesenchymal stem cells and hypoxia: Where are we? Mitochondrion 19: 105–112. https://doi.org/10.1016/j.mito.2014.07.005
  6. Egger D, Lavrentieva A, Kugelmeier P, Kasper C (2022) Physiologic isolation and expansion of human mesenchymal stem/stromal cells for manufacturing of cell-based therapy products. Eng Life Sci 22: 361–372. https://doi.org/10.1002/elsc.202100097
  7. Choi J-W, Shin S, Lee CY, Lee J, Seo H-H, Lim S, Lee S, Kim I-K, Lee H-B, Kim SW, Hwang K-C (2017) Rapid Induction of Osteogenic Markers in Mesenchymal Stem Cells by Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells. Cell Physiol Biochem 44: 53–65. https://doi.org/10.1159/000484582
  8. Lavrentieva A, Majore I, Kasper C, Hass R (2010) Effects of hypoxic culture conditions on umbilical cord-derived human mesenchymal stem cells. Cell Commun Signal CCS 8: 18. https://doi.org/10.1186/1478-811X-8-18
  9. Moniz I, Ramalho-Santos J, Branco AF (2022) Differential Oxygen Exposure Modulates Mesenchymal Stem Cell Metabolism and Proliferation through mTOR Signaling. Int J Mol Sci 23: 3749. https://doi.org/10.3390/ijms23073749
  10. Rosová I, Dao M, Capoccia B, Link D, Nolta JA (2008) Hypoxic Preconditioning Results in Increased Motility and Improved Therapeutic Potential of Human Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells 26: 2173–2182. https://doi.org/10.1634/stemcells.2007-1104
  11. Udartseva OO, Lobanova MV, Andreeva ER, Buravkov SV, Ogneva IV, Buravkova LB (2016) Acute Hypoxic Stress Affects Migration Machinery of Tissue O2-Adapted Adipose Stromal Cells. Stem Cells Int 2016: 1–16. https://doi.org/10.1155/2016/7260562
  12. Busletta C, Novo E, Valfrè Di Bonzo L, Povero D, Paternostro C, Ievolella M, Mareschi K, Ferrero I, Cannito S, Compagnone A, Bandino A, Colombatto S, Fagioli F, Parola M (2011) Dissection of the Biphasic Nature of Hypoxia-Induced Motogenic Action in Bone Marrow-Derived Human Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells 29: 952–963. https://doi.org/10.1002/stem.642
  13. Wang Q, Li X, Wang Q, Xie J, Xie C, Fu X (2019) Heat shock pretreatment improves mesenchymal stem cell viability by heat shock proteins and autophagy to prevent cisplatin-induced granulosa cell apoptosis. Stem Cell Res Ther 10: 348. https://doi.org/10.1186/s13287-019-1425-4
  14. Peterson KM, Aly A, Lerman A, Lerman LO, Rodriguez-Porcel M (2011) Improved survival of mesenchymal stromal cell after hypoxia preconditioning: role of oxidative stress. Life Sci 88: 65–73. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2010.10.023
  15. Andreeva ER, Lobanova MV, Udartseva OO, Buravkova LB (2014) Response of Adipose Tissue-Derived Stromal Cells in Tissue-Related O2 Microenvironment to Short-Term Hypoxic Stress. Cells Tissues Organs 200: 307–315. https://doi.org/10.1159/000438921
  16. Caplan AI (2007) Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol 213: 341–347. https://doi.org/10.1002/jcp.21200
  17. Wei X, Yang X, Han Z, Qu F, Shao L, Shi Y (2013) Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy. Acta Pharmacol Sin 34: 747–754. https://doi.org/10.1038/aps.2013.50
  18. Lu L, Xu A, Gao F, Tian C, Wang H, Zhang J, Xie Y, Liu P, Liu S, Yang C, Ye Z, Wu X (2022) Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes as a Novel Strategy for the Treatment of Intervertebral Disc Degeneration. Front Cell Dev Biol 9: 770510. https://doi.org/10.3389/fcell.2021.770510
  19. Sanchez-Diaz M, Quiñones-Vico MI, Sanabria De La Torre R, Montero-Vílchez T, Sierra-Sánchez A, Molina-Leyva A, Arias-Santiago S (2021) Biodistribution of Mesenchymal Stromal Cells after Administration in Animal Models and Humans: A Systematic Review. J Clin Med 10: 2925. https://doi.org/10.3390/jcm10132925
  20. Becker AD, Riet IV (2016) Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy? World J Stem Cells 8: 73. https://doi.org/10.4252/wjsc.v8.i3.73
  21. Szydlak R (2021) Biological, chemical and mechanical factors regulating migration and homing of mesenchymal stem cells. World J Stem Cells 13: 619–631. https://doi.org/10.4252/wjsc.v13.i6.619
  22. Leibacher J, Dauber K, Ehser S, Brixner V, Kollar K, Vogel A, Spohn G, Schäfer R, Seifried E, Henschler R (2017) Human mesenchymal stromal cells undergo apoptosis and fragmentation after intravenous application in immune-competent mice. Cytotherapy 19: 61–74. https://doi.org/10.1016/j.jcyt.2016.09.010
  23. Zachar L, Bačenková D, Rosocha J (2016) Activation, homing, and role of the mesenchymal stem cells in the inflammatory environment. J Inflamm Res 9: 231–240. https://doi.org/10.2147/JIR.S121994
  24. Nitzsche F, Müller C, Lukomska B, Jolkkonen J, Deten A, Boltze J (2017) Concise Review: MSC Adhesion Cascade—Insights into Homing and Transendothelial Migration. Stem Cells 35: 1446–1460. https://doi.org/10.1002/stem.2614
  25. Teo GSL, Ankrum JA, Martinelli R, Boetto SE, Simms K, Sciuto TE, Dvorak AM, Karp JM, Carman CV (2012) Mesenchymal Stem Cells Transmigrate Between and Directly Through Tumor Necrosis Factor-α-Activated Endothelial Cells Via Both Leukocyte-Like and Novel Mechanisms. Stem Cells 30: 2472–2486. https://doi.org/10.1002/stem.1198
  26. Guo Y-C, Chiu Y-H, Chen C-P, Wang H-S (2018) Interleukin-1β induces CXCR3-mediated chemotaxis to promote umbilical cord mesenchymal stem cell transendothelial migration. Stem Cell Res Ther 9: 281. https://doi.org/10.1186/s13287-018-1032-9
  27. Merfeld-Clauss S, Lupov IP, Lu H, Feng D, Compton-Craig P, March KL, Traktuev DO (2014) Adipose Stromal Cells Differentiate Along a Smooth Muscle Lineage Pathway Upon Endothelial Cell Contact via Induction of Activin A. Circ Res 115: 800–809. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.115.304026
  28. Lin C-H, Lilly B (2014) Endothelial Cells Direct Mesenchymal Stem Cells Toward a Smooth Muscle Cell Fate. Stem Cells Dev 23: 2581–2590. https://doi.org/10.1089/scd.2014.0163
  29. Li C, Wu X, Tong J, Yang X, Zhao J, Zheng Q, Zhao G, Ma Z (2015) Comparative analysis of human mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue under xeno-free conditions for cell therapy. Stem Cell Res Ther 6: 55. https://doi.org/10.1186/s13287-015-0066-5
  30. Buravkova LB, Grinakovskaya OS, Andreeva ER, Zhambalova AP, Kozionova MP (2009) Characteristics of human lipoaspirate-isolated mesenchymal stromal cells cultivated under lower oxygen tension. Cell Tissue Biol 3: 23–28. https://doi.org/10.1134/S1990519X09010039
  31. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini FC, Krause DS, Deans RJ, Keating A, Prockop DJ, Horwitz EM (2006) Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 8: 315–317. https://doi.org/10.1080/14653240600855905
  32. Tondreau T, Meuleman N, Stamatopoulos B, De Bruyn C, Delforge A, Dejeneffe M, Martiat P, Bron D, Lagneaux L (2009) In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues. Cytotherapy 11: 559–569. https://doi.org/10.1080/14653240903051541
  33. Lozito TP, Jackson WM, Nesti LJ, Tuan RS (2014) Human mesenchymal stem cells generate a distinct pericellular zone of MMP activities via binding of MMPs and secretion of high levels of TIMPs. Matrix Biol 34: 132–143. https://doi.org/10.1016/j.matbio.2013.10.003
  34. Beloglazova IB, Zubkova ES, Tsokolaeva ZI, Stafeev YuS, Dergilev KV, Ratner EI, Shestakova MV, Sukhareva OYu, Parfenova EV, Menshikov MYu (2016) Regulatory Effects of Urokinase on Mesenchymal Stromal Cell Migration, Proliferation, and Matrix Metalloproteinase Secretion. Bull Exp Biol Med 161: 775–778. https://doi.org/10.1007/s10517-016-3507-y
  35. Wei L, Xu Y, Zhang L, Yang L, Zhao RC, Zhao D (2023) Mesenchymal Stem Cells Promote Wound Healing and Effects on Expression of Matrix Metalloproteinases-8 and 9 in the Wound Tissue of Diabetic Rats. Stem Cells Dev 32: 25–31. https://doi.org/10.1089/scd.2021.0218
  36. Lee JA, Kim BI, Jo CH, Choi CW, Kim E-K, Kim H-S, Yoon K-S, Choi J-H (2010) Mesenchymal stem-cell transplantation for hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rat model. Pediatr Res 67: 42–46. https://doi.org/10.1203/PDR.0b013e3181bf594b
  37. Pogodina MV, Buravkova LB (2014) Expression of hypoxia-associated genes in multipotent mesenchymal stromal cells during long-term cultivation at low oxygen. Dokl Biol Sci 458: 310–312. https://doi.org/10.1134/S0012496614050056
  38. Pulido-Escribano V, Torrecillas-Baena B, Camacho-Cardenosa M, Dorado G, Gálvez-Moreno MÁ, Casado-Díaz A (2022) Role of hypoxia preconditioning in therapeutic potential of mesenchymal stem-cell-derived extracellular vesicles. World J Stem Cells 14: 453–472. https://doi.org/10.4252/wjsc.v14.i7.453
  39. Fontani F, Domazetovic V, Marcucci T, Vincenzini MT, Iantomasi T (2016) Tumor Necrosis Factor-Alpha Up-Regulates ICAM-1 Expression and Release in Intestinal Myofibroblasts by Redox-Dependent and -Independent Mechanisms: ICAM-1 Expression and Release in 18C o Cells. J Cell Biochem 117: 370–381. https://doi.org/10.1002/jcb.25279
  40. Li M, Van Esch BCAM, Wagenaar GTM, Garssen J, Folkerts G, Henricks PAJ (2018) Pro- and anti-inflammatory effects of short chain fatty acids on immune and endothelial cells. Eur J Pharmacol 831: 52–59. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2018.05.003
  41. Sigfrid LA, Cunningham JM, Beeharry N, Lortz S, Tiedge M, Lenzen S, Carlsson C, Green IC (2003) Cytokines and nitric oxide inhibit the enzyme activity of catalase but not its protein or mRNA expression in insulin-producing cells. J Mol Endocrinol 31: 509–518. https://doi.org/10.1677/jme.0.0310509
  42. Bauer G (2015) Increasing the endogenous NO level causes catalase inactivation and reactivation of intercellular apoptosis signaling specifically in tumor cells. Redox Biol 6: 353–371. https://doi.org/10.1016/j.redox.2015.07.017
  43. Mussbacher M, Salzmann M, Brostjan C, Hoesel B, Schoergenhofer C, Datler H, Hohensinner P, Basílio J, Petzelbauer P, Assinger A, Schmid JA (2019) Cell Type-Specific Roles of NF-κB Linking Inflammation and Thrombosis. Front Immunol 10: 85. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00085
  44. Frith JE, Mills RJ, Hudson JE, Cooper-White JJ (2012) Tailored Integrin–Extracellular Matrix Interactions to Direct Human Mesenchymal Stem Cell Differentiation. Stem Cells Dev 21: 2442–2456. https://doi.org/10.1089/scd.2011.0615
  45. Steward AJ, Kelly DJ (2015) Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation. J Anat 227: 717–731. https://doi.org/10.1111/joa.12243
  46. Huttenlocher A, Horwitz AR (2011) Integrins in Cell Migration. Cold Spring Harb Perspect Biol 3: a005074–a005074. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a005074
  47. Becerra-Bayona SM, Guiza-Arguello VR, Russell B, Höök M, Hahn MS (2018) Influence of collagen-based integrin α1 and α2 mediated signaling on human mesenchymal stem cell osteogenesis in three dimensional contexts. J Biomed Mater Res A 106: 2594–2604. https://doi.org/10.1002/jbm.a.36451
  48. Winning S, Splettstoesser F, Fandrey J, Frede S (2010) Acute Hypoxia Induces HIF-Independent Monocyte Adhesion to Endothelial Cells through Increased Intercellular Adhesion Molecule-1 Expression: The Role of Hypoxic Inhibition of Prolyl Hydroxylase Activity for the Induction of NF-κB. J Immunol 185: 1786–1793. https://doi.org/10.4049/jimmunol.0903244
  49. Thin Luu N, Mcgettrick HM, Buckley CD, Newsome PN, Ed Rainger G, Frampton J, Nash GB (2013) Crosstalk Between Mesenchymal Stem Cells and Endothelial Cells Leads to Downregulation of Cytokine-Induced Leukocyte Recruitment. Stem Cells 31: 2690–2702. https://doi.org/10.1002/stem.1511
  50. Bartaula-Brevik S (2017) Secretome of Mesenchymal Stem Cells Grown in Hypoxia Accelerates Wound Healing and Vessel Formation In Vitro. Int J Stem Cell Res Ther 4. https://doi.org/10.23937/2469-570X/1410045
  51. Hao Q, Wang L, Tang H (2009) Vascular endothelial growth factor induces protein kinase D-dependent production of proinflammatory cytokines in endothelial cells. Am J Physiol-Cell Physiol 296: C821–C827. https://doi.org/10.1152/ajpcell.00504.2008
  52. Guillamat-Prats R (2022) Role of Mesenchymal Stem/Stromal Cells in Coagulation. Int J Mol Sci 23: 10393. https://doi.org/10.3390/ijms231810393
  53. Lund LR, Green KA, Stoop AA, Ploug M, Almholt K, Lilla J, Nielsen BS, Christensen IJ, Craik CS, Werb Z, Danø K, Rømer J (2006) Plasminogen activation independent of uPA and tPA maintains wound healing in gene-deficient mice. EMBO J 25: 2686–2697. https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7601173
  54. Rundhaug JE (2005) Matrix metalloproteinases and angiogenesis. J Cell Mol Med 9: 267–285. https://doi.org/10.1111/j.1582-4934.2005.tb00355.x
  55. McCarty SM, Percival SL (2013) Proteases and Delayed Wound Healing. Adv Wound Care 2: 438–447. https://doi.org/10.1089/wound.2012.0370
  56. Shalini S, Dorstyn L, Dawar S, Kumar S (2015) Old, new and emerging functions of caspases. Cell Death Differ 22: 526–539. https://doi.org/10.1038/cdd.2014.216
  57. Habič A, Novak M, Majc B, Lah Turnšek T, Breznik B (2021) Proteases Regulate Cancer Stem Cell Properties and Remodel Their Microenvironment. J Histochem Cytochem 69: 775–794. https://doi.org/10.1369/00221554211035192
  58. Brauer PR (2006) MMPs-Role in Cardiovascular Development and Disease. Front Biosci 11: 447. https://doi.org/10.2741/1810
  59. Kasper G, Glaeser JD, Geissler S, Ode A, Tuischer J, Matziolis G, Perka C, Duda GN (2007) Matrix Metalloprotease Activity Is an Essential Link Between Mechanical Stimulus and Mesenchymal Stem Cell Behavior. Stem Cells 25: 1985–1994. https://doi.org/10.1634/stemcells.2006-0676
  60. De Becker A, Van Hummelen P, Bakkus M, Vande Broek I, De Wever J, De Waele M, Van Riet I (2007) Migration of culture-expanded human mesenchymal stem cells through bone marrow endothelium is regulated by matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-3. Haematologica 92: 440–449. https://doi.org/10.3324/haematol.10475
  61. Ries C, Egea V, Karow M, Kolb H, Jochum M, Neth P (2007) MMP-2, MT1-MMP, and TIMP-2 are essential for the invasive capacity of human mesenchymal stem cells: differential regulation by inflammatory cytokines. Blood 109: 4055–4063. https://doi.org/10.1182/blood-2006-10-051060
  62. Tong B, Wan B, Wei Z, Wang T, Zhao P, Dou Y, Lv Z, Xia Y, Dai Y (2014) Role of cathepsin B in regulating migration and invasion of fibroblast-like synoviocytes into inflamed tissue from patients with rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol 177: 586–597. https://doi.org/10.1111/cei.12357
  63. Vangala G, Imhoff FM, Squires CML, Cridge AG, Baird SK (2019) Mesenchymal stem cell homing towards cancer cells is increased by enzyme activity of cathepsin D. Exp Cell Res 383: 111494. https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2019.07.007
  64. Vidak E, Javoršek U, Vizovišek M, Turk B (2019) Cysteine Cathepsins and their Extracellular Roles: Shaping the Microenvironment. Cells 8: 264. https://doi.org/10.3390/cells8030264
  65. Park S, Huang H, Kwon W, Kim H, Park J, Han JE, Cho G, Han S, Sung Y, Ryoo ZY, Kim MO, Choi S (2021) Cathepsin A regulates pluripotency, proliferation and differentiation in mouse embryonic stem cells. Cell Biochem Funct 39: 67–76. https://doi.org/10.1002/cbf.3554
  66. Mott JD, Werb Z (2004) Regulation of matrix biology by matrix metalloproteinases. Curr Opin Cell Biol 16: 558–564. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2004.07.010
  67. Stefansson S, Lawrence DA (1996) The serpin PAI-1 inhibits cell migration by blocking integrin αvβ3 binding to vitronectin. Nature 383: 441–443. https://doi.org/10.1038/383441a0
  68. Richard B, Pichon S, Arocas V, Venisse L, Berrou E, Bryckaert M, Jandrot Perrus M, Bouton MC (2006) The serpin protease nexin-1 regulates vascular smooth muscle cell adhesion, spreading, migration and response to thrombin. J Thromb Haemost 4: 322–328. https://doi.org/10.1111/j.1538-7836.2006.01710.x
  69. Provençal M, Michaud M, Beaulieu É, Ratel D, Rivard G-É, Gingras D, Béliveau R (2008) Tissue factor pathway inhibitor (TFPI) interferes with endothelial cell migration by inhibition of both the Erk pathway and focal adhesion proteins. Thromb Haemost 99: 576–585. https://doi.org/10.1160/TH07-10-0623
  70. Saller MM, Prall WC, Docheva D, Schönitzer V, Popov T, Anz D, Clausen-Schaumann H, Mutschler W, Volkmer E, Schieker M, Polzer H (2012) Increased stemness and migration of human mesenchymal stem cells in hypoxia is associated with altered integrin expression. Biochem Biophys Res Commun 423: 379–385. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2012.05.134
  71. Choi JH, Lee YB, Jung J, Hwang SG, Oh I-H, Kim GJ (2016) Hypoxia Inducible Factor-1 α Regulates the Migration of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells via Integrin α4. Stem Cells Int 2016: 1–11. https://doi.org/10.1155/2016/7932185
  72. Ren G, Roberts AI, Shi Y (2011) Adhesion molecules: Key players in mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression. Cell Adhes Migr 5: 20–22. https://doi.org/10.4161/cam.5.1.13491
  73. Mai J, Virtue A, Shen J, Wang H, Yang X-F (2013) An evolving new paradigm: endothelial cells – conditional innate immune cells. J Hematol Oncol 6: 61. https://doi.org/10.1186/1756-8722-6-61

Қосымша файлдар

Қосымша файлдар
Әрекет
1. JATS XML
Жүктеу
2. Fig. 1. Experimental scheme for evaluating the effects of interaction between mesenchymal stromal and endothelial cells.

Жүктеу (200KB)
Метадеректер
3. Fig. 2. Characteristics of cultured MSCs with different O2 content. (a) – representative micrography of cultured MSCs at 5% O2, scale segment of 100 microns; (b) – characteristics of viability of MSCs using fluorescent dyes annexin/propidium iodide (Ann/PI); representative histograms are presented (lower left quadrant – population living cells, upper left quadrant – cells in a state of early apoptosis, upper right quadrant – cells in a state of late apoptosis, lower right quadrant – cells in a state of necrosis); (c) – production of ROS; (d) – expression of differentiation regulatory genes in MSCs, the multiplicity of changes in gene expression compared to the monoculture of MSCs at 5% O2 is presented; (e) – production of IL-6, IL-8 in MSCs. The graphs show the median, interquartile range, maximum and minimum values, n ≥ 4, * – p < 0.05 compared with the monoculture of MSC cultivated at 5% O2.

Жүктеу (263KB)
Метадеректер
4. Fig. 3. Effect of TNF-α activation and O2 deprivation on EC at different O2 levels. (a) – intact and TNF-α activated EC after short–term cultivation at 5% O2, light microscopy, representative micrographs of EC at 5% O2, scale segment of 100 microns; (b) - viability of EC Representative histograms are presented (the lower left quadrant is a population of living cells, the upper left quadrant is cells in a state of early apoptosis, the upper right quadrant is cells in a state of late apoptosis, the lower right quadrant is cells in a state of necrosis); (c) – expression of adhesion molecules on EC at different O2 levels, representative histograms at 5% O2. ECs – intact EC, ECs TNF-α – activated EC, control cells stained with isotypic IgG1 antibodies.

Жүктеу (381KB)
Метадеректер
5. Fig. 4. Morphology and transcription profile of MSCs after interaction with EC activated TNF-α. (a) – type of co-culture after 24 hours at 5 and 0.1% O2. Representative images obtained by combining microphotographs taken in phase contrast and fluorescence mode are presented, endothelial cells are stained with fluorescent dye PKH27. The scale segment is 100 microns. The arrows indicate MSC; (b), (c) – expression of MSC differentiation genes after interaction with EC activated at a reduced O2 content. The graphs show the multiplicity of changes in gene expression in MSCs after co-cultivation compared with the monoculture of MSCs (dotted line) under the same conditions. The data are presented as median, interquartile range, maximum and minimum values, n ≥ 3. * – p < 0.05 compared with the monoculture of MSC cultivated at 5% O2. MSC+EC TNF-α –MSC after 24 hours of co-cultivation with activated TNF-α EC.

Жүктеу (356KB)
Метадеректер
6. Fig. 5. Expression of MSCs intercellular interaction molecules after co-cultivation with TNF-α activated EC. The graphs show the proportion of positively colored MSCs before and after interaction with activated EC (median, minimum and maximum values). In the same graphs, the size of the bubbles corresponds to the value of the median fluorescence intensity of the stained cells, n ≥ 3. * – p < 0.05 compared with the monoculture of MSC under the same cultivation conditions. 1 – MSK 5% O2, 2 – MSK after co–cultivation with EC 5% O2, 3 – MSK 0.1% O2, 4 - MSK after co-cultivation with EC 0.1% O2.

Жүктеу (158KB)
Метадеректер
7. Fig. 6. Changes in the paracrine activity of EC and MSC after interaction with a reduced O2 content. (a) – concentration of IL-6 in the medium from mono- and co–cultures of MSC and activated EC; (b) - concentration of IL-8 in the medium from mono- and co-cultures of MSC and activated EC; (c) – changes in the expression of IL6 and IL8 genes in MSCs; (d) – a change in the expression of IL6 and IL8 genes in the EC. The graphs show the multiplicity of differences in the expression of genes of interest in MSCs (c) and EC (d) after interaction compared with a monoculture of cells (dotted line) under the same cultivation conditions. The data are presented as median, interquartile range, maximum and minimum values, n = 3, * – p < 0.05 compared with the MSC monoculture under the same cultivation conditions. ** – p < 0.05 compared to the EC monoculture under the same cultivation conditions. MSC+EC TNF-α – MSC after interaction with activated EC. EC TNF-α+MSC – activated ECS after interaction with MSC.

Жүктеу (221KB)
Метадеректер
8. Fig. 7. Paracrine effect of EC on the mobility of MSCs. (a) – non-directional migration of MSCs in the "wound" model in an air-conditioned environment from activated ECS. Representative micrographs immediately after the application of the "wound" (0 h) and a day later (24 h); (b) – the area of the wound closure. On the graph, the closing area is represented in % relative to the original area of the wound; (c) – directed migration of MSCs through the transwell membrane in an air-conditioned environment from activated ECS. Representative micrographs taken after 24 hours of incubation of cells in the wells of tablets; (d) – the graph shows the proportion of cells that migrated in 24 hours (the ratio of cells that migrated in the conditioned environment from EC, compared with the number of cells that migrated in the growth medium). The data are presented as median, interquartile range, maximum and minimum values, n = 3. * – p < 0.05 compared with the number of cells migrated in the growth medium (Cntrl). CM 5% O2 – conditioned environment from activated EC,

Жүктеу (225KB)
Метадеректер
9. Fig. 8. Determination of the level of proteases in MSC lysates before and after 24 hours of co-cultivation with EC activated TNF-α. (a) – representative photographs of membranes; (b), (c) – the layout and names of detecting antibodies to various proteases.

Жүктеу (203KB)
Метадеректер
10. Fig. 9. Effects of hypoxic stress on the interaction of activated EC and MSCs.

Жүктеу (199KB)
Метадеректер

© Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».