Participation of Ca²⁺-acceptor proteins in the mechanisms of the exo-endocytic cycle of synaptic vesicles in the motor nerve endings of the somatic musculature of the earthworm Lumbricus terrestris

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В основе квантовой секреции медиатора в нервных окончаниях лежит процесс экзо-эндоцитоза синаптических везикул. В стадии экзоцитоза везикулы сливаются в активных зонах с пресинаптической мембраной и освобождают нейромедиатор в синаптическую щель. После экзоцитоза следует эндоцитоз, который восстанавливает пул синаптических везикул [1]. Процессы рециклинга обеспечивают поддержание везикулярных пулов в нервных терминалях и тем самым сохраняют физиологический характер синаптической секреции медиатора [2]. Общая совокупность синаптических везикул подразделяется на пул, готовый к освобождению, резервный пул и рециклирующий пул [3]. В механизмы экзо- и эндоцитозного цикла синаптических везикул вовлечены различные синаптические белки, в том числе Са²⁺-акцепторные белки [4]. Последние играют важную роль в процессах рециклинга везикул [5]. При этом роль данных белков в кругообороте везикул в нервно-мышечных синапсах эволюционно-первичной соматической мускулатуры остается до конца неясной. Отсюда целью настоящего исследования стало изучение участия Са²⁺-акцепторных белков, а именно: кальциневрина, кальмодулина и Са²⁺/кальмодулин-зависимых протеинкиназ в механизмах экзо-эндоцитоза синаптических везикул в двигательных нервно-мышечных синапсах соматической мускулатуры дождевого червя.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для приготовления препарата дождевой червь Lumbricus terrestris разрезался сбоку по всей длине, отрезались головной и хвостовой концы, раскрывался, удалялись внутренние органы и перегородки между сегментами [6]. Далее фрагменты кожно-мускульного мешка дождевого червя длиной 10–15 сегментов закрепляли с помощью иголок на дне чашек Петри, залитых смолой Sylgard, и перфузировали физиологическим раствором Древеса – Пакса около 30 мин при комнатной температуре (22 ± 1 °C). Состав раствора (мМ): 77 NaCl, 4 KCl, 43 Na₂SO₄, 6 CaCl₂, 2 Tris, 167 сахароза, pH 7.4. Всего в экспериментах было использовано 72 препарата дождевого червя.

Фрагменты кожно-мускульного мешка дождевого червя окрашивались липофильным флуоресцентным маркером FM2–10 (Thermo Fisher Scientific, США) в концентрации 22 мкМ. «Загрузка» маркером FM2–10 двигательных нервных терминалей проводилась в течение 3 мин в модифицированном физиологическом растворе с высоким содержанием ионов K⁺ (40 мМ, гиперкалиевый раствор), после предварительной 5-минутной инкубации с красителем FM2–10 в нормальном физиологическом растворе. В гиперкалиевом растворе происходит деполяризация мембраны нервных окончаний, что приводит к увеличению частоты спонтанной секреции нейромедиатора и усилению экзо-эндоцитозного цикла синаптических везикул. Состав гиперкалиевого раствора (мМ): 41 NaCl, 40 KCl, 43 Na₂SO₄, 6 CaCl₂, 2 Tris, 167 сахароза, pH 7.4. В целях уменьшения фонового свечения после загрузки красителя препарат в течение 30 мин отмывали в бескальциевом растворе следующего состава (мМ): 89 NaCl, 4 KCl, 43 Na₂SO₄, 2 Tris, 167 сахароза, pH 7.4. Микроскопическое исследование препаратов проводилось на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 MP (Leica Microsystems, США) с использованием водно-иммерсионного объектива 20×/1.0 NA. Для возбуждения эмиссии красителя FM2–10 применялся Ar лазер. Длина волны возбуждения красителя составляла 488 нм, максимум длины волны эмиссии 610 нм. Анализ изображений проводился в программе ImageJ (NIH, США; веб-сайт программы https://imagej.net/ij/). Поскольку наши измерения зависели от индивидуальных характеристик регистрирующей аппаратуры, за единицу измерения интенсивности флуоресценции были приняты относительные единицы.

Для ингибирования Са²⁺-акцепторных белков использовали следующие реактивы: циклоспорин А (Sigma-Aldrich, США), STO-609 (Sigma-Aldrich) и W-5 гидрохлорид (Sigma-Aldrich). Поскольку данные вещества плохо растворимы в воде, мы делали промежуточный раствор, содержащий органический растворитель диметилсульфоксид (DMSO, Sigma-Aldrich), в котором растворяли вещества. Далее из промежуточного раствора вещества добавлялись в нужной концентрации в физиологический раствор. Для оценки влияния DMSO на изучаемые процессы проводили контрольные эксперименты в присутствии и в отсутствие DMSO.

В экспериментах по изучению процессов эндоцитоза везикул препараты фрагментов кожно-мускульного мешка дождевого червя инкубировали в присутствии блокаторов Са²⁺-акцепторных белков, окрашивали FM2–10 (22 мкМ) в гиперкалиевом растворе (40 мМ), отмывали в бескальциевом растворе, а затем проводили исследование на микроскопе. На полученных изображениях анализировалось среднее значение флуоресценции нервно-мышечных синапсов в контроле и после действия веществ. В следующей серии экспериментов изучались процессы экзоцитоза везикул в двигательных нервных терминалях. Для этого мышечные препараты дождевого червя окрашивали FM2–10 в гиперкалиевом растворе. Затем отмывали в течение 30 мин в бескальциевом растворе, после чего стимулировали в гиперкалиевом растворе и регистрировали флуоресценцию на 0, 3 и 5 мин «разгрузки» в контроле и после действия веществ.

В экспериментах с кальциевым хелатором BAPTA-AM (Sigma-Aldrich) предварительно окрашенные FM2–10 мышечные препараты инкубировали 30 мин в бескальциевом растворе с хелатором в концентрации 0.5 мМ. Затем препараты в присутствии хелатора разгружали в бескальциевом растворе (0 мМ Ca²⁺) с высоким содержанием K⁺ (40 мМ) следующего состава (мМ): 53 NaCl, 40 KCl, 43 Na₂SO₄, 2 Tris, 167 сахароза, pH 7.4. Потом регистрировали флуоресценцию нервно-мышечных синапсов при помощи микроскопа на 0, 3 и 5 мин «разгрузки».

В отдельной серии экспериментов проверяли выгорание красителя FM2–10. Для этого в нормальном растворе (при 4 мМ K⁺) регистрировали значения флуоресценции на 0, 3 и 5 мин. Средние значения флуоресценции достоверно не отличались друг от друга. Это говорит о том, что в наших условиях эксперимента выгорание красителя не наблюдалось.

Статистическая обработка данных проводилась в программе Excel 2016 (Microsoft Corporation, США; веб-сайт программы https://www.microsoft.com/ru-ru). Сравнение выборочных совокупностей проводили при помощи независимого t-критерия Стьюдента при уровне значимости 0.05. Результаты обработки значений флуоресценции приведены в виде среднего и стандартной ошибки среднего (M ± SEM).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Окрашивание мышечного препарата в гиперкалиевом растворе маркером FM2–10 в концентрации 22 мкМ приводило к появлению множества светящихся пятен овальной формы, которые являются кластерами синаптических образований с протекающими в них процессами экзо-эндоцитоза везикул (рис. 1).

 

Рис. 1. Флуоресценция нервно-мышечных синапсов соматических мышечных клеток дождевого червя, загруженных липофильным красителем FM2–10. (a) – 0 мин, (b) – через 5 мин «разгрузки» красителя при 40 мМ K⁺ в окружающем растворе. Масштабная линейка: 20 мкм.

 

Анализ флуоресцентных изображений синаптических контактов, загруженных красителем FM2–10, показал, что уровень флуоресценции составлял в контроле 88.3 ± 1.6 относительных единиц (о. е.) (n = 62) (рис. 2), а в присутствии 50 мкМ DMSO 86.5 ± 1.7 о. е. (n = 67) (рис. 2). Эти значения достоверно не отличались друг от друга (p > 0.05). Можно предполагать, что присутствие в окружающем растворе DMSO не оказывает существенного влияния на процессы эндоцитоза плазматических мембран в нервно-мышечных синапсах дождевого червя.

 

Рис. 2. Влияние DMSO, отсутствия ионов Са²⁺ в растворе, ингибитора кальциневрина – циклоспорина А, ингибитора Са²⁺/кальмодулин-зависимой протеинкиназы киназы – STO-609, антагониста кальмодулина – W-5 гидрохлорида на величину флуоресценции двигательных нервных терминалей препарата соматических мышечных клеток дождевого червя, загруженных липофильным красителем FM2–10. a. u. – относительные единицы.

 

При окрашивании мышечного препарата в бескальциевом гиперкалиевом растворе среднее значение флуоресценции составляло 81.5 ± 2.1 о. е. (n = 66) (рис. 2), которое достоверно не отличалось от контроля (p > 0.05). Таким образом, отсутствие ионов Са²⁺ снаружи клеток существенно не влияет на процессы эндоцитоза везикул в нервно-мышечных контактах дождевого червя. Известно, что увеличение концентрации ионов K⁺ во внешней среде приводит к деполяризации мембраны нервного окончания и возрастанию частоты спонтанной секреции медиатора в синаптическую щель [7]. Показано, что спонтанное освобождение нейромедиатора регулируется внеклеточным и внутриклеточным кальцием. Высвобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо регулирует спонтанный выброс в возбуждающих и тормозных синапсах [8]. В наших условиях деполяризация клеточной мембраны гиперкалиевым раствором в отсутствие ионов Са²⁺ снаружи клетки приводит к освобождению Ca²⁺ из внутриклеточных депо и увеличению частоты спонтанной секреции медиатора, что вызывает окрашивание нервных терминалей FM2–10 в процессе экзо-эндоцитоза синаптических везикул.

Кальциневрин – это активируемая Ca²⁺/кальмодулином серин/треониновая протеинфосфатаза, которая регулирует множество клеточных процессов, таких как экспрессия генов, ионный гомеостаз, дифференцировка мышц, секреция, эмбриогенез и т. д. [9]. Специфическое ингибирование циклоспорином А белка кальциневрина позволяет выявлять его роль в функционировании нервной системы [9]. В первичных культурах гиппокампальных нейронов блокирование кальциневрина угнетает эндоцитоз в синаптических терминалях [10]. Однако в нервно-мышечных соединениях дрозофилы ингибирование кальциневрина усиливает эндоцитоз везикул [11]. Наши эксперименты показали, что инкубация мышечного препарата в растворе в присутствии циклоспорина А в концентрации 10 мкМ в течение 15 мин приводила к достоверному возрастанию на 58% средней величины флуоресценции загруженных красителем FM2–10 синапсов. По сравнению с контролем значение составило 139.7 ± 1.7 о. е. (n = 102; p < 0.001) (рис. 2). Можно полагать, что ингибирование циклоспорином А белка кальциневрина приводит к усилению эндоцитоза везикул в нервно-мышечном соединении дождевого червя.

Ca²⁺/кальмодулин-зависимая протеинкиназа киназа (CaMKK) активирует CaM-киназу I (CaMKI), CaM-киназу IV (CaMKIV), протеинкиназу B (PKB/Akt) и 5′AMP-киназы (AMPK) посредством их фосфорилирования. Каскад киназ, опосредованный CaMKK, играет важную роль в ряде Ca²⁺-зависимых путей, таких как морфогенез и пластичность нейронов, активация транскрипции, аутофагия и регуляция метаболизма [12]. CaMKK регулирует множество клеточных путей мембранного траффикинга, в том числе клатрин-опосредованный эндоцитоз [13]. Препарат STO-609 ингибирует CaMKK, а также другую, не менее важную CaMK-киназу II (CaMKII) [14]. CaMKII – это наиболее распространенная киназа в возбуждающих синапсах, она ассоциирована с синаптическими везикулами, фосфорилирует большое количество синаптических белков и играет решающую роль в процессах синаптической пластичности и трансмиссии [15, 16]. Применение в наших экспериментах ингибитора STO-609 в концентрации 30 мкМ в течение 15 мин достоверно увеличивало среднее значение флуоресценции синапсов на 71% по сравнению с контролем и равнялось 151.9 ± 1.7 о. е. (n = 112; p < 0.001) (рис. 2). Таким образом, ингибирование CaMKK и CaMKII усиливало процессы эндоцитоза в нервно-мышечном контакте дождевого червя.

Кальмодулин является основным регулятором Ca²⁺-зависимых сигнальных путей в клетках, опосредуя многие физиологические процессы. При деполяризации нервной терминали Са²⁺/кальмодулин инициирует такие формы эндоцитоза, как клатрин-зависимый медленный эндоцитоз, балк-эндоцитоз, быстрый эндоцитоз и избыточный эндоцитоз [17]. В наших экспериментах аппликация на мышечный препарат 50 мкМ специфического антагониста кальмодулина – W-5 гидрохлорида в течение 15 мин вызывала достоверное возрастание величины флуоресценции нервных терминалей на 65% по сравнению с контролем и была равна 151.9 ± 1.7 о. е. (n = 105; p < 0.001) (рис. 2). Необходимо отметить, что средняя величина флуоресценции нервных терминалей в присутствии STO-609 или W-5 гидрохлорида была достоверно выше по сравнению с циклоспорином А (p < 0.01). Среднее значение флуоресценции в присутствии W-5 гидрохлорида не отличалось от флуоресценции в присутствии STO-609 (p > 0.05) (рис. 2). Таким образом, инактивация кальмодулина приводила к достоверному увеличению светимости двигательных нервных терминалей в мышечном препарате дождевого червя, что можно трактовать как усиление процесса эндоцитоза.

Инкубация окрашенных маркером FM2–10 мышечных препаратов в течение 3–5 мин в растворе c высоким содержанием ионов K⁺ приводила к «разгрузке» красителя из нервных терминалей (рис. 3). В контрольных экспериментах на 3-й и 5-й мин происходило снижение значений флуоресценции от начального уровня на 20% и 36% соответственно (рис. 3). Абсолютные средние величины флуоресценции составили: 0 мин – 110.6 ± 3.4 о. е. (n = 89), 3 мин – 88.3 ± 2.6 о. е. (n = 107), 5 мин – 70.5 ± 2.9 о. е. (n = 96). Значения во всех временных точках достоверно отличались друг от друга (p < 0.05).

 

Рис. 3. Влияние ингибитора кальциневрина – циклоспорина А, ингибитора Са²⁺/кальмодулин-зависимой протеинкиназы киназы – STO-609, антагониста кальмодулина – W-5 гидрохлорида, отсутствия ионов Ca²⁺ в окружающем растворе (0 мМ Са²⁺), кальциевого хелатора BAPTA-AM на «разгрузку» двигательных нервных терминалей препарата соматических мышечных клеток дождевого червя, окрашенных флуоресцентным красителем FM2–10. В отдельной серии экспериментов контролировалось выгорание красителя FM2–10 в нормальном растворе (4 мМ K⁺) в течение 5 мин.

 

В присутствии DMSO в гиперкалиевом растворе также происходила «разгрузка» красителя из двигательных нервных терминалей. Значения флуоресценции на 3-й и 5-й мин снизились на 19% и 31% соответственно (рис. 3). Абсолютные средние величины флуоресценции составили: 0 мин – 102.9 ± 2.3 о. е. (n = 93), 3 мин – 83.4 ± 2.3 о. е. (n = 97), 5 мин – 70.8 ± 2.4 о. е. (n = 106). Значения во всех временных точках достоверно отличались друг от друга (p < 0.05). При этом достоверных отличий между кривыми «разгрузки» в контроле и DMSO выявлено не было (p > 0.05).

В присутствии специфических блокаторов Са²⁺-сенсорных белков циклоспорина А, W-5 гидрохлорида и STO-609 динамика «разгрузки» FM2–10 замедлялась, значения флуоресценции уменьшались на 3-й мин на 7–11%, на 5-й мин на 18–22% от начального уровня (рис. 3). Абсолютные средние величины флуоресценции составили: для циклоспорина А – 0 мин – 107.7 ± 2.3 о. е. (n = 99), 3 мин – 95.5 ± 3.1 о. е. (n = 117), 5 мин – 88.1 ± 3.7 о. е. (n = 93); для W-5 гидрохлорида – 0 мин – 83.8 ± 2.2 о. е. (n = 123), 3 мин – 77.7 ± 2.4 о. е. (n = 117), 5 мин – 67.9 ± 2.1 о. е. (n = 106); для STO-609 – 0 мин – 88.8 ± 1.9 о. е. (n = 105), 3 мин – 79.7 ± 1.8 о. е. (n = 107), 5 мин – 67.9 ± 2.1 о. е. (n = 116). При этом во всех веществах средние значения светимости на 3-й и 5-й мин достоверно отличались от таковых в контроле и DMSO (p < 0.05). Таким образом, ингибирование Са²⁺-акцепторных белков кальциневрина, кальмодулина, CaMKK и CaMKII приводит к замедлению «разгрузки» маркера FM2–10 из двигательных нервных терминалей.

В бескальциевом гиперкалиевом растворе происходила «разгрузка» терминалей, загруженных FM2–10, однако динамика «разгрузки» красителя несколько замедлялась по сравнению с контрольной кривой и кривыми «разгрузки» в присутствии специфических блокаторов Са²⁺-сенсорных белков (рис. 3). При этом на 3-й и 5-й мин «разгрузки» средние значения флуоресценции в бескальциевом растворе достоверно снижались на 9% и 13% соответственно (p < 0.05). Абсолютные величины флуоресценции в бескальциевом растворе составили: 0 мин – 81.5 ± 2.8 о. е. (n = 103), 3 мин – 74.5 ± 2.5 о. е. (n = 102), 5 мин – 71.0 ± 2.8 о. е. (n = 99). Как уже было сказано выше, спонтанное освобождение везикул происходит и в отсутствие ионов Са²⁺ во внешней среде, поэтому мы наблюдаем «разгрузку» двигательных нервных терминалей. В нашем случае «разгрузка» красителя из двигательных нервных терминалей несколько тормозится. По-видимому, кроме Са²⁺ из внутриклеточных депо в процессе спонтанного экзо-эндоцитоза везикул в нервно-мышечном синапсе принимает участие также и внеклеточный Са²⁺. Эти результаты согласуются с данными литературы. Так, на центральных и периферических синапсах млекопитающих показано, что отсутствие ионов Са²⁺ во внешней среде только частично снижало интенсивность спонтанной секреции везикул с ацетилхолином в нервных терминалях [18, 19], а Са²⁺, освобождающийся из внутриклеточных запасов, регулирует спонтанное квантовое освобождение нейротрансмиттера [8].

В следующей серии опытов окрашенные FM2–10 нервно-мышечные синапсы разгружали в бескальциевом гиперкалиевом растворе в присутствии проникающего в клетки кальциевого хелатора BAPTA-AM. «Разгрузка» нервных терминалей не происходила, значение флуоресценции на 3-й и 5-й мин снижалось на 1–2%, что достоверно не отличалось от начального уровня (p > 0.05). Абсолютные величины флуоресценции при этом составили: 0 мин – 96.0 ± 3.1 о. е. (n = 98), 3 мин – 94.9 ± 2.5 о. е. (n = 101), 5 мин – 95.5 ± 2.2 о. е. (n = 105). Таким образом, хелатирование внутриклеточного Са²⁺ ингибирует спонтанную секрецию синаптических везикул, что отражается в отсутствии «разгрузки» окрашенных FM2–10 нервно-мышечных синапсов.

Известно, что реакции фосфорилирования-дефосфорилирования синаптических белков играют важную роль в рециклинге везикул. Так, дефосфорилирование синаптических белков кальциневрином влияет на фазу эндоцитоза синаптических везикул [20, 21]. В центральных синапсах гиппокампа мозга крысы размер рециклирующего пула везикул регулируется при участии CDK5/кальциневринового пути [22]. На нервно-мышечных соединениях дрозофилы показана роль кальциневрина в усилении процесса эндоцитоза, а также замедлении рециклинга синаптических везикул [11, 23]. В наших экспериментах инактивация кальциневрина увеличивала флуоресценцию загруженных FM2–10 двигательных нервных терминалей и замедляла их «разгрузку». Можно полагать, что ингибирование дефосфорилирования внутриклеточных белков приводит к увеличению интенсивности эндоцитоза и, как следствие, возрастанию размеров общего везикулярного пула и ускорению рециклинга синаптических везикул.

Кальмодулин как наиболее распространенный Са²⁺-акцепторный белок, связываясь с другими белками, в том числе с кальциневрином, изменяет их активность, а также способен контролировать рециклинг синаптических везикул через SNARE белковый комплекс [24]. В аудиторных синапсах ЦНС крысы восстановление пула быстро освобождаемых везикул происходит при участии белка кальмодулина [25]. Нами было показано, что ингибирование кальмодулина приводило к увеличению светимости загруженных FM2–10 синапсов и замедлению выхода маркера из терминалей при их «разгрузке» стимуляцией. Таким образом, инактивация кальмодулина также приводит к усилению процесса эндоцитоза везикул, возрастанию размеров общего везикулярного пула, а также ускорению рециклинга синаптических везикул в соматических мышцах дождевого червя.

Известно, что фермент CaMKK участвует в регуляции клеточного транспорта мембранных везикул [13]. Пресинаптическая киназа CaMKII фосфорилирует ряд ключевых белков экзоцитоза везикул, включая синтаксин, синапсин, RIM, SNARE белки и Са²⁺-каналы [26]. CaMKII также способна повышать подвижность синаптических везикул и облегчать спонтанное и вызванное квантовое освобождение нейромедиатора [27]. В наших экспериментах инактивация CaMKK и CaMKII в нервно-мышечных синапсах дождевого червя увеличивала флуоресценцию окрашенных FM2–10 терминалей и замедляла динамику их «разгрузки» при стимуляции. Таким образом, можно предположить, что блокирование фосфорилирования ряда ключевых синаптических белков также усиливает процесс эндоцитоза мембран, вызывает увеличение размеров общего везикулярного пула и ускоряет кругооборот синаптических везикул в соматических мышцах дождевого червя. Можно сделать вывод, что в механизмы кальциевой модуляции процессов экзо-эндоцитоза везикул в синапсах эволюционно-первичной мускулатуры аннелид вовлечены такие Са²⁺-акцепторные белки как кальциневрин, кальмодулин и Са²⁺/кальмодулин зависимые протеинкиназы. Кольчатые черви являются одними из первых животных в эволюционном ряду, которые обладают развитой мышечной системой. Полученные данные указывают на высокую генетическую стабильность системы кальциевой регуляции секреции нейромедиатора, которая, вероятно, сформировалась на ранних этапах эволюции нервно-мышечной регуляции двигательной активности у животных.

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Идея работы и планирование эксперимента (Л. Ф. Н. и Е. М. В.), сбор данных (Н. Д. А.), обработка данных (Л. Ф. Н., Н. Д. А.), написание и редактирование манускрипта (Л. Ф. Н., Е. М. В.).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств бюджета Российского научного фонда (проект 23–24–00239, https://rscf.ru/project/23–24–00239/). Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эксперименты с животными проводились в соответствии с международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований с лабораторными животными и были одобрены Комиссией по биоэтике Федерального исследовательского центра “Казанский научный центр Российской академии наук” (протокол № 23/5 от 12.05.2023 г.).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

L. F. Nurullin

Federal Research Center “Kazan Scientific Center of Russian Academy of Sciences”; Kazan State Medical University

Author for correspondence.
Email: lenizn@yandex.ru

Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics

Russian Federation, Kazan; Kazan

N. D. Almazov

Kazan State Medical University

Email: lenizn@yandex.ru
Russian Federation, Kazan

E. M. Volkov

Kazan State Medical University

Email: euroworm@mail.ru
Russian Federation, Kazan

References

Supplementary files