D-serine reduces extracellular serotonin level in the medial prefrontal cortex and enhances the formation of fear response in rats

Capa

Citar

Texto integral

Resumo

D-serine is an endogenous agonist of the glycine site of NMDA receptors. However, its contribution to the medial prefrontal cortex (mPFC) functions has been little studied. The purpose of the work was to study the involvement of D-serine in the mPFC in the formation and generalization of the conditioned fear response (CFR – a fear model), as well as in the regulation of serotonin release in this area. In Sprague-Dawley rats by means of in vivo microdyalisis and HPLC analysis, we showed that the intra-mPFC infusion of D-serine (1 mM) reduces the basal level of extracellular serotonin in this area and decreases its rise during CFR acquisition (pared presentation of a conditioned cue (CS+) and inescapable footshock but not during differentiation 1 (presentation of a differentiation cue (CS-) alone).The intra-mPFC D-serine infusion reduced animals’ freezing to CS+ (a measure of passive footshock anticipation) during the CFR acquisition and increased ambulation and the number of rearing (attempts to escape footshock). This pharmacological treatment, a day after it, increased animals’ freezing to the potentially dangerous CS+, but did not affect freezing to the safe CS-. The data obtained indicate for the first time that, with a decrease in the release of serotonin in the mPFC, stimulation of the mPFC by D-serine enhances the animals’ active strategy of avoiding shock and suppresses the passive strategy of anticipating it.

This is accompanied by increased acquisition and/or consolidation of the CFR, but does not affect its generalization.

Texto integral

ВВЕДЕНИЕ

Оптический изомер серина D-серин является эндогенным агонистом глицинового сайта NMDA-рецепторов глутамата. В ЦНС млекопитающих D-серин присутствует в виде свободной аминокислоты в концентрациях, коррелирующих с плотностью NMDA-рецепторов [1]. Высокое содержание D-серина выявлено в корковых областях, в том числе в медиальной префронтальной коре (мПК), где на его долю приходится около 20 % серина [2]. D-серин продуцируется преимущественно нейронами (90 %) и в меньшей степени астроцитами (10 %) в результате рацемизации L-серина, катализируемой серин-рацемазой [3]. Высвобождение D-серина, участвующего в функциональной активации NMDA-рецепторов, тоже осуществляют нейроны (постсинаптические участки) [4] и астроциты [5, 6]. При этом астроциты обеспечивают захват D-серина из внеклеточного пространства и его ферментативную деградацию [7], а также являются источником L-серина, участвующего в синтезе D-серина [8].

В литературе накапливаются данные о вкладе D-серина и D-серин-зависимой активации NMDA-рецепторов ЦНС в механизмы обучения и памяти [6], включая память о страхе [9–11]. Продемонстрировано, что дисфункция D-сериновой системы ЦНС может быть вовлечена в патогенез ряда психических расстройств, характеризующихся патологическими изменениями проявлений страха [1, 3]. Одним из основных центров контроля страха является мПК, участвующая в формировании и генерализации памяти о страхе [12]. Кроме того, мПК играет важную роль в регуляции высших когнитивных процессов, в том числе в выборе стратегии поведения и в обеспечении его гибкости [13]. Следует отметить, что мПК является единственной областью коры, посылающей проекции к ядрам шва [14], что позволяет ей управлять активностью серотониновых нейронов, иннервирующих многие отделы ЦНС [15]. В частности, показано, что мПК генерирует и передает сигнал о контролируемости стресса нейронам ядер шва, снижающий выброс серотонина в ряде структур переднего мозга [15]. Это способствует усилению избегательных реакций на стресс и ослаблению пассивных форм реагирования (замирание) [15]. Вклад D-сериновых сигналов мПК в такую регуляцию не изучен.

В ряде исследований показано участие NMDA-зависимой нейротрансмиссии в прелимбическом отделе мПК в выработке и/или консолидации условной реакции страха (УРС, модель страха) [16, 17], а также в генерализации УРС [16, 18]. Вместе с тем отсутствуют сведения о роли в этих процессах D-сериновых механизмов мПК.

Ранее мы установили, что выработка УРС (сочетание условного сигнала (CS+) c неизбегаемым электрокожным раздражением) сопровождается выбросом серотонина в мПК, усиливающим будущую генерализацию УРС (проявления страха на безопасный дифференцировочный раздражитель (CS-)), но не влияющим на память о потенциально опасном CS+ [19]. Однако неизвестно, могут ли локальные D-сериновые сигналы изменять выброс серотонина в мПК и как это соотносится с формированием и генерализацией УРС.

Цель работы заключалась в исследовании вклада D-сериновой активации NMDA-рецепторов мПК в регуляцию выброса серотонина в этой корковой области, в выбор активной или пассивной поведенческой стратегии в ответ на неизбегаемый болевой стресс при выработке УРС, а также в процессы формирования и генерализации УРС. Для этого было изучено влияние введения в мПК в ходе выработки УРС D-серина (1мМ), во-первых, на изменения уровня внеклеточного серотонина в мПК; во-вторых, на активные (перемещения, стойки) и пассивные (замирание) поведенческие ответы в ходе выработки УРС; в-третьих, на проявления УРС (замирание на CS+) и на генерализацию УРС (замирание на CS-) через сутки после выработки УРС. Таких сведений в литературе нет.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали самцов крыс линии Спрег-Доули массой 325–420 г (возраст 3–4 месяца) из ЦКП «Биоколлекция Института физиологии им. И.П. Павлова РАН для исследования интегративных механизмов деятельности нервной и висцеральных систем» (Санкт-Петербург). В ходе экспериментов животных содержали индивидуально при естественном режиме освещенности. Доступ к воде и лабораторному корму был свободным.

Крысам под наркозом (рометар, «Spopha», Чешская Республика, 1.4 мг/100 г и золетил, «Virbac Sante Animale», Франция, 5 мг/100 г, внутримышечно) в правую мПК по стереотаксическим координатам черепа имплантировали микродиализные канюли [20]. Для предотвращения послеоперационного воспаления крысам вводили антибиотик бициллин-5 («Синтез», Россия, 30000 ЕД/100 г, внутримышечно). Эксперименты начинали через сутки после имплантации. Они включали два этапа (рис. 1) – этап обучения (экспериментальный день 1) и этап тестирования (экспериментальный день 2). Для детального описания см. [21].

 

Рис. 1. Схема эксперимента. (CS+) – условный сигнал; (CS-) – дифференцировочный сигнал; US – безусловный стимул (электрокожное раздражение).

 

В начале экспериментального дня каждую крысу тестировали в установке «Открытое поле» в течение 5 мин для оценки изначального уровня подвижности. Регистрировали горизонтальную двигательную активность, оцениваемую по пересечениям границ секторов установки, и число стоек. Затем животное помещали в дневной бокс и начинали процедуру микродиализа мПК искусственной спинномозговой жидкостью (ИСМЖ, 1мкл/мин). После стабилизационного периода (1 ч) и сбора 5 фоновых порций диализата (по 15 мин каждая) животных разделяли на 2 группы: «D-Serine» (n = 9) и «Без введения» (n = 12). Каждой крысе группы «D-Serine» в ИСМЖ, прокачиваемую через диализную канюлю, вводили D-серин (1мМ, «MP Biomedicals», США) и собирали 4 порции диализата (по 15 мин каждая). Затем, не прерывая процедуру введения D-серина в мПК и сбора диализата, проводили выработку УРС. Крысу на 5 мин помещали в камеру А (желтые стены, решетчатый пол) и предъявляли условный сигнал (CS+, непрерывный тон, 1000 Гц, 10 с, 5 раз, интервал 50 с) в сочетании с неизбегаемым электрокожным раздражением, подаваемым через решетку пола (0.5 мА, 1 с). Регистрировали следующие параметры: 1) время замирания на CS+ (с), отражающее ожидание болевого раздражения; 2) время замирания в межсигнальных интервалах (с); 3) активные формы поведения – горизонтальную двигательную активность (пересечения границ секторов камеры) и стойки, отражающие попытки животного избежать болевого раздражения. После этого крысу возвращали в дневной бокс и через 70 мин проводили дифференцировку 1. Животное переносили на 5 мин в камеру B (белый пол, белые стены) и предъявляли дифференцировочный сигнал (CS-, прерывистый тон 1000 Гц, 10 с, 5 раз, интервал 50 с) без болевого раздражения. Регистрировали время замирания на CS- (с), отражающее первоначальную генерализацию УРС, время замирания в межсигнальных интервалах, горизонтальную двигательную активность (пересечения) и число стоек. Затем животное возвращали в бокс на 55 мин, после чего сбор диализата завершали и отмывали канюлю от D-серина, пропуская через нее ИСМЖ (1 мкл/мин, 15 мин). Животных группы «Без введения» подвергали тем же процедурам, но без добавления D-серина в ИСМЖ для перфузии мПК.

На следующий день (экспериментальный день 2, этап тестирования) с крысами обеих групп проводили три последовательных поведенческих теста (рис. 1). Сначала животных в течение 5 мин тестировали в приподнятом крестообразном лабиринте. Регистрировали следующие параметры поведения в закрытых и открытых рукавах лабиринта: 1) горизонтальную двигательную активность (по пересечению границ секторов); 2) число стоек/свешиваний; 3) длительность пребывания (с). После этого возобновляли диализную перфузию мПК ИСМЖ и через 2 ч проводили дифференцировку 2 так же, как дифференцировку 1. Регистрировали длительность замирания (c) на CS- и в межсигнальных интервалах параметры, отражающие генерализацию УРС. Через 70 мин проводили тестирование животных на проявления УРС. Животных помещали на 5 мин в камеру A и предъявляли CS+ так же, как при выработке УРС, но без болевого раздражения. Проявления условнорефлекторного страха оценивали по замиранию животных (c) на CS+ и в межсигнальных интервалах.

Мы не можем полностью исключить влияние послеоперационного стресса и наркоза, а также самой диализной перфузии на изучаемые показатели, но животные сравниваемых групп находились в равных условиях.

Определение уровня серотонина в диализате мПК осуществляли методом ВЭЖХ (LC-10ATVP, «Shimadzu», Германия) с электрохимической детекцией (Procede «Antec Leyden», Нидерланды), как было описано ранее [21]. Для регистрации и обработки хроматограмм использовали аппаратно-программный комплекс МультиХром 1.72 («Амперсенд», Россия). Концентрацию серотонина в диализате мПК выражали в нМ, а затем – в процентах к собственному среднему фоновому уровню перед тестами. После окончания экспериментов животных забивали и проводили морфологический контроль попаданий, как описано ранее [19]. В статистическую обработку включали крыс с локализацией канюль в мПК (преимущественно прелимбический отдел).

Статистическую обработку проводили с использованием пакета SigmaStat (3.0). Данные представляли как среднее ± стандартная ошибка среднего. Сравниваемые выборки проверяли на нормальность распределения методом Колмогорова – Смирнова и далее применяли методы параметрической статистики, если данные удовлетворяли критерию нормальности, или непараметрической статистики, если не удовлетворяли. Для сравнения изменений уровня внеклеточного серотонина в мПК относительно собственного фонового уровня в ходе поведенческих тестов, проводимых на фоне введения или без введения D-серина в мПК, использовали однофакторный дисперсионный анализ Фридмана для повторяющихся замеров (хи-квадрат, фактор – время) и критерий Ньюмана – Килса для апостериорного сравнения. Для выяснения влияния введения D-серина на базальный уровень внеклеточного серотонина в мПК перед поведенческими тестами (начало эксперимента) применяли однофакторный дисперсионный анализ для повторяющихся замеров (F-критерий, фактор – время). Для межгруппового сравнения изменений уровня серотонина использовали двухфакторный дисперсионный анализ (F-критерий, факторы – время и группа) и критерий Ньюмана – Килса для апостериорного сравнения. Попарное сравнение параметров поведения проводили с использованием t-критерия Стьюдента, если сравниваемые выборки соответствовали нормальному распределению, или с помощью критерия Манна – Уитни, если не соответствовали. Использовали уровень достоверности p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Перед началом микродиализных экспериментов крысы групп «D-Serine» (n = 9) и «Без введения» (n = 12) не различались между собой по величине горизонтальной двигательной активности (рис. 2, t = 0.06, p = 0.95) и числу стоек (рис. 2, t = 1.6, p = 0.12) в тесте «Открытое поле».

 

Рис. 2. Горизонтальная двигательная активность, пересечения (Ambulation, crossing) и число стоек (Rearing) в тесте «Открытое поле» у крыс до введения D-серина в мПК (Before D-Serine) и у животных без введения D-серина (No Treatment). Достоверных отличий не найдено, t-критерий Стьюдента.

 

По данным однофакторного дисперсионного анализа, выработка УРС у крыс группы «Без введения» сопровождалась ростом уровня внеклеточного серотонина в мПК относительно фонового уровня перед тестом (рис. 3), что соответствует ранее опубликованным нами данным [21]. Животные этой группы не демонстрировали достоверных изменений уровня серотонина в мПК в ходе дифференцировки 1 (рис. 3).

 

Рис. 3. Изменения уровня внеклеточного серотонина в мПК в процессе выработки УРС (CFR Training) и дифференцировки 1 (Differentiation 1) у крыс, подвергавшихся (D-Serine + CFR Training) и не подвергавшихся (CFR Training) введению в мПК D-серина. Выработка УРС приводила к подъему уровня серотонина в мПК (хи-квадрат = 57.5, k = 13, p < 0.001, критерий Фридмана, однофакторный дисперсионный анализ). Введение 1мМ D-серина снижало базальный уровень серотонина в мПК (F(8, 64) = 27.4, p < 0.001, F-критерий, однофакторный дисперсионный анализ) и на этом фоне уменьшало его подъем во время выработки УРС (F(13, 266) = 3.8, p < 0.001, F-критерий, двухфакторный дисперсионный анализ). Ось X – время, мин; ось Y – уровень внеклеточного серотонина, % к фону; разброс на графике – ошибка среднего; стрелки – поведенческие тесты; горизонтальная линия – период введения D-серина. * – p < 0.05 – при сравнении с фоном (критерий Ньюмана – Килса); + – p < 0.05– при межгрупповом сравнении (критерий Ньюмана – Килса; # – p < 0.05 – при сравнении с уровнем серотонина, измененным введением D-серина перед тестом (критерий Ньюмана – Килса).

 

Введение D-серина (1 мМ) в мПК крыс группы «D-Serine» сопровождалось снижением базального уровня внеклеточного серотонина в этой области (рис. 3) относительно фона перед введением. Однофакторный дисперсионный анализ, охватывающий весь период введения D-серина, показал, что такое фармакологическое воздействие влияет на динамику изменений уровня внеклеточного серотонина в мПК в ходе поведенческих тестов (хи-квадрат = 66.5, k = 17, p < 0.001, критерий Фридмана). По данным апостериорного анализа, выработка УРС и дифференцировка 1 у животных группы «D-Serine» приводили к подъему уровня внеклеточного серотонина в мПК относительно этого показателя непосредственно перед тестами (соответственно q = 8.8, p < 0.05 и q = 7.1, p < 0.05, критерий Ньюмана – Килса), но не относительно фонового уровня перед введением препарата (соответственно q = 3.8, p > 0.05 и q = 0.7, p > 0.05, критерий Ньюмана – Килса).

Межгрупповое сравнение выявило влияние группы на изменения уровня серотонина в ходе выработки УРС относительно фонового уровня (рис. 3). А именно, крысы группы «D-Serine» во время выработки УРС характеризовались меньшим уровнем внеклеточного серотонина в мПК по сравнению с животными группы «Без введения» (q = 9.4, p < 0.001, критерий Ньюмана – Килса). Группы не различались между собой по уровню серотонина в мПК во время дифференцировки 1 (q = 1.1, p = 0.4, критерий Ньюмана – Килса).

Введение в мПК D-серина во время выработки УРС уменьшало в ходе этого теста замирание животных на CS+ (рис. 4а) и в межсигнальных интервалах (рис. 4b) по сравнению с соответствующими показателями крыс группы «Без введения». При этом во время дифференцировки 1 животные с введением и без введения D-серина в мПК не различались между собой по замиранию на CS- (рис. 4а, t = 0.6, p = 0.6) и в межсигнальных интервалах (рис. 4b, t = 1.2, p = 0.3).

 

Рис. 4. (а) – Длительность замирания на звуковые сигналы (CS+, CS-, с) и (b) в межсигнальных интервалах (CS+ test, CS- test, c) во время выработки УРС (CFR Training) и дифференцировки 1 (Differentiation 1) у крыс с введением в мПК 1мМ D-серина (D-Serine) и у животных, не подвергавшихся введению препарата (No Treatment). Введение D-серина уменьшало замирание на CS+ и в межсигнальных интервалах во время выработки УРС. + – p = 0.04, t = 2.3; +++ – p < 0.001, t = 3.9 – при межгрупповом сравнении (t-критерий Стьюдента).

 

Сравнение активных форм поведения животных на этапе обучения, отражающих активные попытки избежать болевого раздражения, показало, что у крыс группы «D-серин» во время выработки УРС наблюдалось увеличение горизонтальной двигательной активности и числа стоек (рис. 5а) по сравнению с величиной этих параметров у крыс группы «Без введения». Вместе с тем во время дифференцировки 1 не было обнаружено различий между животными с введением и без введения D-серина в мПК по этим показателям (рис. 5b, p = 0.51 и p = 0.50 соответственно, критерий Манна – Уитни).

 

Рис. 5. Увеличение горизонтальной двигательной активности (пересечения), (Ambulation, crossing lines) и числа стоек (Rearing) (a) во время выработки УРС (CFR Training), (b) но не во время дифференцировки 1 (Differentiation 1) у крыс с введением D-серина (D-Serine) в мПК при сравнении с крысами без введения D-серина (No Treatment). ++ – p = 0.02 (критерий Манна – Уитни); *** – p < 0.001, t = 4.2 (t-критерий Стьюдента) – при межгрупповом сравнении. Остальные обозначения, как на рис. 3.

 

Через сутки после выработки УРС в ходе дифференцировки 2 животные, подвергнутые накануне введению D-серина в мПК, не отличались от крыс группы «Без введения» по замиранию на безопасный CS- (рис. 6a, t = 1.1, p = 0.3, t-критерий Стьюдента) и в межсигнальных интервалах (рис. 6a, p = 0.8, критерий Манна – Уитни). Однако во время тестирования УРС животные группы «D-серин» демонстрировали большее замирание на потенциально опасный CS+ (рис. 6b) и в интервалах между CS+ (рис. 6b) по сравнению с крысами группы «Без введений».

 

Рис. 6. (а) – Длительность замирания на звуковые сигналы (CS- или CS+, с) и (b) – Длительность замирания в межсигнальных интервалах (CS+ test, CS- test, c) во время дифференцировки 2 (Differentiation 2) и при тестировании УРС (CFR Testing) у крыс, ранее подвергавшихся (After D-Serine) и не подвергавшихся (No Treatment) введению в мПК 1мМ D-серина. Введение D-серина увеличивало замирание на CS+ (+ – p = 0.01, t = 2.7, t-критерий Стьюдента) и в межсигнальных интервалах & – p = 0.004, (критерий Манна – Уитни) во время тестирования УРС. * – p < 0.05, (t-критерий Стьюдента) и # – p < 0.05 (критерий Манна – Уитни) – при сравнении между тестами.

 

При тестировании в крестообразном лабиринте через сутки после выработки УРС мы не обнаружили достоверных различий между крысами групп «D-серин» и «Без введения» по следующим параметрам: по времени пребывания в закрытых и в открытых рукавах лабиринта (рис. 7а, соответственно p = 0.45 и p = 0.5); по горизонтальной двигательной активности в закрытых и открытых рукавах лабиринта (рис. 7b, соответственно p = 0.3 и p = 0.5). У крыс группы «D-серин» наблюдалась тенденция к увеличению числа стоек в закрытых рукавах лабиринта (рис. 7c; p = 0.06, критерий Манна – Уитни).

 

Рис. 7. (a) – Длительность пребывания, с, (b) – Горизонтальная двигательная активность (Ambulation), пересечения, (с) – Стойки/свешивания в открытых (Open arms) и закрытых (Closed arms) рукавах крестообразного лабиринта у крыс, ранее подвергавшихся (After D-Serine) и не подвергавшихся (No Treatment) введению в мПК 1мМ D-серина. Достоверных отличий не найдено, критерий Манна – Уитни.

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

NMDA-зависимая нейропластичность играет важную роль в обеспечении функций мПК, в том числе связанных с формированием и регуляцией памяти о страхе [18, 22, 23]. В частности, на крысах продемонстрировано, что активация NMDA-рецепторов мПК после выработки УРС локальным введением NMDA способствует консолидации условнорефлекторного страха обстановки [16], что проявляется в усилении замирания животных (показатель страха) в камере, ранее сочетавшейся с болевым раздражением.

Основным результатом настоящей работы являются данные, впервые показавшие, что стимуляция мПК D-серином, агонистом глицинового сайта NMDA-рецепторов, может вносить весомый вклад в формирование и/или консолидацию памяти о страхе. Об этом свидетельствует тот факт, что введение в мПК во время и после выработки УРС D-серина увеличивает через сутки замирание крыс на условный (CS+) и обстановочный (камера А в интервалах между CS+) сигналы (рис. 6a, b). Этот результат, во-первых, подтверждает данные литературы, продемонстрировавшие, что стимуляция глицинового сайта NMDA-рецепторов мозга циклосерином, частичным агонистом этого сайта, усиливает консолидацию УРС на звуковые и обстановочные сигналы [24]. Во-вторых, он показывает, что влияние такого системного воздействия на NMDA-рецепторы может быть опосредовано D-серин-зависимыми механизмами мПК.

Следует отметить, что показанное в работе влияние D-серина на замирание, вызываемое потенциально опасными стимулами, не является следствием отсроченного действия препарата на подвижность и тревожность животных, так как крысы с введением и без введения D-серина в мПК не различались между собой через сутки по длительности пребывания (рис. 6a) и подвижности (рис. 7b, c) в закрытых и открытых рукавах крестообразного лабиринта, а также по замиранию на безопасные раздражители (CS- и камеру B) во время дифференцировки 2 (рис. 6a, b). Последнее, кроме того, свидетельствует, что D-сериновые механизмы мПК не вносят заметный вклад в генерализацию реакции страха в этих экспериментах.

Вместе с тем в нескольких работах, использующих методы активации и генетического удаления NMDA-рецепторов мПК, показано вовлечение NMDA-зависимых процессов в этой корковой области в генерализацию УРС, проявляющуюся в замирании животных на безопасные сигналы [16, 18]. Сопоставление этих данных с результатами настоящей работы позволяет сделать вывод, что D-сериновый компонент активации NMDA-рецепторов мПК, видимо, в большей степени связан с формированием УРС, в то время как общая активация NMDA-рецепторов мПК важна и для формирования УРС, и для ее генерализации.

Такая избирательность действия D-серина, возможно, вызвана разной функциональной ролью подтипов NMDA-рецепторов [22] в сочетании с их различиями в чувствительности к коагонистам, D-серину и глицину [25]. Об этом свидетельствует следующее. Во-первых, есть данные, что в синаптических (NR2A-содержащих) NMDA-рецепторах в качестве коагониста преимущественно используется D-серин, а в несинаптических (NR2B-содержащих) NMDA-рецепторах – глицин [25]. Во-вторых, продемонстрировано вовлечение NR2A-содержащих, но не NR2B-содержащих NMDA-рецепторов мПК в формирование УРС на обстановочные и на отсроченные звуковые сигналы [22]. Взятые вместе эти литературные данные предполагают возможное участие регулируемых D-серином NMDA-рецепторов мПК в формировании УРС на звуковые и обстановочные стимулы. Результаты настоящей работы, приведенные выше, подтверждают это предположение.

В работе показан ранее неизвестный факт, что выработка УРС на фоне введения D-серина в мПК сопровождается уменьшением замирания животных на CS+ и камеру А во время этого теста с параллельным усилением активных форм поведения (горизонтальная двигательная активность, стойки), отражающих безуспешные попытки животных избежать болевого раздражения (рис. 5a). Причем такие изменения поведения не связаны с общей двигательной активацией животных под действием препарата, поскольку не наблюдаются при дифференцировке 1 (рис. 5b). Этот результат перекликается с литературными данными, что увеличение уровня D-серина в ЦНС мышей вследствие приема D-серина с питьевой водой или в результате усиления экспрессии серин-рацемазы уменьшает периоды неподвижности в тесте «Вынужденное плавание» без изменения двигательной активности в тесте «Открытое поле» [26], то есть мобилизует ресурсы мозга на активные поиски выхода, хотя и в другой поведенческой ситуации. Наши результаты позволяют предположить, что D-сериновые механизмы мПК могут опосредовать эту важную функцию.

Вероятным механизмом, запускающим такие изменения поведения, может быть стимуляция D-серином группы пирамидных нейронов мПК, вовлекаемых, по данным литературы [15], в передачу сигнала о контролируемости стресса ГАМКергическим интернейронам ядер шва и через них – серотониновым нейронам (рис. 8). мПК генерирует такой сигнал в естественных условиях, если животное может избежать или ограничить болевой стресс [15]. Его назначение – затормозить вызываемую стрессом активацию серотониновых нейронов, снизить выброс серотонина в связанных с реакцией на стресс областях мозга, включая мПК [27], и переключить за счет этого стратегию поведения животных с пассивной (замирание) на активную (поиски выхода) [15]. Введение D-серина в мПК может имитировать такой сигнал за счет стимуляции NMDA-рецепторов на пирамидных нейронах этой области, что и вызывает, как мы думаем, перечисленные выше поведенческие и нейрохимические эффекты. А именно, локальное введение D-серина в мПК приводило в наших экспериментах к снижению базального уровня внеклеточного серотонина в этой области и на этом фоне ограничивало его функциональный подъем во время выработки УРС (рис. 3), подавляло пассивные (рис. 4a, b) и усиливало активные (рис. 5a) формы поведения. Следует отметить, что в литературе есть сведения о вовлечении NMDA-рецепторов в тормозную регуляцию базального выброса серотонина в мПК [28]. Значимый результат работы – в ней впервые продемонстрирована модуляция данной функции NMDA-рецепторов мПК D-cерином и показано, что такая модуляция может иметь функциональные последствия, выражающиеся в активизации попыток животного предотвратить болевое раздражение.

 

Рис. 8. Предполагаемый механизм влияния D-серина на выброс серотонина в мПК и на поведение животных во время выработки и тестирования УРС, базирующийся на результатах данной статьи и на анализе Maier [15]. mPFC – мПК, DRN – дорсальное ядро шва, GLU – глутамат, GABA – ГАМК, 5HT – серотонин, NMDAr – NMDA-рецептор, CFR formation – выработка УРС, + – активация, – – торможение. Черная стрелка – снижение уровня серотонина в ответ на неизбегаемый стресс.

 

Таким образом, полученные в работе новые данные свидетельствуют, что D-сериновая стимуляция мПК в ходе выработки УРС, снижающая выброс серотонина в этой области, усиливает попытки животного избежать болевого раздражения, являющегося неизбегаемым в данном поведенческом тесте. Это, возможно, усиливает аверсивность болевого подкрепления и, как следствие, приводит к усилению формирования и/или консолидации УРС.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы выражают благодарность м. н. с. Надежде Анатольевне Трофимовой за помощь в проведении экспериментов.

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Планирование работы (Н. Б. С.), проведение экспериментов (М. А. С., Н. Б. С.), статистическая обработка и анализ данных (Н. Б. С., М. А. С.), написание и редактирование статьи (Н. Б. С., М. А. С.).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств федерального бюджета в рамках государственного задания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (№ 1021062411629–7–3.1.4). Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эксперименты с животными проводились в соответствии с международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований с лабораторными животными и были одобрены Комиссией по этике Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (протокол № 04/19 от 19.04.2021 г.).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

×

Sobre autores

N. Saulskaya

Pavlov Institute of Physiology, Russian Academy of Sciences

Autor responsável pela correspondência
Email: saulskayanb@infran.ru
Rússia, Saint Petersburg

M. Susorova

Pavlov Institute of Physiology, Russian Academy of Sciences

Email: saulskayanb@infran.ru
Rússia, Saint Petersburg

Bibliografia

  1. Nishikawa T (2011) Analysis of free D-serine in mammals and its biological relevance. J Chromatogr B879: 3169–3183. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2011.08.030
  2. Umino A, Ishiwata S, Iwama H, Nishikawa T (2017) Evidence for tonic control by the GABAA receptor of extracellular D-Serine concentrations in the medial prefrontal cortex of rodents. Front Mol Neurosci 10: 271–338. https://doi.org/10.3389/fnmol.2017.00240
  3. Guercio GD, R Panizutti (2018) Potential and challenges for the clinical use of D-serine as a cognitive enhancer. Front Psychiatry 9: 14. https://doi.org/10.3389/fpsyt.2018.00014
  4. Wong JM, Folorunso OO, Barragan EV, Berciu C, Harvey TL, Coyle JT, Balu DT, Gray JA (2020) Postsynaptic Serine Racemase Regulates NMDA Receptor Function. J Neurosci 40: 9564–9575. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.1525-20.2020
  5. Abreu DS, Gomes JI, Ribeiro FF, Diógenes MJ, Sebastião AM, Vaz SH (2023) Astrocytes control hippocampal synaptic plasticity through the vesicular-dependent release of D-Serine. Front Cell Neurosci 17: 1282841. https://doi.org/10.3389/fncel.2023.1282841
  6. Koh W, Park M, Chun YE, Lee J, Shim HS, Park MG, Kim S, Sa M, Joo J, Kang H, Oh S-J, Woo J, Chun H, Lee SE, Hong J, Feng J, Li Y, Ryu H, Cho J, Lee CJ (2021) Astrocytes render memory flexible by releasing D-serine and regulating NMDA receptor tone in the hippocampus. Biol Psychiatry 91: 740–752. https://doi.org/10.1016/j.biopsych.2021.10.012
  7. Krishnan KS, Billups B (2023) ASC Transporters mediate D-serine transport into astrocytes adjacent to synapses in the mouse brain. Biomolecules 13: 819. https://doi.org/10.3390/biom13050819
  8. Neame S, Safory H, Radzishevsky I, Wolosker H (2019) The NMDA receptor activation by D-serine and glycine is controlled by an astrocytic Phgdh-dependent serine shuttle. Proc Natl Acad Sci U S A 116: 20736–20742. https://doi.org/10.1073/pnas.1909458116
  9. Balu DT, Presti KT, Huang CCY, Muszynski K, Radzishevsky I, Wolosker H, Guffanti G, Ressler KJ, Coyle JT (2018) Serine racemase and D-serine in the amygdala are dynamically involved in fear learning. Biol Psychiatry 83: 273–283. https://doi.org/10.1016/j.biopsych.2017.08.012
  10. Inoue R, Ni X, Mori H (2023) Blockade of D-serine signaling and adult hippocampal neurogenesis attenuates remote contextual fear memory following multiple memory retrievals in male mice. Front Neurosci 16: 1030702. https://doi.org/10.3389/fnins.2022.1030702
  11. Inoue R, Talukdar G, Takao K, Miyakawa T, Mori H (2018) Dissociated role of D-serine in extinction during consolidation vs. reconsolidation of context conditioned fear. Front Mol Neurosci 11: 161. https://doi.org/10.3389/fnmol.2018.00161
  12. Xu W, Sudhof TC (2013) A neural circuit for memory specificity and generalization. Science 339: 1290–1295. https://doi.org/10.1126/science.1229534
  13. Pastor V, Medina JH (2021) Medial prefrontal cortical control of reward- and aversion-based behavioral output: Bottom-up modulation. Eur J Neurosci 53: 3039–3062. https://doi.org/10.1111/ejn.15168
  14. Peyron C, Petit JM, Rampon C, Jouvet M, Luppi PH (1998) Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods. Neuroscience 82: 443–468. https://doi.org/10.1016/S0306-4522(97)00268-6
  15. Maier SF (2015) Behavioral control blunts reactions to contemporaneous and future adverse events: medial prefrontal cortex plasticity and a corticostriatal network. Neurobiol Stress 1: 12–22. https://doi.org/10.1016/j.ynstr.2014.09.003
  16. Vanvossen AC, Portes MAM, Scoz-Silva R, Reichmann HB, Stern CAJ, Bertoglio LJ (2017) Newly acquired and reactivated contextual fear memories are more intense and prone to generalize after activation of prelimbic cortex NMDA receptors. Neurobiol Learn Mem 137: 154–162. https://doi.org/10.1016/j.nlm.2016.12.002
  17. Heroux NA, Horgan CJ, Stanton ME (2021) Prefrontal NMDA-receptor antagonism disrupts encoding or consolidation but not retrieval of incidental context learning. Behav Brain Res 405: 113175. https://doi.org/10.1016/j.bbr.2021.113175
  18. Vieira PA, Corches A, Lovelace JW, Westbrook KB, Mendoza M, Korzus E (2015) Prefrontal NMDA receptors expressed in excitatory neurons control fear discrimination and fear extinction. Neurobiol Learn Mem 119: 52–62. https://doi.org/10.1016/j.nlm.2014.12.012
  19. Saulskaya NB, Marchuk OE (2020) Inhibition of serotonin reuptake in the medial prefrontal cortex during acquisition of a conditioned reflex fear reaction promotes formation of generalized fear. Neurosci Behav Physiol 50: 432–438. https://doi.org/10.1007/s11055-020-00918-x
  20. Saul’skaya NB, Sudorgina PV (2016) Activity of the nitrergic system of the medial prefrontal cortex in rats with high and low levels of generalization of a conditioned reflex fear reaction. Neurosci Behav Physiol 46: 964–970. https://doi.org/10.1007/s11055-016-0338-2
  21. Saulskaya NB, Susorova MA, Trofimova NA (2023) Effect of nitric oxide synthase inhibitors on serotonin release in medial prefrontal cortex during conditioned fear response acquisition and generalization in rats. J Evol Biochem Physiol 59: 1700–1709. https://doi.org/10.1134/S0022093023050204
  22. Gilmartin MR, Kwapis JL, Helmstetter FJ (2013) NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in the prelimbic medial prefrontal cortex differentially mediate trace, delay, and contextual fear conditioning. Learn Mem 20: 290–294. https://doi.org/.1101/lm.053894.123
  23. Chen QY, Li XH, Zhuo M (2021) NMDA receptors and synaptic plasticity in the anterior cingulate cortex. Neuropharmacology 197: 108749. https://doi.org/10.1016/j.neuropharm.2021.108749
  24. Handford CE, Tan S, Lawrence AJ, Kim JH (2014) The effect of the mGlu5 negative allosteric modulator MTEP and NMDA receptor partial agonist D-cycloserine on Pavlovian conditioned fear. Int J Neuropsychopharmacol 17: 1521–1532. https://doi.org/10.1017/S1461145714000303
  25. Papouin T, Ladepeche L, Ruel J, Sacchi S, Labasque M, Hanini M, Groc L, Pollegioni L, Mothet J-P, Oliet SHR (2012) Synaptic and extrasynaptic NMDA receptors are gated by different endogenous coagonists. Cell 150: 633–664. https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.06.029
  26. Otte D-M, Barcena de Arellano ML, Bilkei-Gorzo A, Albayram O, Imbeault S, Jeung H, Alferink J, Zimmer A (2013) Effects of Chronic D-Serine Elevation on Animal Models of Depression and Anxiety-Related Behavior. Plos One 8: e67131 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0067131
  27. Bland ST, Hargrave D, Pepin JL, Amat J, Watkins LR, Maier SF (2003) Stressor controllability modulates stress-induced dopamine and serotonin efflux and morphine-induced serotonin efflux in the medial prefrontal cortex. Neuropsychopharmacology 28: 589–596. https://doi.org/10.1038/sj.npp.1300206
  28. Ceglia I, Carli M, Baviera M, Renoldi G, Calcagno E, Invernizzi RW (2004) The 5-HT2A receptor antagonist M100,907 prevents extracellular glutamate rising in response to NMDA receptor blockade in the mPFC. Neurochem J 91: 189–199. https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.2004.02704.x

Arquivos suplementares

Arquivos suplementares
Ação
1. JATS XML
Baixar
2. Fig. 1. Experimental design. (CS+) – conditioned signal; (CS-) – differentiation signal; US – unconditioned stimulus (electrocutaneous stimulation).

Baixar (116KB)
Metadados
3. Fig. 2. Horizontal motor activity, crossings (Ambulation, crossing) and the number of rearings (Rearing) in the open field test in rats before the introduction of D-serine into the MPC (Before D-Serine) and in animals without the introduction of D-serine (No Treatment). No significant differences were found, Student's t-test.

Baixar (130KB)
Metadados
4. Fig. 3. Changes in the level of extracellular serotonin in the mCBC during the development of URS (CFR Training) and differentiation 1 (Differentiation 1) in rats exposed (D-Serine + CFR Training) and not exposed (CFR Training) to the introduction of D-serine into the mCBC. The development of URS led to an increase in the level of serotonin in the mCBC (chi-square = 57.5, k = 13, p < 0.001, Friedman criterion, one-way analysis of variance). Administration of 1 mM D-serine decreased the basal serotonin level in the mCBC (F(8, 64) = 27.4, p < 0.001, F-test, one-way ANOVA) and, against this background, reduced its increase during the development of the URS (F(13, 266) = 3.8, p < 0.001, F-test, two-way ANOVA). X-axis – time, min; Y-axis – extracellular serotonin level, % of the background; scatter on the graph – error of the mean; arrows – behavioral tests; horizontal line – period of D-serine administration. * – p < 0.05 – when compared with the background (Newman–Keels test); + – p < 0.05 – for intergroup comparison (Newman–Keels test); # – p < 0.05 – for comparison with serotonin levels altered by the administration of D-serine before the test (Newman–Keels test).

Baixar (151KB)
Metadados
5. Fig. 4. (a) Duration of freezing to sound signals (CS+, CS-, s) and (b) in intersignal intervals (CS+ test, CS- test, s) during CFR Training and Differentiation 1 in rats with 1 mM D-Serine administered to the mC and in animals not subjected to the drug (No Treatment). D-serine administration reduced freezing to CS+ and in intersignal intervals during CFR Training. + – p = 0.04, t = 2.3; +++ – p < 0.001, t = 3.9 – in intergroup comparison (Student’s t-test).

Baixar (161KB)
Metadados
6. Fig. 5. Increase in horizontal locomotor activity (Ambulation, crossing lines) and rearing (a) during CFR Training (b) but not during Differentiation 1 in rats with D-Serine administration to the mCV compared to rats without D-serine administration (No Treatment). ++ – p = 0.02 (Mann–Whitney test); *** – p < 0.001, t = 4.2 (Student’s t-test) – for intergroup comparison. Other designations as in Fig. 3.

Baixar (141KB)
Metadados
7. Fig. 6. (a) Duration of freezing to sound signals (CS- or CS+, s) and (b) Duration of freezing in intersignal intervals (CS+ test, CS- test, s) during differentiation 2 (Differentiation 2) and during CFR testing in rats previously exposed (After D-Serine) and not exposed (No Treatment) to the introduction of 1 mM D-serine into the mMC. The introduction of D-serine increased freezing to CS+ (+ – p = 0.01, t = 2.7, Student's t-test) and in intersignal intervals & – p = 0.004, (Mann-Whitney test) during CFR testing. * – p < 0.05, (Student’s t-test) and # – p < 0.05 (Mann–Whitney test) – when comparing between tests.

Baixar (242KB)
Metadados
8. Fig. 7. (a) – Duration of stay, s, (b) – Horizontal motor activity (Ambulation), crossings, (c) – Standing/hanging in open (Open arms) and closed (Closed arms) arms of the plus maze in rats previously exposed (After D-Serine) and not exposed (No Treatment) to the introduction of 1 mM D-serine into the MPC. No significant differences were found, Mann-Whitney criterion.

Baixar (189KB)
Metadados
9. Fig. 8. Proposed mechanism of D-serine influence on serotonin release in mPFC and on animal behavior during URS development and testing, based on the results of this article and on the analysis of Maier [15]. mPFC – mPFC, DRN – dorsal raphe nucleus, GLU – glutamate, GABA – GABA, 5HT – serotonin, NMDAr – NMDA receptor, CFR formation – URS development, + – activation, – – inhibition. Black arrow – decrease in serotonin level in response to inescapable stress.

Baixar (107KB)
Metadados

Declaração de direitos autorais © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».