TREX-2-ORC complex of D. melanogaster participates in nuclear export of histone MRNA

封面

如何引用文章

全文:

详细

The TREX-2-ORC protein complex of D. melanogaster is necessary for the export of the bulk of synthesized poly(A)-containing mRNA molecules from the nucleus to the cytoplasm through the nuclear pores. However, the role of this complex in the export of other types of RNA remains unknown. We have shown that TREX-2-ORC participates in the nuclear export of histone mRNAs: it associates with histone mRNPs, binds to histone H3 mRNA at the 3’-terminal part of the coding region, and participates in the export of histone mRNAs from the nucleus to the cytoplasm.

全文:

Экспрессия генов состоит из нескольких этапов: синтез мРНК, формирование зрелой мРНП частицы и экспорт мРНК из ядра в цитоплазму через ядерные поры. Экспортный рецептор NXF1 рекрутируется на мРНК через адаптерные белки, которые могут связываться с мРНК во время транскрипции, сплайсинга, формирования 3’-конца, внутриядерного транспорта мРНП к ядерным порам. NXF1 образует гетеродимер с белком p15 (гетеродимер Mex67-Mtr2 в дрожжах). Гетеродимер рецептора ядерного экспорта обеспечивает транслокацию мРНК через ядерную пору, взаимодействуя с нуклеопоринами, содержащими FG-повторы.

Одним из ключевых регуляторов экспорта мРНК является белковый комплекс TREX-2. Гомологичные TREX-2 комплексы были охарактеризованы у многих эукариот, в том числе у дрожжей и у человека. TREX-2 способен связываться с мРНК, ассоциируется с ядерными порами и необходим для экспорта мРНК в различных организмах [1–7]. Комплекс TREX-2 D. melanogaster состоит из белков Xmas-2, PCID2, ENY2, Sem1p [8]. Белок Xmas-2 служит платформой для сборки комплекса, с ним взаимодействуют остальные белки. Ранее в нашей группе был очищен общий комплекс TREX-2 с белками ORC (Origin Recognition Complex) и показана роль ORC субъединиц в экспорте мРНК из ядра [9]. ORC комплекс был впервые описан у почкующихся дрожжей как комплекс, который связывается с ориджинами репликации и участвует в привлечении комплекса Mcm2–7. Впоследствии гомологичные комплексы были обнаружены и у других организмов [10]. Однако было обнаружено, что у высших эукариот ORC комплекс и его отдельные субъединицы выполняют множество различных функций, не связанных с репликацией, в частности, показано взаимодействие белков ORC c различными РНК [11]. В нашей группе было показано, что белки ORC взаимодействуют с мРНП частицами и это взаимодействие опосредовано комплексом TREX-2. Было показано, что субъединицы ORC взаимодействуют с рецептором экспорта NXF1 и необходимы для связывания NXF1 с мРНП частицей. Нокдаун компонентов ORC, так же как нокдаун компонентов TREX-2, приводит к нарушению экспорта поли(А)-содержащей РНК (мРНК) из ядра. Таким образом, было показано, что белковый комплекс TREX-2-ORC D. melanogaster привлекает экспортный рецептор NXF1 в состав мРНП частиц и является ключевым участником экспорта основной части синтезирующихся молекул мРНК [9]. В данной работе была поставлена задача исследовать участие TREX-2-ORC в экспорте неполиаденилируемых мРНК, кодируемых генами репликационно-зависимых гистонов.

мРНК репликационно-зависимых генов гистонов синтезируются в начале S фазы клеточного цикла и являются единственными мРНК эукариот, которые не подвергаются полиаденилированию [12]. В дальнейшем для краткости мы будем именовать их просто мРНК гистонов. Пре-мРНК гистонов не содержат интронов, их созревание включает в себя только кэпирование и эндонуклеолитическое расщепление 3’-конца. На 3’-конце пре-мРНК гистонов содержат шпилечную структуру и HDE-элемент, которые направляют сборку специфического аппарата процессинга [13]. Со шпилькой связывается белок SLBP (stem-loop binding protein). С HDE-последовательностью ассоциируется 5’-конец U7 мяРНК, которая образует U7 мяРНП вместе с белковым комплексом, состоящим из белков сплайсосомы Sm, в котором два белка SmD1 и SmD2 заменены на белки Lsm10 и Lsm11. У млекопитающих белок Lsm11 взаимодействует своим протяженным N-концом с N-концевой областью белка FLASH. Общая поверхность FLASH c Lsm11 привлекает на U7 мяРНП комплекс процессинга HCC (histone cleavage complex), содержащий факторы Symplekin, CPSF73, CPSF100, CPSF160, WRD33, Cst64. Расщепление пре-мРНК гистонов осуществляется эндонуклеазой CPSF73 на расстоянии 4–5 нуклеотидов от шпильки. После расщепления зрелые мРНК гистонов быстро экспортируются из ядра в цитоплазму. Несмотря на специфическое строение мРНК гистонов было показано, что они также экспортируются при помощи рецептора NXF1 [14, 15]. В данной работе мы показали, что комплекс TREX-2-ORC, ассоциирован с мРНП частицами гистонов, связывается с мРНК гистона H3 в 3’-концевой части кодирующей области и участвует в экспорте мРНК.

TREX-2-ORC комплекс ассоциирован с мРНП частицами гистонов

Была поставлена задача исследовать взаимодействие комплекса TREX-2-ORC c мРНП частицами гистонов. Ранее в очищенном общем TREX-2-ORC комплексе были найдены ORC субъединицы Orc1, Orc3, Orc4, Orc5, Orc6 [9]. Взаимодействие комплекса с мРНП гистонов было протестировано для TREX-2 субъединиц Xmas-2, PCID2, ENY2 и для ORC белков Orc3, Orc5, Orc6. Для этого был применен метод соосаждения РНП частиц антителами (RIP) из ядерного экстракта S2 клеток. Антитела к белкам – компонентам TREX-2 и ORC эффективно осаждали мРНК генов гистонов Н2А и Н3 (рис. 1, а), что указывает на взаимодействие комплекса ТREX-2-ORC с мРНП частицами данных гистонов. Аналогичные данные были получены для мРНК Н4 и Н2В. В качестве положительного контроля показано взаимодействие ТREX-2-ORC с поли(A)-содержащей мРНК β-тубулина, которое было продемонстрировано ранее [9].

Далее взаимодействие было подтверждено с помощью альтернативного подхода: мРНП частицы, содержащие транскрипт гена H3, выделяли из ядерного экстракта S2 клеток при помощи биотинилированного антисмыслового РНК-зонда к мРНК гистона H3 (рис. 1, б). Антисмысловой РНК-зонд специфически ассоциируется с соответствующей эндогенной РНК в экстракте, осаждая РНП частицу. Связавшие с РНК-зондом мРНП частицы осаждали из экстракта при помощи стрептавидин-агарозы, белки мРНП анализировали при помощи Вестерн-блот анализа с антителами к компонентам TREX-2 и ORC. В качестве отрицательного контроля проводили осаждение с антисмысловой последовательностью к РНК белка YFP (K-). Субъединицы комплексов TREX-2 и ORC, белки Xmas-2, PCID2, ENY2, Orc3, Orc6, а также факторы процессинга CPSF73, CPSF100 соосаждались с H3 мРНП, но отсутствовали в отрицательном контроле. Таким образом, комплекс TREX-2-ORC способен ассоциироваться с мРНП частицами гистонов.

 

Рис.1. TREX-2-ORC ассоциирован с мРНК гистонов. (а) Результаты иммуноосаждения мРНП частиц генов H2A, H3 и β-tubulin антителами к субъединицам TREX-2-ORC, в качестве отрицательного контроля использованы IgG. Результаты представлены в процентах от исходного материала. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, для сравнения контроля и эксперимента использовался t-критерий Стьюдента. (*) указывает на статистическую значимость с p-value <0.05, (**) указывает на статистическую значимость с p-value < 0.01. (б) Вестерн-блот анализ сосаждения H3 мРНП частиц с биотинилированным антисмысловым РНК-зондом к мРНК гистона H3 с использованием антител к Xmas-2, PCID2, ENY2, Orc3, Orc6, CPSF100, CPSF73. В отрицательном контроле (K-) использован РНК-зонд с антисмысловой последовательностью к РНК белка YFP. (в) Вестерн-блот анализ соосаждения белков с биотинилированными смысловыми РНК-зондами к последовательностям мРНК гистона H3: полноразмерной (H3), CDS1, CDS2, 3’UTR, с использованием антител к Xmas-2, PCID2, ENY2, Orc3, Orc6, CPSF100, CPSF73. В отрицательном контроле (K-) использован РНК-зонд с антисмысловой последовательностью к РНК YFP.

 

TREX-2-ORC ассоциируется с мРНК H3 в 3’-концевой части кодирующей области

С целью локализовать участок мРНК H3, с которым ассоциируется TREX-2-ORC, биотинилированные смысловые РНК-зонды, соответствующие различным участкам последовательности РНК H3 инкубировали с ядерном экстрактом S2 клеток и далее определяли связавшиеся с РНК-зондами белки. Зонды соответствовали полноразмерному (H3), N- и С-концевым участкам кодирующей области длиной 411 нт (CDS1: 1–204 нт и CDS2: 204–411 нт, соответственно) и 3’-нетранслируемой области пре-мРНК H3 (3’UTR: 412–595 нт) (рис. 1в). Белки Xmas-2, PCID2, Orc3 и Orc6 преимущественно ассоциировались с CDS2 последовательностью. Использованные в качестве контрольных факторы процессинга CPSF73, CPSF100 ассоциировались с 3’UTR зондом, в котором содержатся шпилечная структура и HDE-элемент, направляющие сборку аппарата процессинга, что подтверждает специфичность выявленных взаимодействий. ENY2 соосаждался как с CDS2, так и с 3’UTR РНК-зондом, что можно объяснить свойством ENY2 привлекаться в различные белковые комплексы. Белки не взаимодействовали с контрольным РНК-зондом. Таким образом, белки TREX-2-ORC комплекса ассоциируются с кодирующей последовательностью РНК гистона Н3 в 3’-концевой части кодирующей области.

TREX-2-ORC участвует в экспорте мРНК гистонов

Затем мы исследовали участие TREX-2-ORC в экспорте мРНК гистонов из ядра в цитоплазму. Белок Xmas-2 является платформой, с которой ассоциированы остальные белки TREX-2-ORC комплекса: PCID2 ассоциирован с областью Xmas-2 вблизи GANP-домена, EYN2 – c CID-доменом Xmas-2, из всех ORC субъединиц комплекса Orc3 сильнее всего связывается Xmas-2, взаимодействуя вместе с ENY2 с С-концом Xmas-2 [16, 17].

Поэтому с целью снизить уровень TREX-2-ORC комплекса был проведен нокдаун Xmas-2 в S2 клетках методом РНК-интерференции. При нокдауне Xmas-2 уровень экспрессии белка значительно снижался, при этом уровни экспрессии субъединиц PCID2, ENY2, Orc3, Orc6 заметно не изменялись (рис. 2, а). Методом RIP-анализа было исследовано, нарушает ли нокдаун Xmas-2 взаимодействие TREX-2-ORC с мРНП гистонов. Нокдаун Xmas-2 приводил к уменьшению количества ассоциированных с мРНК гистонов как Xmas-2, так и белков PCID2, ENY2, Orc3, Orc6, то есть к уменьшению связывания TREX-2-ORC с мРНП частицами гистонов. Результаты приведены для H3 мРНК (рис. 2, б).

 

Рис. 2. Эффект нокдауна субъединиц TREX-2-ORC на экспорт мРНК гистонов. (а) Вестер-блот анализ уровней экспрессии белков при РНК-интереференциях Xmas-2, Orc3 в S2 клетках при помощи соответствующих антител. В качестве выравнивающего контроля использовано окрашивание антителами к ламину Dm0. (б) Результаты иммуноосаждения мРНП частиц гистонов при РНК-интереференции Xmas-2 c антителами к субъединицам TREX-2- ORC, в качестве отрицательного контроля использованы IgG. Результаты представлены в процентах от исходного материала. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, для сравнения контроля и эксперимента использовался t-критерий Стьюдента. (*) указывает на статистическую значимость c p-value < 0.05, (**) указывает на статистическую значимость c p-value<0.01. (в) Вестерн-блот анализ РНК-интереференций Xmas-2, Orc3, NXF1 с использованием антител к одноименным белкам. В качестве выравнивающего контроля использовано окрашивание антителами к ламину Dm0. (г) FISH-гибридизация с антисмысловой РНК-пробой к H3 мРНК при РНК-интереференциях (РНКи) Xmas-2, Orc3, NXF1 в S2 клетках. В качестве отрицательного контроля (Контроль) проведена РНК-интерференция c дцРНК белка GFP. (д) Доля S2-клеток с нарушениями экспорта H3 мРНК при нокдаунах Xmas-2, Orc3, NXF1 или GFP (Контроль).

 

Далее было исследовано, как влияет нарушение взаимодействия мРНК гистона Н3 с TREX-2-ORC комплексом на ее экспорт из ядра в цитоплазму. Для этого был проведен анализ распределения мРНК Н3 в клетках S2 при нокдауне ключевых для взаимодействия комплекса с NXF1 и мРНП частицей субъединиц Xmas-2 и Orc3 методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с DIG-меченой антисмысловой РНК-пробой к кодирующей последовательности гена H3 (рис. 2, г, 2, д). Так как мРНК гистонов синтезируется в S фазе и подвергается деградации после окончания S фазы, FISH-сигнал мРНК детектировался только в части клеток. В контрольном эксперименте FISH-сигнал H3 мРНК детектировался в основном в цитоплазме клеток. Нокдаун NXF1 приводил к задерживанию H3 мРНК в ядре, как и было показано в литературе [15]. Нокдаун Xmas-2 и нокдаун Orc3 также приводили к нарушениям экспорта мРНК в некоторой части клеток с H3 FISH-сигналом (около 20–30 %): накоплению РНК в ядре или равномерному распределению между ядром и цитоплазмой. (рис. 2г, 2д). Таким образом, снижение количества TREX-2-ORC, связанного с мРНП частицами гистонов, приводит к нарушению ядерного экспорта их мРНК. То, что нарушение экспорта наблюдается только в части клеток можно объяснить тем, что в привлечении NXF1 на мРНК гистонов кроме комплекса TREX-2-ORC участвуют и другие адаптеры: SR-белки 9G8 и SRp20 [18] и белок ALYREF [19].

Ранее мы показали, что TREX-2-ORC комплекс ассоциируется с основным рецептором экспорта NXF1 и служит адаптером для связывания NXF1 с поли-А-содержащими мРНК генов [9]. мРНК гистонов экспортируются при помощи NXF1 [15]. Мы показали, что TREX-2-ORC комплекс входит в состав мРНП и связывается с неполиаденилируемыми мРНК гистонов. То, что нокдаун комплексообразующих субъединиц TREX-2-ORC приводит к нарушению связывания комплекса с мРНК гистонов и нарушению их экспорта в некоторой части S2 клеток, позволяет предположить, что TREX-2-ORC также служит одним из адаптеров для NXF1-зависимого экспорта неполиаденилируемых мРНК гистонов, возможно, участвуя в экспорте на определенном этапе регуляции экспрессии в ходе клеточного цикла.

Ранее было обнаружено несколько адаптеров, через взаимодействие с которыми экспортный рецептор NXF1 привлекается на мРНК гистонов. В клетках млекопитающих и ооцитах лягушки было показано, что SR-белки 9G8 и SRp20 связываются со специфическим транспортным цис-элементом в кодирующей области H2A мыши [18]. В клетках человека основной экспортный адаптер ALYREF связывается с гистоновой мРНК в области, расположенной с 5’-конца от места расщепления, с пиком в области 50 нт[19]. По нашим данным TREX-2-ORC также преимущественно связывается с мРНК гистонов в 3’-концевой части кодирующей области. Но в то время, как связывание ALYREF с мРНК гистонов происходит котранскрипционно и ассоциировано с посадкой аппарата процессинга [19], TREX-2-ORC может привлекаться в мРНП гистонов не в ходе транскрипции, а на более позднем этапе экспортного пути мРНП частиц в ядре от сайтов транскрипции до ядерных пор. На это указывают данные о том, что нокдаун компонентов TREX-2 не влияет на процессинг поли(А)-содержащих модельных мРНК [20].

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа была выполнена при поддержке гранта РНФ № 22-24-00721.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Конфликт интересов отсутствует.

×

作者简介

M. Kurshakova

Engelhardt Institute of Molecular Biology RAS

编辑信件的主要联系方式.
Email: kursha@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow

Y. Yakusheva

Engelhardt Institute of Molecular Biology RAS

Email: kursha@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow

S. Georgieva

Engelhardt Institute of Molecular Biology RAS

Email: kursha@mail.ru

Academician of the RAS

俄罗斯联邦, Moscow

参考

  1. Fischer T., Strasser K., Racz A., et al. // The EMBO journal. 2002. V. 21. № 21. P. 5843–5852.
  2. Rodríguez-Navarro S., Fischer T., Luo M. J., et al. // Cell. 2004. V. 116. № 1. P. 75–86.
  3. Jani D., Lutz S., Hurt E., et al. // Nucleic acids research. 2012. V. 40. № 10. P. 4562–4573.
  4. Jani D., Lutz S., Marshall N. J., et al. // Molecular cell. 2009. V. 33. № 6. P. 727–737.
  5. Ellisdon A. M., Dimitrova L., Hurt E. and Stewart M. // Nature structural & molecular biology. 2012. V. 19. № 3. P. 328–336.
  6. Dimitrova L., Valkov E., Aibara S., et al. // Structure. 2015. V. 23. № 7. P. 1246–1257.
  7. Jani D., Valkov E., Stewart M. // Nucleic acids research. 2014. V. 42. № 10. P. 6686–6697.
  8. Kurshakova M. M., Krasnov A. N., Kopytova D. V., et al. // The EMBO journal. 2007. V. 26. № 24. P. 4956–4965.
  9. Kopytova D., Popova Vol., Kurshakova M., et al. // Nucleic acids research. 2016. V. 44. № 10. P. 4920–4933.
  10. Bleichert F. // Current opinions in structural biology. 2019. V. 59. P. 195–204.
  11. Popova Vol., Brechalov A. // Nonreplicative functions of the origin recognition complex. 2018. V. 9. P. 460–473.
  12. Duronio R. J., Marzluff W. F. // RNA biology. 2017. V. 14. № 6. P. 726–738.
  13. Sun Y., Zhang Y., Aik W. S., et al. // Science. 2020b. V. 367. P. 700–703.
  14. Huang Y., Gattoni R., Stevenin J. and Steitz J. A. // Molecular Cell. 2003. V. 11. P. 837–843.
  15. Erkmann J. A., Sanchez R., Treichel N., et al. // RNA. 2005. V. 11. P. 45–58.
  16. Popova Vol.V., Georgieva S. G., Kopytova D. V. // Biochemistry and molecular biology journal. 2016. V. 2. P. 2–14.
  17. Куршакова М. М., Копытова Д. В., Георгиева С. Г. // Доклады АН. 2021. Т. 496. С. 66–69.
  18. Huang Y., Steitz J. A. // Molecular Cell. 2001. V. 7. P. 899–905.
  19. Fan J., Wang K., Du X., et al. // The EMBO Journal. 2019.
  20. Kopytova D. V., Orlova A. V., Krasnov A. N., et al. // Genes and Development. 2009. V. 24. P. 86–96.

补充文件

附件文件
动作
1. JATS XML
下载
2. Fig.1. TREX-2-ORC is associated with histone mRNA. (a) The results of immunosuppression of mRNP particles of the H2A, H3 and β-tubulin genes with antibodies to TREX-2-ORC subunits, IgG was used as a negative control. The results are presented as a percentage of the source material. All data are presented as an average ± standard deviation, and the Student's t-test was used to compare the control and the experiment. (*) indicates statistical significance with p-value <0.05, (**) indicates statistical significance with p-value < 0.01. (b) Western blot analysis of the deposition of H3 mRNP particles with a biotinylated antisense RNA probe to histone H3 mRNA using antibodies to Xmas-2, PCID2, ENY2, Orc3, Orc6, CPSF100, CPSF73. In the negative control (K-), an RNA probe with an antisense sequence to the RNA of the YFP protein was used. (c) Western blot analysis of the co-deposition of proteins with biotinylated semantic RNA probes to histone H3 mRNA sequences: full-length (H3), CDS1, CDS2, 3'UTR, using

下载 (469KB)
索引源数据
3. Fig. 2. The knockdown effect of TREX-2-ORC subunits on histone mRNA export. (a) Western blot analysis of protein expression levels in Xmas-2, Orc3 RNA interferences in S2 cells using appropriate antibodies. Staining with antibodies to lamin Dm0 was used as an equalizing control. (b) The results of the mRNA deposition of histone particles during Xmas-2 RNA interference with antibodies to TREX-2- ORC subunits were used, IgG was used as a negative control. The results are presented as a percentage of the source material. All data are presented as an average ± standard deviation, and the Student's t-test was used to compare control and experiment. (*) indicates the statistical significance of c p-value < 0.05, (**) indicates the statistical significance of c p-value<0.01. (c) Western blot analysis of RNA interferences Xmas-2, Orc3, NXF1 using antibodies to the same proteins. Staining with antibodies to lamin Dm0 was used as a leveling control. (d) FISH hybrid

下载 (683KB)
索引源数据

版权所有 © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».