Разработка и апробация количественной ПЦР-системы для изучения экспрессии эндосомальных рецепторов и цитозольных сенсоров нуклеиновых кислот у мышей

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Обоснование. Врожденный иммунный ответ играет важнейшую роль в защите организма от вирусных патогенов, и важная его часть — паттерн-распознающие рецепторы, такие как толл- и RIG-I-подобные. Известно, что инвазия вирусов, в том числе вируса гриппа, приводит к активации внутриклеточных паттерн-распознающих рецепторов, таких как TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме, эндосомах и лизосомах, а также MDA5 и RIG-I — цитозольных сенсоров вирусной РНК, не связанных с мембранами клетки. Экспрессия этих генов, адекватное их функционирование и регуляция имеет колоссальное значение для обеспечения адекватного иммунного ответа и формирования противовирусной защиты.

Цель — разработка и апробация количественной ПЦР-системы для оценки экспрессии генов TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, MDA5, RIGI в тканях и органах мыши.

Материалы и методы. Изучение уровней экспрессии генов проводили методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, используя разработанные панели праймеров и флуоресцентных зондов. Для апробации были выбраны самки инбредной линии мышей-альбиносов BALB/c в возрасте 8–10 нед., зараженные вирусом гриппа А/PR8/34 (H1N1).

Результаты. В ходе исследования была разработана тест-система на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции для оценки экспрессии генов эндосомальных рецепторов TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, а также цитозольных сенсоров MDA5 и RIG-I, эффективность амплификации которых составила 99 (TLR3), 106 (TLR7) и по 107% для остальных генов. Данная тест-система была применена для исследования уровней экспрессии TLRs и RLRs в тканях легких и селезенок мышей линии BALB/c при заражении вирусом гриппа А/PR8/34 (H1N1). Согласно полученным результатам, через 24 ч после инфицирования было показано достоверное изменение уровней мРНК TLR3, TLR7, TLR8, TLR9 и MDA5 в легких, но не в селезенках зараженных животных.

Заключение. Разработанная тест-система может быть применена для анализа экспрессии некоторых внутриклеточных PRRs, что открывает возможности для более глубокого изучения патофизиологических механизмов развития иммунного ответа.

Об авторах

Вероника Андреевна Олейник

Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева; Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)

Email: working.lyutik@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3987-8817

лаборант-исследователь лаборатории гриппозных вакцин; студент

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Марина Александровна Плотникова

Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева

Email: biomalinka@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8196-3156
SPIN-код: 2986-9850

канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории векторных вакцин

Россия, Санкт-Петербург

Никита Дмитриевич Ёлшин

Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева

Email: nikita.yolshin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1050-5817
SPIN-код: 1878-0020

научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии

Россия, Санкт-Петербург

Екатерина Андреевна Романовская-Романько

Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева

Email: romromka@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7560-398X
SPIN-код: 1012-8043

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории векторных вакцин

Россия, Санкт-Петербург

Сергей Анатольевич Клотченко

Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева

Автор, ответственный за переписку.
Email: fosfatik@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0289-6560
SPIN-код: 2632-6195

канд. биол. наук, заведующий лабораторией гриппозных вакцин

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Sellge G., Kufer T.A. PRR-signaling pathways: learning from microbial tactics // Semin Immunol. 2015. Vol. 27, N 2. P. 75–84. doi: 10.1016/j.smim.2015.03.009
  2. Kouwaki, T., Nishimura, T., Wang, G., & Oshiumi, H. RIG-I-like receptor-mediated recognition of viral genomic RNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 and viral escape from the host innate immune responses // Frontiers in immunology. 2021. Vol. 12, P. 700926. doi: 10.3389/fimmu.2021.700926
  3. Hayden M.S., Ghosh S. NF-κB in immunobiology // Cell Res. 2011. Vol. 21, N 2. P. 223–244. doi: 10.1038/cr.2011.13
  4. Kayesh M.E.H., Kohara M., Tsukiyama-Kohara K. Recent insights into the molecular mechanisms of the toll-like receptor response to influenza virus infection // Int J Mol Sci. 2024. Vol. 25, N 11. P. 5909. doi: 10.3390/ijms25115909
  5. Kawai T., Akira S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors // Nat Immunol. 2010. Vol. 11, N 5. P. 373–384. doi: 10.1038/ni.1863
  6. Zarember K.A., Godowski P.J. Tissue expression of human Toll-like receptors and differential regulation of Toll-like receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes, their products, and cytokines // J Immunol. 2002. Vol. 168, N 2. P. 554–561. doi: 10.4049/jimmunol.168.2.554
  7. Masek T., Vopalensky V., Suchomelova P., Pospisek M. Denaturing RNA electrophoresis in TAE agarose gels // Anal Biochem. 2005. Vol. 336, N 1. P. 46–50. doi: 10.1016/j.ab.2004.09.010
  8. Nolan T., Hands R.E., Bustin S.A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR // Nat Protoc. 2006. Vol. 1, N 3. P. 1559–1582. doi: 10.1038/nprot.2006.236
  9. Mosley Y.Y.C., HogenEsch H. Selection of a suitable reference gene for quantitative gene expression in mouse lymph nodes after vaccination // BMC Res notes. 2017. Vol. 10. P. 1–7. doi: 10.1186/s13104-017-3005-y
  10. Influenza (Seasonal) [Электронный ресурс] // WHO. 2023 Oct 3. Режим доступа: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/influenza-(seasonal). Дата обращения: 12.03.2025.
  11. Thompson W.W., Shay D.K., Weintraub E., et al. Mortality associated with influenza and respiratory syncytial virus in the United States // JAMA. 2003. Vol. 289, N 2. P. 179–186. doi: 10.1001/jama.289.2.179
  12. Giri A., Sundar I.K. Evaluation of stable reference genes for qPCR normalization in circadian studies related to lung inflammation and injury in mouse model // Sci Rep. 2022. Vol. 12, N 1. P. 1764. doi: 10.1038/s41598-022-05836-1
  13. Wang J.P., Bowen G.N., Padden C., et al. Toll-like receptor–mediated activation of neutrophils by influenza A virus // Blood. 2008. Vol. 112, N 5. P. 2028–2034. doi: 10.1182/blood-2008-01-132860
  14. Koyama S., Ishii K.J., Kumar H., еt al. Differential role of TLR-and RLR-signaling in the immune responses to influenza A virus infection and vaccination // J Immunol. 2007. Vol. 179, N 7. P. 4711–4720. doi: 10.4049/jimmunol.179.7.4711
  15. Hornung V., Barchet W., Schlee M., Hartmann G. RNA recognition via TLR7 and TLR8 // Handb Exp Pharmacol. 2008. Vol. 183. P. 71–86. doi: 10.1007/978-3-540-72167-3_4
  16. Koh Y.T., Scatizzi J.C., Gahan J.D., et al. Role of nucleic acid–sensing tlrs in diverse autoantibody specificities and anti-nuclear antibody–producing B cells // J Immunol. 2013. Vol. 190, N 10. P. 4982–4990. doi: 10.4049/jimmunol.1202986
  17. Goffic R.L., Balloy V., Lagranderie M., et al. Detrimental contribution of the Toll-like receptor (TLR) 3 to influenza A virus-induced acute pneumonia // PLoS Pathog. 2006. Vol. 2, N 6. P. e53. doi: 10.1371/journal.ppat.0020053
  18. Majde J.A., Kapás L., Bohnet S.G., et al. Attenuation of the influenza virus sickness behavior in mice deficient in Toll-like receptor 3 // Brain Behav Immun. 2010. Vol. 24, N 2. P. 306–315. doi: 10.1016/j.bbi.2009.10.011
  19. Bhargavan B., Woollard S.M., Kanmogne G.D. Toll-like receptor-3 mediates HIV-1 transactivation via NFκB and JNK pathways and histone acetylation, but prolonged activation suppresses Tat and HIV-1 replication // Cell Signal. 2016. Vol. 28, N 2. P. 7–22. doi: 10.1016/j.cellsig.2015.11.005
  20. Xie J., Zhang S., Hu Y., et al. Regulatory roles of c-jun in H5N1 influenza virus replication and host inflammation // Biochim Biophys Acta. 2014. Vol. 1842, N 12 Pt A. P. 2479–2488. doi: 10.1016/j.bbadis.2014.04.017
  21. Meng D., Huo C., Wang M., et al. Influenza a viruses replicate productively in mouse mastocytoma cells (P815) and trigger pro-inflammatory cytokine and chemokine production through TLR3 signaling pathway // Front Microbiol. 2017. Vol. 7. P. 2130. doi: 10.3389/fmicb.2016.02130
  22. Zhang X., Li Z., Peng Q., et al. Epstein-Barr virus suppresses N6-methyladenosine modification of TLR9 to promote immune evasion // J Biol Chem. 2024. Vol. 300, N 5. P. 107226. doi: 10.1016/j.jbc.2024.107226

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Корреляционная зависимость, отражающая статистическую взаимосвязь пороговых циклов ПЦР (Ct) для всех нормировочных генов.

Скачать (238KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Эффективность ПЦР в мультиплексном формате, стандартные калибровочные кривые: a — для генов TLR3 и Rplp0; b — для генов TLR7 и Rplp0; c — для генов TLR8 и Rplp0; d — для генов TLR9 и GAPDH; e — для генов MDA5 и Hprt; f — для генов RIGI и Ubc.

Скачать (448KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Относительная экспрессия генов TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, MDA5 и RIGI в легких мышей через 24 ч после интраназального инфицирования вирусом гриппа А/PR8/34 (H1N1); группа интактных животных (K) показана белыми столбиками. Достоверность различий в уровнях экспрессии в опытной группе (ВГА) по сравнению с контрольной (K) определяли с использованием непарного t-критерия Стьюдента: * p < 0,05; *** p < 0,001; **** p < 0,0001, ns — различия не значимы.

Скачать (106KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Относительная экспрессия генов TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, MDA5 и RIGI в селезенках мышей через 24 ч после интраназального инфицирования вирусом гриппа А/PR8/34 (H1N1); группа интактных животных (K) показана белыми столбиками. Достоверность различий в уровнях экспрессии в опытной группе (ВГА) по сравнению с контрольной (K) определяли с использованием непарного t-критерия Стьюдента. Статистически достоверных различий при сравнении опытной и контрольной группы не выявлено.

Скачать (100KB)
Метаданные

© Эко-Вектор, 2025

Ссылка на описание лицензии: https://eco-vector.com/for_authors.php#07

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».