Development and approbation of a quantitative PCR system for studying the expression of endosomal receptors and cytosolic nucleic acid sensors in mice

Cover Page

Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription Access

Abstract

BACKGROUND: The innate immune response plays a crucial role in protecting the organism against viral pathogens, important part of which are pattern recognition receptors, such as Toll-like and RIG-I-like receptors. It is known that viral invasion, including influenza virus infection, leads to the activation of intracellular pattern recognition receptors such as TLR3, TLR7, TLR8, and TLR9, which are localized in the endoplasmic reticulum, endosomes, and lysosomes, as well as MDA5 and RIG-I, which are cytosolic sensors of viral RNA not associated with cell membranes. The expression of these genes, their proper functioning, and regulation are of critical importance for ensuring an adequate immune response and the establishment of antiviral protection.

AIM: The aim of this study is to develop and validate a quantitative PCR system for assessing the expression of TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, MDA5, and RIGI genes in mouse tissues and organs.

METHODS: Gene expression levels were analyzed using reverse transcription polymerase chain reaction with specially developed panels of primers and fluorescent probes. For approbation were selected female inbred BALB/c albino mice aged 8–10 weeks, infected with influenza A/PR8/34 (H1N1) virus.

RESULTS: In this study, a test system based on multiplex polymerase chain reaction was developed for assessing the expression of endosomal receptor genes TLR3, TLR7, TLR8, and TLR9, as well as cytosolic sensors MDA5 and RIG-I. The amplification efficiency was 99 for TLR3, 106 for TLR7, and 107% for the remaining genes. This test system was used to study the expression levels of TLRs and RLRs in the lung and spleen tissues of BALB/c mice infected with influenza A/PR8/34 (H1N1) virus. According to the obtained results, 24 hours post-infection, a significant change in mRNA levels of TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, and MDA5 was observed in the lungs but not in the spleens of infected animals.

CONCLUSION: The developed test system can be used for analyzing the expression of certain intracellular PRRs, providing opportunities for a deeper investigation of the pathophysiological mechanisms underlying the immune response.

About the authors

Veronica A. Oleynik

Smorodintsev Research Institute of Influenza; Saint Petersburg State Institute of Technology (Technical University)

Email: working.lyutik@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3987-8817

Research Laboratory Assistant at the Laboratory of Influenza Vaccines; Student

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Marina A. Plotnikova

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Email: biomalinka@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8196-3156
SPIN-code: 2986-9850

Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher at the Laboratory of Vector Vaccines

Russian Federation, Saint Petersburg

Nikita D. Yolshin

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Email: nikita.yolshin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1050-5817
SPIN-code: 1878-0020

Researcher at the Laboratory of Molecular Virology

Russian Federation, Saint Petersburg

Ekaterina A. Romanovskaya-Romanko

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Email: romromka@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7560-398X
SPIN-code: 1012-8043

Cand. Sci. (Biology), Leading Researcher at the Laboratory of Vector Vaccines

Russian Federation, Saint Petersburg

Sergey A. Klotchenko

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Author for correspondence.
Email: fosfatik@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0289-6560
SPIN-code: 2632-6195

Cand. Sci. (Biology), Head of the Laboratory of Influenza Vaccines

Russian Federation, Saint Petersburg

References

  1. Sellge G, Kufer TA. PRR-signaling pathways: learning from microbial tactics. Semin Immunol. 2015;27(2):75–84. doi: 10.1016/j.smim.2015.03.009
  2. Kouwaki, T., Nishimura, T., Wang, G., & Oshiumi, H. RIG-I-like receptor-mediated recognition of viral genomic RNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 and viral escape from the host innate immune responses // Frontiers in immunology. 2021. Vol. 12, P. 700926. doi: 10.3389/fimmu.2021.700926
  3. Hayden MS, Ghosh S. NF-κB in immunobiology. Cell Res. 2011;21(2):223–244. doi: 10.1038/cr.2011.13
  4. Kayesh MEH, Kohara M, Tsukiyama-Kohara K. Recent insights into the molecular mechanisms of the toll-like receptor response to influenza virus infection. Int J Mol Sci. 2024;25(11):5909. doi: 10.3390/ijms25115909
  5. Kawai T, Akira S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors. Nat Immunol. 2010;11(5):373–384. doi: 10.1038/ni.1863
  6. Zarember KA, Godowski PJ. Tissue expression of human Toll-like receptors and differential regulation of Toll-like receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes, their products, and cytokines. J Immunol. 2002;168(2):554–561. doi: 10.4049/jimmunol.168.2.554
  7. Masek T, Vopalensky V, Suchomelova P, Pospisek M. Denaturing RNA electrophoresis in TAE agarose gels. Anal Biochem. 2005;336(1):46–50. doi: 10.1016/j.ab.2004.09.010
  8. Nolan T, Hands RE, Bustin SA. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 2006;1(3):1559–1582. doi: 10.1038/nprot.2006.236
  9. Mosley YYC, HogenEsch H. Selection of a suitable reference gene for quantitative gene expression in mouse lymph nodes after vaccination. BMC Res notes. 2017;10:1–7. doi: 10.1186/s13104-017-3005-y
  10. Influenza (Seasonal) [Internet]. WHO. 2023 Oct 3. Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/influenza-(seasonal). Accessed: 12 March 2025.
  11. Thompson WW, Shay DK, Weintraub E, et al. Mortality associated with influenza and respiratory syncytial virus in the United States. JAMA. 2003;289(2):179–186. doi: 10.1001/jama.289.2.179
  12. Giri A, Sundar IK. Evaluation of stable reference genes for qPCR normalization in circadian studies related to lung inflammation and injury in mouse model. Sci Rep. 2022;12(1):1764. doi: 10.1038/s41598-022-05836-1
  13. Wang JP, Bowen GN, Padden C, et al. Toll-like receptor–mediated activation of neutrophils by influenza A virus. Blood. 2008;112(5):2028–2034. doi: 10.1182/blood-2008-01-132860
  14. Koyama S, Ishii KJ, Kumar H, еt al. Differential role of TLR-and RLR-signaling in the immune responses to influenza A virus infection and vaccination. J Immunol. 2007;179(7):4711–4720. doi: 10.4049/jimmunol.179.7.4711
  15. Hornung V, Barchet W, Schlee M, Hartmann G. RNA recognition via TLR7 and TLR8. Handb Exp Pharmacol. 2008;183:71–86. doi: 10.1007/978-3-540-72167-3_4
  16. Koh YT, Scatizzi JC, Gahan JD, et al. Role of nucleic acid–sensing tlrs in diverse autoantibody specificities and anti-nuclear antibody–producing B cells. J Immunol. 2013;190(10):4982–4990. doi: 10.4049/jimmunol.1202986
  17. Goffic RL, Balloy V, Lagranderie M, et al. Detrimental contribution of the Toll-like receptor (TLR) 3 to influenza A virus– induced acute pneumonia. PLoS Pathog. 2006;2(6):e53. doi: 10.1371/journal.ppat.0020053
  18. Majde JA, Kapás L, Bohnet SG, et al. Attenuation of the influenza virus sickness behavior in mice deficient in Toll-like receptor 3. Brain Behav Immun. 2010;24(2):306–315. doi: 10.1016/j.bbi.2009.10.011
  19. Bhargavan B, Woollard SM, Kanmogne GD. Toll-like receptor-3 mediates HIV-1 transactivation via NFκB and JNK pathways and histone acetylation, but prolonged activation suppresses Tat and HIV-1 replication. Cell Signal. 2016;28(2):7–22. doi: 10.1016/j.cellsig.2015.11.005
  20. Xie J, Zhang S, Hu Y, et al. Regulatory roles of c-jun in H5N1 influenza virus replication and host inflammation. Biochim Biophys Acta. 2014;1842(12 Pt A):2479–2488. doi: 10.1016/j.bbadis.2014.04.017
  21. Meng D, Huo C, Wang M, et al. Influenza a viruses replicate productively in mouse mastocytoma cells (P815) and trigger pro-inflammatory cytokine and chemokine production through TLR3 signaling pathway. Front Microbiol. 2017;7:2130. doi: 10.3389/fmicb.2016.02130
  22. Zhang X, Li Z, Peng Q, et al. Epstein-Barr virus suppresses N6-methyladenosine modification of TLR9 to promote immune evasion. J Biol Chem. 2024;300(5):107226. doi: 10.1016/j.jbc.2024.107226

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Correlation dependence reflecting the statistical relationship of PCR threshold cycles (Ct) for all reference genes.

Download (238KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. PCR efficiency in a multiplex format, standard calibration curves: a, for TLR3 and Rplp0 genes; b, for TLR7 and Rplp0 genes; c, for TLR8 and Rplp0 genes; d, for TLR9 and GAPDH genes; e, for MDA5 and Hprt genes; f, for RIGI and Ubc genes.

Download (448KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Relative expression of TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, MDA5, and RIGI genes in mouse lungs 24 h after intranasal infection with influenza A/PR8/34 (H1N1) virus; the group of intact animals (K) is shown with white bars. The significance of differences in expression levels in the experimental group (ВГА, IAV, influenza A virus) compared to the control group (K) was determined using an unpaired Student’s t-test: * p < 0.05; *** p < 0.001; **** p < 0.0001, ns, not significant.

Download (106KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Relative expression of TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, MDA5, and RIGI genes in mouse spleens 24 h after intranasal infection with influenza A/PR8/34 (H1N1) virus; the group of intact animals (K) is shown with white bars. The significance of differences in expression levels in the experimental group (ВГА, IAV, influenza A virus) compared to the control group (K) was determined using an unpaired Student’s t-test. No statistically significant differences were observed between the experimental and control groups.

Download (100KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2025 Eco-Vector

License URL: https://eco-vector.com/for_authors.php#07

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».