N6-(5-фенилпентан-1-ил)аденин – новый неконкурентный рецепторспецифичный антицитокинин

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Впервые был получен N6-(5-фенилпентан-1-ил)аденин – синтетическое производное аденина с рецепторспецифичным антицитокининовым действием. Данное соединение проявляет выраженный антицитокининовый эффект, снижая цитокинин-индуцированную экспрессию репортерного гена GUS, при взаимодействии с цитокининовым рецептором CRE1/AHK4 модельного растения Arabidopsis thaliana. Гораздо слабее данный эффект проявляется с родственным рецептором AHK2 и не проявляет вовсе с рецептором AHK3. Мы показали, что N6-(5-фенилпентан-1-ил)аденин не связывается с лиганд-связывающими сайтами рецепторов цитокининов арабидопсиса, что не позволяет отнести его к истинным цитокининовым антагонистам. Несмотря на пока неизученный механизм действия, данное соединение может найти своё применение в качестве компонента растительного регулятора роста. Как и истинные антицитокинины, оно усиливает рост корней проростков арабидопсиса, по-видимому, подавляя действие эндогенных цитокининов на «корневой» рецептор CRE1/AHK4.

Полный текст

Цитокинины – группа классических фитогормонов. Цитокининовая сигнальная система обнаружена практически у всех видов растений, в том числе у эволюционно древних [1]. Показано, что цитокинины влияют на множество процессов на протяжении всех этапов онтогенеза растений [2, 3]. Возможность управления этой системой открывает широкие перспективы для развития сельского хозяйства. Цитокинины положительно влияют на скорость роста побега, стимулируют развитие хлоропластов, задерживают старение листьев, повышают устойчивость растений к повреждающим факторам внешней среды [4]. Однако основной сложностью на пути масштабного использования цитокининов в растениеводстве является их негативное действие на рост корня [5].

Локальные манипуляции с цитокининовым сигналингом, не связанные с генетическими модификациями растений, возможны за счёт использования растительных стимуляторов и регуляторов роста. В состав таких препаратов могут быть включены рецепторспецифичные антицитокинины, способные действовать орган- и тканеспецифично.

Рецепторы – ключевые белки, определяющие силу и направленность сигналинга гормонов, в том числе цитокининов. В растении рецепторы существуют в виде семейства белков, члены которого обладают разной лигандной специфичностью и разной преимущественной локализацией в органах и тканях [6]. Селективное подавление работы «корневых» цитокининовых рецепторов (CRE1/AHK4 у арабидопсиса [7]) с помощью антицитокининов способно стимулировать рост корней [8], потенциально не влияя на стимулирующую активность цитокининов в наземных частях растений.

В немногочисленных публикациях, сообщающих об обнаружении соединений с антицитокининовым эффектом, были описаны либо основания-антагонисты [8, 9], либо соединения более сложного строения, не имеющие высокого сродства к лиганд-связывающему сайту цитокининовых рецепторов [10–12]. В данной работе нами получен N6-(5-фенилпентан-1-ил)аденин – новое N6-замещенное производное аденина с антицитокининовым действием по отношению к рецептору CRE1/АНК4. Данное соединение является структурным аналогом природного цитокинина N6-бензиладенина (БА) и характеризуется наличием гидрофобного заместителя, содержащего длинный пятичленный алифатический линкер, соединяющий фенильный остаток с аминогруппой в N6-положении аденина. Однако в отличие от уже известных антицитокининов-оснований полученное соединение не является истинным цитокининовым антагонистом.

N6-(5-фенилпентан-1-ил)аденин был получен с использованием метода региоселективного алкилирования N6-ацетил-2′,3′,5′-три-O-ацетиладенозина (1) в условиях реакции Мицунобу с последующим деблокированием в основных условиях с получением нуклеозидного производного N6-(5-фенилпентан-1-ил)аденозина (2), который далее подвергали кислотному гидролизу N-гликозидной связи с получением целевого N6-(5-фенилпентан-1-ил)аденина (3) (рис. 1). Структура полученного соединения была подтверждена данными ЯМР-спектрометрии и масс-спектрометрии высокого разрешения (HRMS).

 

Рис. 1. Синтез N6-(5-фенилпентан‑1-ил)аденина. Реагенты и условия: i. R-OH, Ph3P, DIAD, THF, 20 °C, 48 ч; ii. 5М PrNH2/MeOH, 20 °C, 24 ч; iii. HCl, 100 °C, 3 ч.

 

Цитокининовая и антицитокининовая активность полученного N6-(5-фенилпентан-1-ил)аденина 3 была исследована в тест-системе на основе проростков Arabidopsis thaliana. Тестирование проводили с использованием двойных инсерционных мутантов по рецепторам цитокининов, у которых в каждом мутантном клоне активен только один из трех рецепторов (AHK2, AHK3 или CRE1/AHK4). Все используемые растения трансформированы геном GUS, который поставлен под контроль промотора гена первичного ответа на цитокинины ARR5.

Цитокининовую активность соединения 3 определяли в физиологической концентрации 10–6 М по уровню GUS-активности, отражающей интенсивность экспрессии конструкции Parr5: GUS [13], и рассчитывали в процентах от активности природного цитокинина БА в той же концентрации. Из всех полученных значений предварительно вычитали уровень GUS-активности, индуцированной эндогенными цитокининами. В результате было показано, что данное соединение не проявляет выраженной фитогормональной активности ни для одного из рецепторов цитокининов арабидопсиса.

Для проверки наличия и силы антицитокининовой активности испытывали способность соединения 3 подавлять физиологическое действие БА. При проведении биотеста на проростках мутантного арабидопсиса, экспрессирующих единственный рецептор CRE1/AHK4, было показано, что 3 достоверно ингибирует действие БА при их совместном добавлении к проросткам. При этом антицитокининовый эффект 3 зависит от его соотношения с цитокинином. При концентрации, превышающей концентрацию БА в 500 раз, N6-(5-фенилпентан-1-ил)аденин подавляет активацию рецептора CRE1/AHK4 цитокинином на ∼92 %, тогда как при более низких соотношениях эффект выражен слабее или отсутствует (рис. 2). На проростках, экспрессирующих единственный рецептор AHK2, антицитокининовый эффект 3 был зафиксирован при разнице концентраций в 500 раз и составил менее 30 %. При разнице концентраций в 100 раз и менее подавление действия БА для рецептора АНК2 не наблюдается. В отношении рецептора AHK3 N6-(5-фенилпентан-1-ил)аденин не проявляет антицитокининового эффекта.

 

Рис. 2. Действие различных концентраций соединения 3 на интенсивность экспрессии конструкции Parr5: GUS, активируемой БА (0.1 µМ), при взаимо- действии с рецептором CRE1/AHK4. Контроль – действие БА 0.1 µМ на тот же рецептор.

 

Способность N6-(5-фенилпентан-1-ил)аденина 3 непосредственно взаимодействовать с лиганд- связывающими сайтами цитокининовых рецепторов арабидопсиса было проверено радиолигандным методом с использованием растительных мембран из транзиентно трансформированных растений Nicotiana benthamiana [14]. Было показано, что исследуемое соединение не обладает сколько-нибудь значимой афинностью к сайтам связывания цитокининов указанных белков и, соответственно, не может считаться истинным цитокининовым антагонистом.

Мы проверили действие N6-(5-фенилпентан-1-ил)аденина 3 на корнеобразование растений арабидопсиса Colambia-0 в условиях in vitro. Растения были введены в стерильную культуру на стадии семян и проращивались в воде до возраста 4 дней. После этого они были перемещены на вертикальные чашки Петри с агаризованной средой MS (½ по макросолям). Добавление в среду соединения 3 в концентрации 10 µМ достоверно приводило (на 5-й день проращивания) к увеличению средней длины главных корней на 9 % по сравнению со средой без добавок.

Таким образом, N6-(5-фенилпентан-1-ил)аденин является, по всей видимости, антицитокинином, специфично взаимодействующим пока неизвестным способом с рецептором CRE1/AHK4; это взаимодействие напоминает аллостерическую регуляцию активности ферментов. В перспективе, обнаруженное соединение может быть использовано в качестве регулятора роста растений в сельском хозяйстве.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 23-24-00527. Выражаем благодарность Министерству науки и высшего образования Российской Федерации (темы № 0103-2019-0004 и № 122042700043-9).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Работа не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы не имеют конфликта интересов.

×

Об авторах

А. А. Зенченко

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской Академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: kolomatchenkoa@yandex.ru
Россия, Москва

Е. М. Савельева

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии наук

Email: kolomatchenkoa@yandex.ru
Россия, Москва

М. С. Дреничев

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской Академии наук

Email: kolomatchenkoa@yandex.ru
Россия, Москва

Г. А. Романов

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии наук

Email: kolomatchenkoa@yandex.ru
Россия, Москва

В. Е. Ословский

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской Академии наук

Email: kolomatchenkoa@yandex.ru
Россия, Москва

Список литературы

  1. Spíchal L. Cytokinins – recent news and views of evolutionally old molecules // Funct. Plant Biol. 2012. Vol. 39. P. 267–84.
  2. Werner T., Schmülling T. Cytokinin action in plant development // Curr. Opin. Plant Biol. 2009. Vol. 12. P. 527–538.
  3. Gruhn N., Heyl A. Updates on the model and the evolution of cytokinin signaling // Curr. Opin. Plant Biol. 2013. Vol. 16. P. 569–574.
  4. Kieber J. J., Schaller G. E. Cytokinins // Arabidopsis Book, 2014. Vol. 12. P. e0168.
  5. Schaller G. E., Bishopp A., Kieber J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development // Plant Cell. 2015. Vol. 27. P. 44.
  6. Higuchi M., Pischke M. S., Mähönen A. P., et al. In planta functions of the Arabidopsis cytokinin receptor family // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101. P. 8821–8826.
  7. Riefler M., Novak O., Strnad M., et al. Arabidopsis cytokinin receptor mutants reveal functions in shoot growth, leaf senescence, seed size, germination, root development, and cytokinin metabolism // Plant Cell. 2006. Vol. 18. P. 40.
  8. Spíchal L., Werner T., Popa I., et al. The purine derivative PI-55 blocks cytokinin action via receptor inhibition // FEBS J. 2009. Vol. 276. P. 244–53.
  9. Nisler J., Zatloukal M., Popa I., et al. Cytokinin receptor antagonists derived from 6-benzylaminopurine // Phytochem. 2010. Vol. 71 (7). P. 823–30.
  10. Arata Y., Nagasawa-Iida A., Uneme H., et al. The phenylquinazoline compound S-4893 is a non-competitive cytokinin antagonist that targets Arabidopsis cytokinin receptor CRE1 and promotes root growth in Arabidopsis and rice // Plant Cell Physiol. 2010. Vol. 51 (12). P. 2047–2059.
  11. Krivosheev D. M., Kolyachkina S. V., Mikhailov S. N., et al. N6(Benzyloxymethyl)adenosine is a novel anticytokinin, an antagonist of cytokinin receptor CRE1/AHK4 of Arabidopsis // Doklady Biochem.Biophys. 2012. Vol. 444. P. 178–181.
  12. Savelieva E. M., Zenchenko A. A., Drenichev M. S., et al. In planta, in vitro and in silico studies of chiral N6-benzyladenine derivatives: discovery of receptor-specific S-enantiomers with cytokinin or anticytokinin activities // Int. J. Mol. Sci. 2022. Vol. 23 (19). P. 11334.
  13. Zvereva S. D., Romanov G. A. Reporter genes for plant genetic engineering: characteristics and detection // Russ. J. Plant Physiol. 2000. Vol. 47. P. 424–432.
  14. Savelieva E. M., Lomin S. N., Romanov G. A. A modified method for quantification of cytokinin-receptor binding using isolated plant microsomes enriched with cognate transmembrane receptors // Russ. J. Plant Physiol. 2022. Vol. 69. P. 6.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Синтез N6-(5-фенилпентан‑1-ил)аденина. Реагенты и условия: i. R-OH, Ph3P, DIAD, THF, 20 °C, 48 ч; ii. 5М PrNH2/MeOH, 20 °C, 24 ч; iii. HCl, 100 °C, 3 ч.

Скачать (175KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Действие различных концентраций соеди- нения 3 на интенсивность экспрессии конструкции Parr5: GUS, активируемой БА (0.1 µМ), при взаимо- действии с рецептором CRE1/AHK4. Контроль – действие БА 0.1 µМ на тот же рецептор.

Скачать (126KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».