Formation of Interspecies Biofilms of Saccharomyces cerevisiae Yeast and Streptococcus thermophilus Bacteria Utilizing Co-flocculation

Sergei V. Redkozubov; Редкозубов Сергей Владимирович; Aleksandr A. Churyumov; Чурюмов Александр Алексеевич; Valeria  I. Ivashova; Ивашова  Валерия Игоревна; Vita K. Lagunova; Лагунова  Вита Константиновна; Polina  S. Eremenko; Ерёменко  Полина Сергеевна; Elizaveta  A. Egoshina; Егошина  Елизавета  Алексеевна

doi:10.15507/3034-6231.001.202504.376-382

Formation of Interspecies Biofilms of Saccharomyces cerevisiae Yeast and Streptococcus thermophilus Bacteria Utilizing Co-flocculation

Authors: Redkozubov S.V.¹, Churyumov A.A.¹, Ivashova V.I.¹, Lagunova V.K.¹, Eremenko P.S.¹, Egoshina E.A.¹
Affiliations:
1. Volgograd State Medical University
Issue: Vol 1, No 4 (2025)
Pages: 376-382
Section: Biotechnologies
Submitted: 24.10.2025
Accepted: 08.12.2025
Published: 22.12.2025
URL: https://medbiosci.ru/MedBiotech/article/view/346195
DOI: https://doi.org/10.15507/3034-6231.001.202504.376-382
EDN: https://elibrary.ru/xmanru
ID: 346195

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. Dental caries is one of the most prevalent dental diseases. The primary cause of this pathology is a disruption in the species composition of the oral microbiota. The main causative agent of caries is the bacterium Streptococcus mutans, which begins to dominate the pellicle of the teeth among representatives of its genus, secreting lactic acid that destroys the integrity of the enamel. The attachment of pathogenic microorganisms to dental plaque occurs, as with representatives of the normal flora, through proteins – lectins. This creates a prospect for introducing non-pathogenic, non-acid-producing microorganisms into the oral microbiome by artificially incorporating them into the pellicular microflora.

The aim of this research is to develop a method for incorporating non-acid-producing microorganisms into the oral microbiome, based on the co-flocculation of yeasts and streptococci.

Materials and methods. The yeast strains Saccharomyces cerevisiae I-224 and Saccharomyces boulardii were selected as non-acid-producing microorganisms. Streptococcus thermophilus var. lactis was used as a producer of the extracellular exp polysaccharide matrix for the common biofilm. Yeast biomass was cultivated in sterile grape must, while streptococcal biomass was grown in liquid YPD medium at 26°C for five days. Following separate cultivation of the lactic streptococcus and the wine yeasts, the cultures were decalcified via centrifugation at 4,000 rpm and treatment of the sediment with a 0.3 mol/l potassium oxalate solution. The precipitated microbial biomass was combined and subjected to flocculation by adding a 1.0% calcium chloride solution. The efficiency of co-flocculate formation was determined microscopically at a 900× magnification after staining the specimen with methylene blue.

Results. The yeast Saccharomyces cerevisiae I-224 actively integrated into the common polysaccharide matrix, as evidenced by the clearing of the space around the co-flocculate and the absence of free streptococcal and yeast cells. The weakly flocculating probiotic yeast Saccharomyces boulardii scarcely formed unified flocculates with the bacteria.

Discussion and conclusion. An original method has been developed for the creation of interspecies conglomerates of bacteria and yeasts united by a common exopolysaccharide matrix. This method opens the prospect of creating an oral probiotic that reduces the acid load on tooth enamel, as it allows for the partial replacement of acid-producing bacteria with agents of alcoholic fermentation.

Keywords

interspecies biofilms, Saccharomyces cerevisiae, Streptococcus thermophilus, lectins, exopolysaccharide

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В естественных условиях обитания микроорганизмы чаще встречаются в виде биопленок, чем в виде отдельных клеток. Биопленки могут покрывать абиотические поверхности, органы и ткани живых организмов. К факторам, позволяющим микроорганизмам образовывать биопленки, относятся в том числе и белки – лектины, входящие в состав клеточной стенки бактерий и грибов. В зависимости от вида микроорганизма лектиновый фактор межклеточного взаимодействия может иметь различные условия реактивности, в том числе требовать присутствия катионов кальция и/или остатков маннозы для эффективного межклеточного слипания [1]. Из литературных данных известны три группы генов лектиновой флокуляции: маннозо-зависимые Flo1 и NewFlo, а также нечувствительный к маннозе (MI) [2].

Известный механизм флокуляции сахаромицетных дрожжей представляет собой белково-углеводную модель. Флокулирующие дрожжевые клетки обладают одновременно углеводными α-маннановыми остатками на поверхности клеточной стенки, и белковыми зимолектинами (лектины дрожжей) – рецепторами α-маннановых остатков, также входящих в состав наружного манно-протеинового слоя клеточной стенки грибков. В литературе высказано предположение, что взаимодействие зимолектинов с маннановыми компонентами приводит к флокуляции в присутствии ионов кальция, необходимых для правильной конформации зимолектинов [5].

Условно-патогенные стрептококки ротовой полости способствуют развитию кариеса, а также являются возбудителями молочнокислого брожения. Видовой состав в условиях нормобиоты чаще представлен Streptococcus salivarius (подвидом которого является лактококк S. thermophilus), S. mitis, S. oralis [3]. S. mutans и S. sanguis обнаруживаются в большом количестве в ротовой полости в случае повреждения эмали зубов. Представители вида S. salivarius известны способностью синтезировать внеклеточные полисахариды, в том числе маннаны, при утилизации моно- и дисахаридов. Отметим, что внеклеточный экзополисахарид стрептококка, не ассоциированный с клеточной стенкой в виде капсулы, на 1/4 состоит из остатков маннозы, что позволяет ему участвовать в формировании межвидовой биопленки путем взаимодействия с зимолектинами в присутствии катионов кальция. Экзополисахариды способствуют прикреплению к зубной эмали других представителей микробиоты полости рта (явление ко-аггрегации) и благоприятствуют увеличению стабильности общего полимерного матрикса биопленки [4].

Таким образом, возникает возможность включения возбудителей спиртового брожения в состав биопленки ротовой полости вместе с непатогенными представителями оральной микробиоты, продуцирующими экзополисахаридный матрикс, при их совместной флокуляции, что будет способствовать снижению кислотной нагрузки на зубную эмаль.

Цель исследования – разработать метод ко-флокуляции дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae и бактерий рода Streptococcus thermophilus var. lactis в общем экзополисахаридном матриксе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для проведения эксперимента был взят штамм осадочных винных дрожжей из Коллекции микроорганизмов виноделия лаборатории микробиологии Всероссийского национального научно-исследовательского института виноградарства и виноделия «Магарач» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» вида Saccharomyces cerevisiae, каталожный номер I-224, образующий осадок в виде крупных флокул. Негативным контролем служили нефлокулирующие пробиотические дрожжи Saccharomyces boulardii из препарата «Энтеростим Форте» (Индия). В качестве продуцента экзополисахаридного матрикса применяли бактериальный штамм S. thermophilus, выделенный из коммерческой молочной закваски Danisco CHOOZIT TA 45 (Франция). Для наращивания биомассы дрожжи культивировали при температуре 26 °С в течение пяти суток на стерильном виноградном сусле столовых сортов (массовая концентрация сахаров – 180,0 г/л, pH – 3,5); бактерии культивировали при температуре 26 °С в течение пяти суток на среде YPD (г/л: глюкоза – 20,0, пептон – 20,0, дрожжевой экстракт – 10,0; рН – 6,0–7,0).

Ко-флокулят получали следующим способом: в стадию логарифмического роста биомассу микроорганизмов осаждали центрифугированием (4000 об/мин) в течение 2 мин, надосадочную жидкость сливали. Для разделения дрожжевых моновидовых флокул на отдельные клетки, активации клеточной стенки и экзополисахаридного матрикса перед дальнейшей межвидовой ко-флокуляцией полученные осадки монокультур ресуспензировали в стерильном растворе 0,3 моль/л оксалата калия. Встряхивание в пробирке производили до полного разрушения хлопьев, определяемого визуально. Ресуспензировали в стерильном растворе 0,9 % хлорида натрия. Полученный ресуспензат повторно центрифугировали, надосадочную жидкость удаляли. Осадок еще раз ресуспензировали в растворе 0,9 % хлорида натрия. По 1 мл полученной декальцифицированной взвеси дрожжей и бактерий помещали в общую пробирку, куда добавляли 2,0 мл 1,0 % стерильного раствора хлорида кальция. Полученную смесь активно встряхивали и оставляли на 30 мин для ко-флокуляции. Результаты учитывали микроскопически при увеличении × 900 с иммерсией после окраски 0,001 % раствором метиленового синего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На рисунке 1 видно, что окрашенные цепочки стрептококков и клетки дрожжей включены в общий полисахаридный матрикс биопленки. Жизнеспособные дрожжи и матрикс не окрашиваются метиленовым синим. Матрикс становится видимым благодаря тому, что он обильно инкрустирован многочисленными кристаллами оксалата кальция. Предполагается, что дрожжи удерживаются в матриксе за счет высокой флокулирующей активности поверхностных лектинов S. сerevisiae I-224 с экзополисахаридом S. thermophilus. Пространство, свободное от кристаллов оксалата кальция (в центре рисунка), не содержит стрептококков и дрожжевых клеток, что свидетельствует о прочности связывания всех компонентов биопленки.

Рис. 1. Межвидовой ко-флокулят Saccharomyces cerevisiae I-224 и Streptococcus thermophilus

Fig. 1. Interspecies co-flocculate of Saccharomyces cerevisiae I-224 and Streptococcus thermophilus

Источник: здесь и далее рисунки получены авторами в программе MicroCamera.

Source: herein and hereafter, the figures were obtained by the authors using the MicroCamera software.

Дрожжи с меньшей флокулирующей активностью, Saccharomyces boulardii, значительно хуже включаются в состав ко-флокулята (рис. 2). На изображении видно, что дрожжевые клетки взаимодействуют между собой, при этом практически не присоединяются к межвидовому ко-флокуляту со стрептококками.

Рис. 2. Отсутствие ко-флокуляции между Saccharomyces boulardii и Streptococcus thermophilus

Fig. 2. Absence of the co-flocculation between Saccharomyces boulardii and Streptococcus thermophilus

Полученные результаты открывают возможность создания орального пробиотика на основе ко-флокуляции лактококка и дрожжей, а также введения в микробиом ротовой полости клеток других микробионтов, клеточная стенка которых обладает достаточным сродством к лектиновой кальций-зависимой флокуляции. Поскольку основным фактором образования зубного налета является осаждение гликопротеинов слюны, которые формируют защитную пелликулу, возникает базис для соединения полисахаридного матрикса искусственно полученного ко-флокулята с уже имеющейся биопленкой на эмали зуба [5].

ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Зимолектины наружного манно-протеинового слоя клеточной стенки дрожжей способны прочно связывать клетки грибков друг с другом через остатки маннозы в присутствии катионов кальция. Аналогичный эффект наблюдается при связывании дрожжей с внеклеточным экзополисахаридным маннозосодержащим матриксом, продуцируемым молочным стрептококком. Метод декальцификации клеточной стенки дрожжей и экзополисахарида стрептококков анионами оксалата с последующей ко-флокуляцией в присутствии катионов кальция позволяет создать прочный межвидовой конгломерат дрожжей и полисахарид-продуцирующих стрептококков, имитирующий биопленку. Разработанный метод предполагается применить для изготовления препарата комплексного орального пробиотика, позволяющего вытеснить возбудителей кариеса из биопленки зубного налета и снизить кислотную нагрузку на эмаль зубов путем частичной замены возбудителей молочнокислого брожения на возбудителей спиртового брожения.

About the authors